זיהוי, כימות של הפלזמודיום falciparum ב מימית כדוריות דם אדומות על ידי הקלוש הכולל השתקפות ספקטרוסקופית אינפרא אדום וניתוח נתונים Multivariate

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול זיהוי, כימות של הפלזמודיום falciparum מימית אדום דם תאים נגועים באמצעות ספקטרומטר אינפרא-אדום השתקפות הכולל הקלוש של ניתוח נתונים רב משתנית.

תקציר

נדגים שיטה של כימות וזיהוי של טפילים של כדוריות דם אדומות מימית (RBCs) באמצעות benchtop פשוטה של ספקטרומטר הקלוש הכולל השתקפות פורייה להפוך אינפרא-אדום (ATR-FTIR) בשילוב עם ניתוח נתונים Multivariate ( MVDA). 3D 7 falciparum פ היו בתרבית כדי 10% parasitemia הטבעת הבמה טפילים, נהגה ספייק RBCs התורם טריים מבודד כדי ליצור לדילול סדרת בין 0-1%. 10 µL של כל מדגם הוצבו במרכז החלון יהלום ATR לרכוש את הספקטרום. הנתונים לדוגמה התייחסו כדי לשפר את האות לרעש יחס, כדי להסיר את התרומה של מים, אז הנגזרת השנייה הוחל לפתרון תכונות ספקטרליות. הנתונים נותחו לאחר מכן באמצעות שני סוגים של MVDA: הראשון העיקרי רכיב ניתוח (PCA) כדי לקבוע כל ליניאריים ולאחר מכן הריבועים הפחותים חלקית רגרסיה (PLS-R) כדי לבנות את הדגם כמת.

מבוא

מלריה היא בין המחלות ההרסניות ביותר של זמננו; ממחצית האוכלוסייה בסיכון באזורים אנדמיים וחיים זה פרופורציה מוטלת המסכן^1,2,3,4. חלק גדול של הנושא הוא נשאים ללא תסמינים בתחילת שלב חולים לשמש מאגרים עבור יתושים וקטורים⁵, גורם קוצים של זיהום בעונות רטובות ומאפשר שזה נמשכות בקהילות. מלריה נגרמת על ידי טפילים הפלזמודיום חמש, הקטלני ביותר מהם הוא falciparum פ הגורמת הצורה החמורה ביותר של המחלה².

נכון לעכשיו, טכניקות לאבחון של מלריה הם פחות ממושלם. מיקרוסקופ אופטי, תקן הזהב הנוכחי, יכול לזהות רק 62-88 טפילים/µL בהתאם שיטת⁶. יתר על כן, עקב intensiveness מיומנות גבוהה הנדרשים, המוצאות מיקרוסקופ אזורים רבים > 50% מהמקרים, במיוחד אלה עם parasitaemia נמוך רמות², אשר ניתן ישירות לייחס חוסר משאבים באזור ותוצאות ניצול לרעה של תרופות נגד מלריה. 2 ראשי אבחון לשיטות אחרות הן בדיקות אבחון מהיר (RDTs), אשר מנצלים נוגדנים עבור זיהוי וכן מבחני פולימראז תגובת שרשרת (PCR), אשר מפלים ולכמת טפילים מ- DNA. כיום, RDTs הם רק מסוגלים לזהות falciparum פ ו פ vivax לפחות 100 טפילים µL הדם וכתוצאה מכך צורות נדירות יותר של המחלה להיות מטופל. ^{7 , 8} לעומת זאת, מבחני ה-PCR להפלות ולכמת מינים שונים של הפלזמודיום -רגישות של 0.0004-5 טפילים/µL של דם. עם זאת, שזה דורש ריאגנטים יקר, ציוד, מיומנות טכנית, ולכן אינה מתאימה עבור היישום בשדה.

טכניקה מאוד רגיש, אמין ובמחיר חיוני כדי לשפר את האבחון פעמים, ובכך שיפור תוצאות המטופל ואני עושה מחלות חיסול אפשרי. הקלוש הכולל השתקפות (ATR-FTIR) ספקטרוסקופיית פורייה מציעה פתרון אפשרי לבעיה זו. עבודה קודמים הראו כי ניתן היה לזהות ולכמת falciparum פ ב מתנול קבוע סרטים דם בהשגת זיהוי גבולות < טפיל 1/µL של דם (< 0.0002% parasitemia)⁹, אשר דומה לדקל שיטות PCR. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שניתן לזהות, לכמת טפילים בדגימות מימית ולהסיר ובכך לשלב קיבוע. עם זאת, גורמים כמו אדי מים, רעש ספקטרלי וטיפול נתונים צריך להילקח בחשבון לקבלת תוצאות אופטימליות¹⁰.

פרוטוקול זה נועד להראות משתמשים חדשים כיצד לרכוש ATR-FTIR ספקטרה ולהכין מודל רגרסיה איתור falciparum פ מ דגימות מימית של תאי דם אדומים (RBC)¹⁰.

פרוטוקול

נא להתייעץ עם המתאים חומר בטיחות נתונים גיליונות (MSDS) ומחפשים הכשרה מתאימה אבטחה ברמה 2 (BSL-2). כל השלבים culturing חייב להיעשות בארון BSL-2 באמצעות הטכניקה aseptic, כלומר יש סיכון של חשיפה לקרינה UV המזיקות של שלבי טיהור, המחט מקל פציעות, וחשיפה ביולוגית אפשרית זיהום אם התרבות טפיל מזין פציעות. יתר על כן, דם מניות של בנק הדם הוא רק מוקרן מסוימים מחלות ואת הפוטנציאל להפצת דם מחלות שמקורן הוא סיכון פוטנציאלי. מבקשים לסיוע רפואי מיידי להתרחשות הפגיעה.

1. הכנה ומדידה של 3D 7 הפלזמודיום falciparum טפיל דילול סדרה

הערה: הפלזמודיום sp. התרבות היא רגישה מאוד. השתמש ריאגנטים טריים/נתמלאה ולהאכיל הטפילים באופן קבוע על-ידי שינוי בתקשורת. להאכיל תרבויות מתחת 5% parasitemia כל יום השני; להאכיל תרבויות בין 6-10% parasitemia פעם או פעמיים ביום; ולהאכיל תרבויות בין 11 – 20% עד 4 פעמים ביום. טפילים מתחילים לרעוב לאבד את צורתם, להתחיל חוזה. במקרה כזה, להאכיל, לדלל באופן מיידי על-ידי שינוי בתקשורת והוספת מניות RBCs. לאסוף הדם של התורם צינורות איסוף דם המכיל הפארין קרישה ו מידה בתוך ה 6 הראשון.

1. תרבות סך של 30 מ של 3D 7 זן הפלזמודיום falciparum טפילים לפי הפרוטוקול הסטנדרטי עד parasitemia מגיע טבעות 10%.
2. סינכרון של טפילים
   1. h 11 לאחר shizogeny לתוך מחזור החיים של הטפיל, resuspend את התרבות ואת העברת לתוך צינור חרוטי 50 מ ל באמצעות פיפטה אוטומטיות.
   2. Centrifuge התרבות 300 – 400 x g ותנאי מעבדה סטנדרטיים (25° C ו- 100 kPa) במשך 5 דקות.
   3. הסר את תגובת שיקוע ממלאים אותו עם פיפטה או באמצעות פיפטה של פסטר המצורפת ואקום מבלי להפריע בגדר. להשליך פסולת מדיה לתוך פתרון 10% מלבין.
   4. לאט להוסיף 12-15 מ של 4% בסורביטול פתרון בגדר באמצעות פיפטה אוטומטיות ומערבבים את התרבות על ידי מיצוי, היפוך הצינור עד התרבות היא הומוגנית.
   5. דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
   6. Centrifuge התרבות 300 – 400 x g ותנאי מעבדה סטנדרטיים עבור 5 דקות.
   7. הסר את תגובת שיקוע כפי שמתואר בשלב 1.2.3.
   8. להוסיף 10 – 15 מ ל תמיסת 0.9% בגדר ומערבבים את הפתרון על ידי מיצוי, היפוך הצינור עד התרבות היא הומוגנית.
   9. חזור על השלבים של 1.2.6–1.2.8 עוד פעמיים, כדי לשטוף את כל שרידי בסורביטול.
3. הכנה של הסדרה דילול parasitemia
   1. רחץ מניות RBCs כמו צעדים 1.2.6–1.2.9.
   2. Centrifuge התרבות-תנאי מעבדה סטנדרטיים, מניות RBCs ב 300-400 g x עבור 5 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע כמו שלב 1.2.3.
   3. תווית צינורות microcentrifuge 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0.250%, 0.750% ו- 1.000%, וכן להוסיף 0 µL, 1 µL, 2.5 µL, 7.5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL, 100 µL של תרבות בהתאמה באמצעות פיפטה µL של 0.2-20.
   4. להוסיף 100 µL, 99 µL, 97.5 µL, 92.5 µL, 80 µL, 75 µL, 25 ו- 0 µL של מניות RBCs צינורות שכותרתה 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0.250%, 0.750% של 1.000%, בהתאמה.
   5. צנטריפוגה הדם של התורם טריים אסף צינורות קרישה-1,200 x g ותנאי מעבדה סטנדרטיים עבור 10 דקות.
   6. הסר את הפלזמה על ידי ממלאים אותו עם פיפטה ומחיקת כפי שמתואר בשלב 1.2.3.
   7. מוסיפים µL 900 של RBCs מבודד לתוך כל שפופרת microcentrifuge ומערבבים היטב על-ידי היפוך 10 x.
4. רכישת ספקטרלי
   1. באמצעות תוכנית רכישת ספקטרלי הנלווה, לחץ על "כלי הגדרת", קבע את הפרמטרים אוסף הנתונים הבאים: 128 סריקות של רקע; סריקות 32 עבור מדגם; והרזולוציה 8/ס מ על פני הטווח המרבי מדגם של המכשיר.
   2. הגדר את הטמפרטורה של ספקטרומטר ATR-FTIR לפי המלצות של יצרן או למשך הלילה.
   3. לנקות את הקריסטל על ידי בעדינות לניתוח תנועה מעגלית באמצעות מוך מגבונים חינם ולחה הנדסה גנטית. ואז ביסודיות יבש באמצעות אחר מוך חינם לנגב.
   4. לקחת מידה רקע באוויר על ידי לחיצה על "רקע מדידות". כל 20 דקות, לנקות את הקריסטל כמו שלב 1.4.3 וחזור על המדידה הזו.
   5. פתח את התצוגה בשידור חי על ידי לחיצה על "תצוגה מקדימה". התבונן תוכנית בסיסית, אופקי שטוח המציין הקריסטל הוא נקי.
   6. פיפטה 10 µL יונים המים ישירות באמצע של הקריסטל על ולחץ על "מדד Sample". חזור על המדידה הזו מים אחרי כל הדוגמה החמישי.
   7. יבש את הקריסטל באמצעות מחיקה ללא מוך ותנועה מעגלית עדינה.
   8. פיפטה µL 10 מדגם ולחץ על "מדד Sample".
   9. לנקות את הקריסטל בין דוגמאות כמו שלב 1.4.3.
   10. חזור על עד 3 משכפל נרכשים, מקפיד אקראי סדר הדגימות והן את משכפל.

2. ניתוח נתונים רב משתנית (MVDA)

הערה: הנתונים הטיפול חייב להתבצע מעל את כל ערכת הנתונים כדי למנוע רעש ותוספת של פסגות ממוצא הלא-ביולוגיים. לעומת זאת, לנתח מעל האזורים הרלוונטיים ביולוגית: 2980-2800/ס"מ ו- 1750-850/ס"מ.

1. טיפול נתונים
   הערה: שתי תוכנות, למשל, Matlab (המכונה מעתה ואילך תוכנה 1) ו- X Unscrambler (המכונה מעתה ואילך התוכנה 2) משמשים כדוגמאות עבור MVDA. תוכנה 1 יש את היכולת של ביצוע MVDA בלי התוספת של ממשק משתמש גרפי (GUI). עם זאת, מומלץ לרכוש GUI (טבלה של חומרים). ההוראות הבאות כאשר בהתייחס לתוכנה 1 יניחו את זה בשיתוף עם הכלים GUI זמינים מסחרית, חובר התסריט טיפול נתונים לדוגמה.
   1. פתח את תוכנת ניתוח נתונים רב משתנית מתאים, לחץ על "ייבוא נתונים" ובחר את סוג הקובץ לניתוח.
      1. תוכנה 1, קלט "ניתוח" לתוך חלון הפקודה לפתיחת GUI. הימני, לחץ בתיבה X כדי לאתר "ייבוא נתונים".
      2. תוכנה 2, לחץ על הכרטיסיה 'קובץ' כדי למצוא "ייבוא".
   2. לייבא ספקטרה לדוגמה, מים, בסיסית כמו ערכות נתונים לתוך סביבת העבודה על-ידי בחירת הספקטרום של כל קבוצה בנפרד ולחיצה על 'פתח' ולתת כל קבוצה שם קצר, למשל, "וואט" עבור ערכת נתונים של מים ספקטרה.
   3. בחר טבלה חדשה/מטריצה על ידי לחיצה על "חדשות מטריקס וקטורי" וצור וקטור n × 1, כאשר n הוא מספר דוגמאות. קלט את parasitemia של כל מדגם ולתת המבוססת על השם 'Parasitemia'.
      1. תוכנה 1, לחץ על "משתנה חדש" בחלון הפקודה.
      2. תוכנה 2, לחץ על הסמל "מטריקס חדש".
   4. להתוות נתונים על-ידי לחיצה על "להתוות נתונים הסמל". לבחון את הספקטרום לאפקטים אדי מים על-ידי לחיצה על "זום", התקרבות 1800-1400/ס"מ; ובמופתים נצפתה כמו פסגות קצר, חד, צרה לאורך המדרונות של אמיד אמיד ואני להקות II.
   5. במקרים של אדי מים אקסטרים, לפתוח את הכרטיסיה נתונים עריכה/טרום-process ובחר "Smoothing". להפחית את רעש ו/או תרומות אדי מים חזקה על-ידי החלקת ספקטרום מדגם ומים באמצעות עד 25 נקודות של החלקה או להשתמש בשיטה תיקון אדי מים.
   6. בסיסית שאינם אופקיים הנכון באמצעות אלגוריתם התיקון בסיסית ובמידת הצורך, תחת הכרטיסיה נתונים עריכה/טרום-process באותו שלב 2.1.4.
   7. ממוצע ספקטרה מים ו להעתיק את השורות מטריצה m n × המקביל לערכת מדגם לצמצם את זה ל-70% בעוצמה על ידי הכפלת זה 0.7.
      1. תוכנה 1, לעשות זאת בחלון הפקודה על-ידי הזנת בתסריט הבא "AverageWater=mean(WaterDataset)". לאחר מכן העתק-הדבק השורות כדי להתאים את ערכת הנתונים לדוגמה. כדי להפחית את העוצמה, קלט "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".
   8. להחסיר ספקטרה המים הממוצעת של כל ספקטרום מדגם.
      1. תוכנה 1, לעשות זאת בחלון הפקודה על-ידי הזנת ה-script הבא "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".
   9. פתיחת הכרטיסיה נתונים עריכה/טרום-process כדי להחיל פונקציה נגזרת שנייה, ו ואז לנרמל את הנתונים על-ידי בחירה בפונקציה מהמתכנתים נורמלי יחיד (SNV), כלומר מרכז הנתונים.
      1. תוכנה 1, לעשות זאת בבת אחת. תחילה בחר "נגזרת" קלט 25 נקודות החלקה, פולינומיאלי מסדר 3 והסדר נגזרות על הדגימה ערכת באמצעות 25 נקודות של החלקה, פונקציה Savitzky-Golay. לאחר מכן בחר "SNV" ו- "מרכז מתכוון". לחץ על "בסדר/החל".
   10. פתיחת הכרטיסיה נתונים עריכה/טרום-process, במשתני"טורים", בחר 2,980 – 2800/cm ו- 1,750 – 850/ס"מ על-ידי מוודא שרק תיבות שלהם הם תיקתק.
2. ניתוח נתונים
   1. ניתוח גורמים של המנהל (PCA)
      1. לחץ על "ניתוח | הפירוק", PCA בחר.
         1. תוכנה 1, לחץ על "לבנות מודל".
         2. תוכנה 2, קלט את השיטות PCA. קלט מספר אופטימלי של הרכיבים העיקריים (אישיים) - בעבודה זו, 7 - ועד למקסימום של 100 איטראציות, בחר קרוס-אימות עבור שיטת אימות. לחץ על "הפעל".
      2. שים לב למגבלת ביטחון 95%, הטבעת מקווקו, על העלילה ציונים בין PC1 PC2.
      3. סמן ספקטרום מדגם עם ציונים המתרחשות מחוץ למגבלת כמו ליניאריים פוטנציאליים באמצעות "ספקטרה הכלי בחירת".
      4. אם מסומן ספקטרום גבוה Hotellings T² וערכים תמלוגים Q גבוה אל תכלול אותם ניתוח נוסף.
   2. שיטת הריבועים הפחותים חלקית רגרסיה (PLS-R)
      1. לחץ על "ניתוח | רגרסיה", בחר"PLS-R".
         1. תוכנה 1, מיד לחץ על בלוק Y ובחר וקטור "Parasitemia | לבנות מודל".
         2. תוכנה 2, קלט את השיטות PLS-R. בחר את הווקטור "Parasitemia" ההפניה"Y", את ערכת הנתונים לדוגמה כמו "X ערכת נתונים" ובדיקת בחר קרוס-כשיטת אימות. לחץ על "הפעל".
      2. לנתח את מודל רגרסיה. R² ערכים מעל 0.80 ושגיאה שורש ממוצע הריבועים של צלב-אימות ערכי (RMSECV) נמצאים במרחק של פחות מ- 0.1% parasitemia הם מודלים מקובלים.
      3. לנתח את הווקטור רגרסיה ולזהות הלהקות ביולוגי.

תוצאות

הריבועים הפחותים חלקית (PLS-R) מגרש ולהראות שלה רגרסיה המשויך וקטור, איור 1a ו 1b בהתאמה, כי האות תוזנה נבדלים מספיק RBCs כי הם יכולים לשמש כדי ליצור מודל רגרסיה ליניארית לשמש חיזוי של טפילים בערכות נתונים בעתיד.

מודל PLS-R חזקים ליניארי נוצר עם ערך R בריבוע של 0.87, שורש ממוצע בריבוע שגיאת אימות צולב (RMSECV) של 0.13% parasitemia, איור 1a. רמות הולכות ...

דיון

מודל PLS-R היא שיטה רב משתנית תחת פיקוח המוצאת הקשר הליניארי, Y = bX + E, בין המשתנים חזוי X (כאן, את ספיגת-כל מספר גל) ו- Y משתנה רציף (כאן, רמת parasitemia). בקיצור, המודל משלב את המשתנים ב- X כדי ליצור קבוצה חדשה של המשתנים החבויים (אותו) כי ללכוד את השונות ב- X בקורלציה עם Y, ולאחר מחשבת את וקטור רגרסיה (b) זה מוכפל תוצאות ספקטרום חדש ההערכה של ערך y. כוחו של המודל ניתן לקחת מלוגנו שני ערכים: הערך² R ואת הערך שורש ממוצע הריבועים שגיאה של לעבור אימות (RMSECV). לשעבר מתאר על ליניאריות של המודל ובכך החוסן (קר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דם תורם	-		חייב להיאסף על ידי רופא מיומן
דם מלאי	הצלב האדום האוסטרלי '	-
3D7 פלסמודיום פלציפרום	מכון ברנט		זן מעבדה שווה ערך
לסוג פרא RPMI-1640 מדיה עם L-hepes ללא נתרן ביקרבונט	סיגמא אולדריץ'	R6504
אלבומקס (Gibco)	Thermofisher	E003000PJ	Aliquot לתוך צינורות בז של 50 מ"ל ולאחסן במקפיא
נתרן ביקרבונט	Sigma Aldrich	S5761
Giemsa Stain	Sigma Aldrich	48900
סורביטול	סיגמא אולדריץ'	S1876	יש לסנן לפני השימוש בתרבית
צינורות איסוף דם (Vacutainers)	Becton, Dickonson and Company	367671
שמן טבילה	Thermofisher	M3004
50 מ"ל כלי תרבות	פלקון	353025
25 מ"ל קצות פיפטה	פלקון	357515
10 מ"ל קצות פיפטה	פלקון	357530
שקופיות מיקרוסקופ	סיגמא אולדריץ'	S8902
צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל	סיגמא אולדריץ'	T2318
בקר פיפטה אוטומטי	Integra-biosciences	155 015
Sorvall Legend X1R צנטריפוגה	Thermofisher	75004260
Forma™ 310 חממות CO2 חום ישיר	Thermofisher	310TS
Nikon Eclipse E-100 מיקרוסקופ משקפת	Nikon Instruments	E100_2CE-MRTK-1	בעת הרכישה ודא שעדשת 100x היא שמן עדשת טבילה
Bruker Alpha Ft-IR ספקטרומטר עם ATR Quick Snap Attachment	Bruker	9308-3700	הקפד לבקש קובץ מצורף "Eco-ATR" בעת רכישת
Matlab	Mathworks Inc		תוכנת ניתוח נתונים רב-משתנית
Unscrambler X	CAMO		Multivariate תוכנת ניתוח נתונים
PLS-Toolbox	Mathworks, Inc.		ממשק משתמש גרפי עבור Matlab