כאן, אנו מציגים פרוטוקול זיהוי, כימות של הפלזמודיום falciparum מימית אדום דם תאים נגועים באמצעות ספקטרומטר אינפרא-אדום השתקפות הכולל הקלוש של ניתוח נתונים רב משתנית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי, כימות של הפלזמודיום falciparum ב מימית כדוריות דם אדומות על ידי הקלוש הכולל השתקפות ספקטרוסקופית אינפרא אדום וניתוח נתונים Multivariate
במאמר זה
סיכום
תקציר
נדגים שיטה של כימות וזיהוי של טפילים של כדוריות דם אדומות מימית (RBCs) באמצעות benchtop פשוטה של ספקטרומטר הקלוש הכולל השתקפות פורייה להפוך אינפרא-אדום (ATR-FTIR) בשילוב עם ניתוח נתונים Multivariate ( MVDA). 3D 7 falciparum פ היו בתרבית כדי 10% parasitemia הטבעת הבמה טפילים, נהגה ספייק RBCs התורם טריים מבודד כדי ליצור לדילול סדרת בין 0-1%. 10 µL של כל מדגם הוצבו במרכז החלון יהלום ATR לרכוש את הספקטרום. הנתונים לדוגמה התייחסו כדי לשפר את האות לרעש יחס, כדי להסיר את התרומה של מים, אז הנגזרת השנייה הוחל לפתרון תכונות ספקטרליות. הנתונים נותחו לאחר מכן באמצעות שני סוגים של MVDA: הראשון העיקרי רכיב ניתוח (PCA) כדי לקבוע כל ליניאריים ולאחר מכן הריבועים הפחותים חלקית רגרסיה (PLS-R) כדי לבנות את הדגם כמת.
מבוא
מלריה היא בין המחלות ההרסניות ביותר של זמננו; ממחצית האוכלוסייה בסיכון באזורים אנדמיים וחיים זה פרופורציה מוטלת המסכן1,2,3,4. חלק גדול של הנושא הוא נשאים ללא תסמינים בתחילת שלב חולים לשמש מאגרים עבור יתושים וקטורים5, גורם קוצים של זיהום בעונות רטובות ומאפשר שזה נמשכות בקהילות. מלריה נגרמת על ידי טפילים הפלזמודיום חמש, הקטלני ביותר מהם הוא falciparum פ הגורמת הצורה החמורה ביותר של המחלה2.
נכון לעכשיו, טכניקות לאבחון של מלריה הם פחות ממושלם. מיקרוסקופ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
נא להתייעץ עם המתאים חומר בטיחות נתונים גיליונות (MSDS) ומחפשים הכשרה מתאימה אבטחה ברמה 2 (BSL-2). כל השלבים culturing חייב להיעשות בארון BSL-2 באמצעות הטכניקה aseptic, כלומר יש סיכון של חשיפה לקרינה UV המזיקות של שלבי טיהור, המחט מקל פציעות, וחשיפה ביולוגית אפשרית זיהום אם התרבות טפיל מזין פציעות. יתר על כן, דם מניות של בנק הדם הוא רק מוקרן מסוימים מחלות ואת הפוטנציאל להפצת דם מחלות שמקורן הוא סיכון פוטנציאלי. מבקשים לסיוע רפואי מיידי להתרחשות הפגיעה.
1. הכנה ומדידה של 3D 7 הפלזמודיום falciparum טפיל דילול סדרה
הערה: הפלזמודיום sp. התרבות היא רגישה מאוד. השתמש ריאגנטים טריים/נתמלאה ולהאכיל הטפילי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הריבועים הפחותים חלקית (PLS-R) מגרש ולהראות שלה רגרסיה המשויך וקטור, איור 1a ו 1b בהתאמה, כי האות תוזנה נבדלים מספיק RBCs כי הם יכולים לשמש כדי ליצור מודל רגרסיה ליניארית לשמש חיזוי של טפילים בערכות נתונים בעתיד.
מודל PLS-R חזקים ליניארי נוצר עם ערך R בריבוע של 0.87, שורש ממוצע בריבוע שגיאת אימות צולב (RMSECV) של 0.13% parasitemia, איור 1a. רמות הולכות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מודל PLS-R היא שיטה רב משתנית תחת פיקוח המוצאת הקשר הליניארי, Y = bX + E, בין המשתנים חזוי X (כאן, את ספיגת-כל מספר גל) ו- Y משתנה רציף (כאן, רמת parasitemia). בקיצור, המודל משלב את המשתנים ב- X כדי ליצור קבוצה חדשה של המשתנים החבויים (אותו) כי ללכוד את השונות ב- X בקורלציה עם Y, ולאחר מחשבת את וקטור רגרסיה (b) זה מוכפל תוצאות ספקטרום חדש ההערכה של ערך y. כוחו של המודל ניתן לקחת מלוגנו שני ערכים: הערך2 R ואת הערך שורש ממוצע הריבועים שגיאה של לעבור אימות (RMSECV). לשעבר מתאר על ליניאריות של המודל ובכך החוסן (קר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
מימון ליוצרים סופק על ידי המועצה מחקר אוסטרלי (העתיד מלגת FT120100926 כדי BRW), הלאומי לבריאות, רפואי מחקר המועצה של אוסטרליה (תוכנית גרנט, בכיר מחקר לאגודה כדי JGB; הקריירה המוקדמת מלגות JSR; תשתית למחקר מוסדות תמיכה גרנט ערכת למכון ברנט), התשתית המבצעית של הממשלה ויקטוריאני המדינה לתמוך גרנט למכון ברנט. אנו להכיר מר פינלי שאנקס לקבלת תמיכה אינסטרומנטלית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| דם תורם | - | חייב להיאסף על ידי רופא מיומן | |
| דם מלאי | הצלב האדום האוסטרלי ' | - | |
| 3D7 פלסמודיום פלציפרום | מכון ברנט | זן מעבדה שווה ערך | |
| לסוג פרא RPMI-1640 מדיה עם L-hepes ללא נתרן ביקרבונט | סיגמא אולדריץ' | R6504 | |
| אלבומקס (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot לתוך צינורות בז של 50 מ"ל ולאחסן במקפיא |
| נתרן ביקרבונט | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| סורביטול | סיגמא אולדריץ' | S1876 | יש לסנן לפני השימוש בתרבית |
| צינורות איסוף דם (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| שמן טבילה | Thermofisher | M3004 | |
| 50 מ"ל כלי תרבות | פלקון | 353025 | |
| 25 מ"ל קצות פיפטה | פלקון | 357515 | |
| 10 מ"ל קצות פיפטה | פלקון | 357530 | |
| שקופיות מיקרוסקופ | סיגמא אולדריץ' | S8902 | |
| צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל | סיגמא אולדריץ' | T2318 | |
| בקר פיפטה אוטומטי | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R צנטריפוגה | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 חממות CO2 חום ישיר | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 מיקרוסקופ משקפת | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | בעת הרכישה ודא שעדשת 100x היא שמן עדשת טבילה |
| Bruker Alpha Ft-IR ספקטרומטר עם ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | הקפד לבקש קובץ מצורף "Eco-ATR" בעת רכישת |
| Matlab | Mathworks Inc | תוכנת ניתוח נתונים רב-משתנית | |
| Unscrambler X | CAMO | Multivariate תוכנת ניתוח נתונים | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | ממשק משתמש גרפי עבור Matlab |
מקורות
- Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).
- World Health Organization. World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W. Chapter 105. Manual....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
