נהלי ייצור יון לנתניד קשוב מאוד דיסקות chelating הרכבות polymolecular מוצגים. התגובה מגנטי מוכתב על ידי גודל ההרכבה, אשר מותאם על ידי ההבלטה דרך ממברנות nanopore. של ההרכבות alignability מגנטיות, טמפרטורה-induced שינויים מבניים המפוקחים על-ידי שבירה כפולה מדידות, טכניקה ללא תשלום תהודה מגנטית גרעינית, פיזור ניוטרון זווית קטנה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תהליכי ייצור ומדידות שבירה כפולה עבור תכנון יון לנתניד דיסקות מגיב Chelating פוספוליפיד להרכבות
במאמר זה
סיכום
תקציר
Bicelles הם מכלולים polymolecular דמוי דיסק tunable נוצר מגוון רחב של תערובות השומנים. מגוון יישומים ממחקרים קרום חלבונים מבניים על ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להתפתחויות nanotechnological כולל היווצרות של ג'לים האקטיביות דיסקות להחלפה שטיחות. לטכנולוגיות אלו דורשים שליטה גבוהה של גודל ההרכבה, תגובה מגנטית התנגדות תרמית. תערובות של 1, 2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DMPC) ויון לנתניד שלה (בעוד3 +) chelating פוספוליפיד המספר המשלים, 1, 2-dimyristoyl -sn(triaminepentaacetate - glycero-3-פוספו-ethanolamine-דיאטילן DMPE-DTPA), להרכיב לתוך הרכבות קשוב מאוד מגנטית כגון DMPC/DMPE-DTPA/בתוך3 + (יחס טוחנת 4:1:1) bicelles. הקדמה של כולסטרול (חול-OH) ונגזרות סטרואידים בתוצאות bilayer בערכת אחר מכלולים מציעים מאפיינים ייחודיים הכימי פיזיקלי. עבור הרכב השומנים נתון, alignability מגנטי הוא יחסי לגודל bicelle. Complexation של Ln3 + תוצאות בתגובות מגנטי חסר תקדים מבחינת סדר הגודל והיישור כיוון. קריסת זאזא תרמו הדיסק-מבני לתוך שלפוחית על חימום ומאתגרות של הממדים של ההרכבות על ידי ההבלטה דרך ממברנה מסננים עם גדלים נקבובית מוגדרים. Bicelles מגנטית alignable נוצרות על ידי קירור עד 5 מעלות צלזיוס, והתוצאה היא מכלול המידות שמגדיר את מבשרי שלפוחית. במסמך זה, הליך ייצור זה מבואר, alignability המגנטי של ההרכבות הוא לכמת על ידי שבירה כפולה המידות תחת שדה מגנטי T 5.5. בהמשך, האות שבירה כפולה, שמקורם bilayer פוספוליפיד, מאפשר מעקב אחרי polymolecular שינויים המתרחשים bilayer. טכניקה פשוטה זו היא משלימה ולניסויים NMR, זה בדרך כלל המועסקים לאפיין bicelles.
מבוא
Bicelles הם מכלולים כמו דיסק polymolecular המתקבל תערובות השומנים רבים. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 הם נמצאים בשימוש נרחב עבור אפיון מבניים ממברנה מולקולות על ידי NMR ספקטרוסקופיה. 6 , 7 . עם זאת, מאמצי שואפים להרחיב בתחום היישומים האפשריים. 5 , 8 , 9 מערכת bicelle הכי נחקרות מורכבת תערובת של 1, 2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DMPC), המהוות את ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ייצור נוהל DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) וההרכבות DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5) polymolecular
- הכנות ראשוניות
- רחיצת כל כלי הזכוכית על ידי שטיפה פעם עם אתנול התייצב כלורופורם (> 99% כלורופורם) ויבש עם אוויר דחוס.
- לייצר 2 נפרדים 10 מ"ג/מ"ל מלאי פתרונות של DMPC ו DMPE-DTPA ב כלורופורם מיוצב אתנול (> 99% כלורופורם), 10 מ מ מניות פתרון של חול-OH ב כלורופורם מיוצב אתנול (> 99% כלורופורם) ו- 10 מ מ פתרון מניות של TmCl3 . מתנול.
- להכנת בופר פוספט 50 מ מ על ערך ה-pH של 7.4 על ידי ערבוב 0.121 גר' נתרן dihydrogen פוספט וגופרית והרכבו ו- g 0.599 di נטול מים-נתרן מימן פוספט ב-....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
האות שבירה כפולה של הלא-extruded DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) מדגם היה להשגחה תחת שדה מגנטי T 5.5 במהלך חימום וקירור מחזור מ 5 עד 40 מעלות צלסיוס, חזרה בקצב של 1 ° C/min (איור 6). התוצאות שבירה כפולה אישר היישורים מגנטי גבוה ב 5 ° C עם ערך של 1.5 x 10-5, כפליים חזקה לגבי המערכות מעוקם המדווחת. 6 , 7 , 23 מכוונת של האות שבירה כפולה מעל .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
דין וחשבון מפורט איך שבירה כפולה המידות שימשו בשילוב עם SANS ניסויים כדי להעריך את שיטות ליצירת קשוב מאוד דיסקות Ln3 + chelating פוספוליפידים הרכבות נמצא Isabettini. et al. 23 הפרוטוקולים פבריקציה נוספת המוצעת חלים גם עבור הרכבות מורכב יותר DPPC ו- DPPE-DTPA פוספוליפידים או עבור אלה המכילים נגזרות סטרואידים הנדסה כימית ב- bilayer שלהם. 11 , 12 , 17 , 18
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים להכיר קרן המדע הלאומית השוויצרית למימון SMhardBi (פרויקט מספר 200021_150088/1). SANS הניסויים בוצעו spallation שוויצרי ניוטרון במקור SINQ, פול Scherrer Instute, Villigen, שוויץ. המחברים מודים בחום ד ר יואכים Kohlbrecher על הדרכתו עם הניסויים SANS. הגדרת מדידה שבירה כפולה תחת שדות מגנטיים גבוה קיבל השראה מן הכיוונון הקיים במעבדה גבוהה-שדה מגנטי HFML, ניימכן, הולנד. אנו מודים ברונו Pfister על עזרתו בפיתוח האלקטרוניקה של ההתקנה שבירה כפולה, יאן Corsano, דניאל Kiechl לבניית מסגרות המתיר יישור בסדר ולא נתיישב לייזר ו ד ר קולר ברנהרד לתמיכה טכנית שוטפת.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | >99% |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid מלח הקסמוניום (DMPE-DTPA) | Avanti Polar Lipids | 790535P | >99% |
| תוליום(III) כלוריד | סיגמא-אולדריץ' | 439649 | נטול מיםאבקה, 99.9% על בסיס מתכות קורט |
| דיספרוזיום (III) כלוריד | סיגמא-אולדריץ | 325546 | נטול מים, אבקה, 99.9% על בסיס מתכות קורט |
| איטרביום (III) כלוריד | סיגמא-אולדריץ' | 439614 | נטול מים, אבקה, 99.9% על בסיס מתכות קורט |
| כלורופורם | סיגמא-אולדריץ | ' | 319988 מכיל אתנול כמייצב, מגיב ACS, ≥ 99.8% |
| מתנול | סיגמא-אולדריץ' | 34860 | ≥ 99.9% |
| כולסטרול | אמרסקו | 433 | אולטרה טהור כיתה |
| D2O | ARMAR כימיקלים | 1410 | 99.8 אטום % D |
| מים טהורים | במיוחד Millipore | Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001) | |
| מד pH אלקטרוני | Metrohm | 17440010 | |
| Whatmann Nuclepore 25 מ"מ 100 ננומטר מסנן ממברנה | VWR | 515-2028 | |
| Whatmann Nuclepore 25 מ"מ 200nm ממברנה מסנן | VWR | 515-2029 | |
| Whatmann Nuclepore 25 מ"מ 400nm ממברנה מסנן | VWR | 515-2030 | |
| Whatmann Nuclepore 25 מ"מ 800nm ממברנה | מסנן VWR | 515-2032 | |
| Whatmann נייר סינון | VWR | 230600 | |
| 25 מ"ל בקבוק תחתון עגול | VWR | 201-1352 | 14/23 NS |
| זכוכית 3 מ"ל VWR | 548-0554 | ND18, 18x30 מ"מ | |
| 2.5 מ"ל מזרק זכוכית | המילטון | ||
| נתרן דימימן פוספט דיהידרט | Merk | 1.06342 | מלח המשמש לייצור מאגר פוספט |
| די-נתרן מימן פוספט | Merk | 1.06586 | מלח המשמש לייצור מאגר פוספט |
| חנקן נוזלי | Carbagas | - | |
| גז חנקן בלחץ | Carbagas-200 | בקבוק בר | |
| מכבש ליפידים 10 מ"ל | Lipex-מצויד | במלואו בחבית תרמו-צינור | |
| PVC בלחץ גבוה | GR NETUM-חייב | להתנגד ליותר מ-4 מתאמי Serto MPa | |
| Sertot-Nitrile | |||
| כפפות | VWR-2 | ||
| מ"ל פיפטות | זכוכיתVWR | 612-1702 | לייזר דיודה ארוכה 230 מ"מ |
| ניופורט | LPM635-25C | ||
| DSP מגבר נעילה דו-פאזי | SRS | SR830 | |
| גלאי פוטודיודות | Silonex Inc. | SLSD-71N5 | 5 מ"מ, סיליקון, מוליך פוטו |
| 5.5 T קריוגני | מגנטי קריוגני/Oerlikon | AG-12 | בר מקורר. מדחס RW4000/6000, ראש קריו RGD 5/100 TA |
| מסנן מעבר נמוך מסדר שני | ספק כוח ליניארי ביתי 24V DC, מסדר שני, מפתח סאלן, תדר ניתוק 360 הרץ, +/- 12V, מקסימום 10 mA | ||
| אפנן פוטואלסטי | מכשירי הינדס | PEM-90 | |
| גלאן-תומפסון קלציט מקטב | ניופורט | 10GT04 | קוטר 25.4 מ"מ |
| קובט מדגם קוורץ | הלמה | 165-10-40 | תא מבוקר טמפרטורה, 0.8 מ"ל, אורך נתיב 10 מ"מ |
| בדיקת טמפרטורה | Thermocontrol-Type K, קוטר 0.5 מ"מ, | ||
| מראות תרמוקואקס לא מקטבות | ניופורט | 50326-1002 | 25.4 מ"מ |
| RS 232 כבלים | National Instruments | 189284-02 | לחיבור ליציאת RS-232 בחזית בקרי FieldPoint קומפקטיים |
| BNC 50 ו-Omega; כבלים ומחברים | National Instruments | 763389-01 | |
| cFP-AI-110 | National Instruments | 777318-110 | מודול כניסת מתח וזרם אנלוגי 8 ערוצים עבור FieldPoint קומפקטי |
| cFP-CB-1 | National Instruments | 778618-01 | בלוק מחברים משולב לחיווט ל-FieldPoint קומפקטי קלט/פלט |
| cFP-CB-3 | National Instruments | 778618-03 | בלוק מחבר איזותרמי משולב לחיווט צמדים תרמיים למודול cFP-TC-120 |
| cFP-TC-120 | National Instruments | 777318-120 | מודול כניסת צמד תרמי 8 ערוצים עבור FieldPoint קומפקטי |
| cFP-1804 | National Instruments | 779490-01 | ממשק Ethernet/טורי עבור NI Compact FieldPoint |
| LabView 2010 | National | Instruments-כוח | |
| תעשייתי אספקת | Traco Power | TCL 060-124 | 100-240V AC |
| אמבט מים | Julabo | FP40-HE | סירקולטור קירור/חימום |
מקורות
- Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
- Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
