באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) מערכת מספקת כלי מבטיח עבור הנדסה גנטית, ופותחת לו את האפשרות של שילוב יישוב של transgenes. אנו מתארים קצה בתיווך הומולוגיה להצטרף (HMEJ)-המבוססת על אסטרטגיה עבור DNA יעיל ממוקד אינטגרציה ויוו , ממוקד ג'ין טיפולים באמצעות CRISPR/Cas9.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
כפלטפורמה מבטיח הגנום העריכה, מערכת CRISPR/Cas9 יש פוטנציאל גדול עבור הנדסה גנטית יעיל, במיוחד לשילוב יישוב של transgenes. עם זאת, בשל יעילות נמוכה רקומבינציה הומולוגית (HR) ואת מוטציות שונות ויאסין של קצה שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ)-מבוסס אסטרטגיות-חלוקת תאים, ויוו הגנום עריכה נשאר אתגר גדול. כאן, אנו מתארים את קצה בתיווך הומולוגיה להצטרף (HMEJ)-CRISPR/Cas9 מערכת לשילוב יעיל ויוו מדויק יישוב מבוססת. במערכת זו, הגנום יישוב, התורם וקטור המכיל הומולוגיה זרועות (~ 800 bp) ולצדו היעד RNA (sgRNA) מדריך בודד רצפים הם ביקע מאת CRISPR/Cas9. אסטרטגיה זו מבוססת על HMEJ משיגה שילוב יעיל transgene העכבר מופרות, וכן hepatocytes ויוו. יתר על כן, אסטרטגיה מבוסס-HMEJ מציעה גישה יעילה עבור תיקון של fumarylacetoacetate ההידרולז (Fah) מוטציה ב- hepatocytes ואת מציל Fah-מחסור המושרה כשל בכבד עכברים. יחדיו, התמקדות ממוקד אינטגרציה, אסטרטגיה זו מבוססת-HMEJ מספק כלי מבטיח עבור מגוון של יישומים, כולל דור של מודלים מהונדס גנטית וטיפולים ג'ין יישוב.
מבוא
עריכה מדויקת, ממוקד הגנום נדרש לעיתים קרובות לייצור מודלים מהונדס גנטית וטיפולים רפואיים. הרבה מאמץ לפתח אסטרטגיות שונות עבור יעיל הגנום יישוב עריכה, כגון אבץ אצבע נוקלאז (ZFN), nucleases אפקטור כמו מפעיל שעתוק (TALENs), ומערכות CRISPR/Cas9. אסטרטגיות אלה ליצור מעברי כפול-גדיל DNA יישוב (DSB) הגנום, ולנצל מהותי מערכות תיקון ה-DNA, כגון1,רקומבינציה הומולוגית (HR)2, בתיווך microhomology סוף מצטרף (MMEJ)3 , 4 , 5ולאחר סיום שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ)6,7,<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים לרבות נושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה במחקר ביו-מכוני שנגחאי מדע ביולוגי (CA).
1. עיצוב של התורם פלסמידים
-
מבחר sgRNA
- להשתמש באינטרנט כלי עיצוב CRISPR כדי לחזות sgRNAs המטרה אזור11,12,13,14,15. על מיקומה Cdx2 , עיצוב 6 sgRNAs שונים (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) סביב התחנה codon עם פוטנציאל העליונים והתחתונים דרגה גבוהה יותר את המטרות (איור 1א')
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מבוססי HMEJ הגנום עריכה בהעכבר עוברי: כדי להגדיר את היעילות טוק-אין של השיטה מבוססת HMEJ העכבר מופרות, נמסר לנו Cas9 ה-mRNA, sgRNA לעבר הגן Cdx2 , התורם HMEJ לתוך עכבר מופרות, שנועד נתיך של הגן כתב p2A-mCherry codon האחרון של Cdx2 גנים (איור 2א). מופרות מוזרק התפתחה blastocysts בתרבות. כדי להעריך את היעילות בטוק, ניתחנו את זריחה mCherry עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ומצאנו כי 12.9% של blastocysts קבלת HMEJ תורמי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השלבים הקריטיים ביותר בבנייה של פלסמידים התורם HMEJ הם: (1) מבחר sgRNA עם יעילות גבוהה של ביקוע DNA והמרחק נמוך בין אתר חיתוך sgRNA, stop codon ובניית (2) נכונה HMEJ התורם. CRISPR/Cas9-מתווכת המחשוף בנתיב התורם הן transgene (מכיל אתרי היעד sgRNA והזרועות הומולוגיה bp ~ 800) ואת הגנום יישוב נחוץ לשם שילוב יעיל ומדויק יישוב ויוו. השלבים הקריטיים ביותר של הדור של טוק-אין עכברים באמצעות השיטה מבוססת-HMEJ הם: (1) הכנת באיכות גבוהה של Cas9 mRNA ו- sgRNA (ניוון לא קיימת ב- Cas9 mRNA ו- sgRNA), (2) הכנת פלסמיד התורם HME.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי רשויות אישורים אסטרטגי עדיפות תכנית המחקר (XDB02050007, XDA01010409), ה-Hightech R הלאומית & תוכנית D (תוכנית 863; 2015AA020307), קרן מדעי הטבע הלאומי של סין (NSFC מעניקה 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), סין הנוער אלפי התוכנית כישורים (להיי), או באמצעות פרויקט של האקדמיה הסינית למדעים, שנחאי העיר ועדת המדע והטכנולוגיה פרויקט (16JC1420202 להיי), משרד המדע, הטכנולוגיה של סין (רוב; 2016YFA0100500).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| וקטור pAAV | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | וקטור AAV לקידוד SpCas9 מותאם לקודון אנושי המונע על ידי מקדם EFs |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | תורם HMEJ על מיזוג מדווח p2A-mCherry לעכבר Actb. EGFP מונע על ידי מקדם EF1a ו-sgRNAs מונעי U6 המכוונים ל-Actb. עמוד שדרה AAV. |
| AAV_Cdx2 תורם HMEJ | Addgene | 97319 | תורם HMEJ לאיחוי מדווח p2A-mCherry לעכבר Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection | Reagent Life Technology | L3000015 | |
| טכנולוגיות חיים | ללא גרעין | AM9930 | |
| Bbs I | ניו אינגלנד Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | ניו אינגלנד Biolabs | B7002S | |
| T7 אנדונוקלאז I | ניו אינגלנד Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA הרכבה מאסטר מיקס | ניו אינגלנד Biolabs | E2621L | |
| פלסמיד EndoFree-Midi ערכת | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| בוער/חום מכשיר סאטר מושך מיקרופיפטה | P-97 | חולץ מיקרופיפטה (פרמטרים: חום, 74; משיכה, 60; מהירות, 80; זמן/השהיה, 200; לחץ, 300) | |
| מכשיר סאטר | זכוכית בורוסיליקט | B100-78-10 | סוג נימים (קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.78 מ"מ עם נימה) |
| מיקרו-מזרק FemtoJet | Eppendorf | ||
| הקפאת מיקרוטום | Leica | CM1950-Cryostat | עובי של 40 μ מ בעד מוח, 10 μ מ בעד כבד |
| ארנב אנטי-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure עז אנטי-ארנב IgG | ג'קסון Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| עט, סטרפטוקוק, גלוטמין | Gibco | 10378016 | |
| ערכת מיצוי ג'ל | אומגה | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng רפואה | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| ציטוכלזין B | סיגמא | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA עם D-גלוקוז ופנול אדום | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 בינוני עם פנול | אדום שמן | CAT#MR-015-D | |
| סיגמא |
מקורות
- Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells usin....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy
Posted by JoVE Editors on 3/10/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay" to " T7 endonuclease I" respectively.
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
- Surveyor nuclease assay of sgRNA
NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.
to:
- T7 endonuclease assay of sgRNA
NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. Please click here to view a larger version of this figure.
