פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במבחנה מבודד צב ראש הכנה כדי למדוד את קינמטיקה של תנועות עיניים שלהם. לאחר ההסרה של המוח של הגולגולת, עצבי יכול להיות מגורה עם זרמים לכמת סבבים של העין, שינויים במידות האישון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אחרי חיות מורדמים, הרקמות שלהם מתחילים למות. צבי מציעים יתרון בגלל זמן הישרדות ארוך יותר של הרקמות שלהם, במיוחד בהשוואה לבעלי חוליות עם מצלצלים. מסיבה זו, ניתן לבצע ניסויים במבחנה ב צבים ממושכות של זמן כדי לחקור את האותות העצביים ובקרה של פעולות היעד שלהם. שימוש של הכנת ראש מבודד, מדדנו את קינמטיקה של תנועות עיניים בצבים, אפנון שלהם על ידי אותות חשמליים נישא על ידי עצבי. אחרי המוח שהוסר הגולגולת, עוזב את עצבי תקין, בראש ביתור הושם על gimbal לכיול תנועות עיניים. זכוכית אלקטרודות היו קשורות עצבי (תזוזת גלגל העין, מבט, ו- abducens), מגורה עם זרמים לעורר תנועות עיניים. אנחנו במעקב תנועות עיניים עם סרט אינפרא-אדום מעקב המערכת, כימות סבבים של העיניים. זרם פולסים עם מגוון של amplitudes, תדרים, ושימשו הרכבת משכים לבחון השפעות על תגובות. כי ההכנה מופרדת מן המוח, אפשר לבחון מסלול efferent הולך שריר מטרות בבידוד לחקור איתות עצבי, בהעדר מידע חושי מרכזי מעובד.
מבוא
הרציונל לשימוש צבגון אדום-צבים בניסויים אלקטרופיזיולוגיות:
צבגון אדום-צבים (Trachemys scripta elegans), נחשב לאחד מין פולש הכי גרוע בעולם,1 , ניתן לציין כי המערכת האקולוגית היא בצרות. הסיבה למה צבים צבגון אדום-הם כל כך מוצלח הוא ממעטים להבין אבל זה יכול להיות באופן חלקי בגלל שלהם פיזיולוגיה סובלנית ואחזקה של רקמות עצבים שיכולים לשרוד תחת תנאים ובשפתיים2,3,4 . באמצעות אותם ניסויים אינו מאיים על מספרם, עם מאמץ מינימלי, ההכנות אלקטרופיזיולוגיות יכול להישאר בר קיימא על משכים מורחבת, עוד 18 שעות5
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: צבגון אדום-צבים, גם זכר וגם נקבה, נרכשו מיצרן. צבים שוכנו בסוויטה בעלי חיים חמים המכיל שתי אמבטיות 60 ליטר מצויד איים לבנים עבור לשיזוף תחת אורות אינפרא-אדום 250-W. הסביבה נשמר על מחזור 14/10-h/כהה עם טמפרטורת מים 22 מעלות צלזיוס. האורות היו מופעלת ב־6: 00 וכיבה בשעה 8 בערב. הטנקים מצויד עם מערכות סינון נוקו שבועי, צבים הואכלו ad libitum בכל יום אחר. הטיפול של צבגון אדום-צבים, כל המתואר כאן32,בצרות הבאים33 אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) במכללת לאפייט.
1. ציוד התקנה
- להכין תמיסת רינגר צב. להוסיף מים מזוקקים בצו זה את הדברים הבאים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מציג תמונות סטילס של תמונות שנלקחו וידאו המתאר את הקרע. תמונות לספק מיקומים טיפוסיים של העצבים לפני גזירה מן המוח.
איור 1: סטילס של תמונות שנלכדו מהסרט של הקרע המקומות של עצב הראייה (לביטוח לאומי), העצב (nIII), עצב הסליל (ניב), העצב המצדיד (nVI). (א) תמונה עם תוויות אזורים במו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שלבים קריטיים:
השלבים הקריטיים בתוך פרוטוקול זה הם הבאים: 1) את הקרע וטיפול לקחת כדי לשמור על הכדאיות של העצבים transected; 2) התאמת גדלים על ידי החקירה היניקה עצבי לספק תגובות עקבי; ו 3) המיקום של הראש, אצל gimbal לספק נאותים וכיול לסיבובים של העין.
פתרון בעיות:
הקרע יכול להיות מאתגר, אבל לאחר שסיים אותו כמה פעמים, השלבים צריך להיות יחסית ישר קדימה. אם העצבים מופיעים ולחייב, סביר להניח שהסיבה לכך היא כשל של הקרע. במהלך ההסרה של המוח רק מינימלי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מודים מק'קנה פולט גברת ליסה Pezzino במחקר זה לתמיכה מזכירות, ואת מר פיל אורבך על תמיכה טכנית. המחברים מודים גם ד"ר מייקל אריאל ו מייקל ס ג'ונס (סנט לואיס אוניברסיטת בית הספר לרפואה) על מציגה לנו במבחנה מבודד הכנת ראש. מימון עבור תמיכה של שיתוף פעולה זה סופק על ידי המחלקה לביולוגיה (רוברט ס קרן צ'ייס), וועדת המחקר האקדמי, התוכנית Neuroscience במכללה לאפייט. לבסוף, עבודה זו מוקדשת מר פיל אוירבך, שהלך לעולמו 2016 28 בספטמבר; הוא הוצא מהשירות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה, זיהה את התועלת בשלב 5-ציר שלה לשימוש בפרוטוקול זה. תושיה וידידות שלו תחסר לנו מאוד
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צבי סליידר אדומי אוזניים | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | גודל גדול (אורך שרוול 15-20 ס"מ) |
| נתרן כלורי | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| אשלגן כלורי | סיגמא-אולדריץ' ושות', LLC. | P5405 | |
| כוריד מגנזיום | סיגמא-אולדריץ' ושות', LLC. | M7304 | |
| נתרן ביקרבונט | סיגמא-אולדריץ' ושות', LLC. | S5761 | |
| דקסטרוז | סיגמא-אולדריץ' ושות', LLC. | C5767 | |
| חומצה הידרוכלורית מרוכזת | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| סידן כלורי | סיגמא-אולדריץ' ושות', LLC. | C7902 | |
| מד pH | אוקטון | pH 6 + | |
| אלקטרודה לגירוי יניקה | A-M Systems | 573000 | אלקטרודת יניקה דו קוטבית. שים לב ש-573000 הוחלף ב-573050. |
| מערכות זכוכית נימית | A-M | 626000 | זכוכית נימית בורוסיליקט חד חבית ללא מיקרופילמנט, אורך 10 ס"מ, קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.50 מ"מ |
| אלקטרודה לגירוי יניקה אלטרנטיבית | A-M Systems | 573050 | אלקטרודת יניקה דו קוטבית. דורש זכוכית נימית בקוטר גדול יותר: 627000, קוטר חיצוני 1.2 מ"מ, קוטר פנימי 0.68 מ"מ |
| סטריאוסקופ | Lieca | GZ7 | טווח הגדלה, 10x – 70x |
| מקור אור סיבים אופטיים | Amscope | HL250-A | 150W מיקרוסקופ אופטי תאורה תיבת אור |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | נירוסטה, קפיץ ישר, 5.25 אינץ' |
| בדיקת דיסקציה קהה | חברת האספקה הביולוגית של קרולינה | 627405 | בדיקה בקניון הובר, בדיקה ומחפש כפול, 6 אינץ' |
| מיקרומספריים | האספקה הביולוגית של קרולינה | 623555 | מספריים לניתוח, נירוסטה, להבים בגודל 0.5 אינץ', מלקחיים עדינים באורך 4.75 אינץ' |
| Sigma-Aldrich Co. LLC. | מלקחיים F6521 | תכשיטנים, דומונט מס' 5, סגסוגת אינוקס, 4.25 אינץ' | |
| מלקחיים מעוקלים | סיגמא-אולדריץ' ושות' LLC. | Z168696 | קצה בינוני, מלקחיים מעוקלים, נירוסטה, |
| ידית אזמל | Sigma-Aldrich Co. LLC. | ידיות אזמל | S2896 |
| להב אזמל | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | להבי אזמל, מס '11, פלדה |
| גיליוטינה | מכשיר הרווארד | 73-1918 | קליין גיליוטינה מסוג 7575 |
| מרית | סיגמא | Z648299 | סט שקילה מיקרו כף ומרית. השתמש במרית קטנה: 5.9 אינץ' ארוך x 0.07 אינץ' ידית קוטר עם קצה מרובע: 0.17 אינץ' x 1.3 אינץ' ארוך, קצה שני עגול: 0.17 אינץ' x 1.27 אינץ' הוק ארוך |
| Autozone | 98069 | סט וו ופיק SureBilt. השתמש במטחנה כדי להקהות נקודות וו חדות כדי למנוע פגיעה בפה של בעלי חיים. | |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | תערובת גזים סטנדרטית מוסמכת חמצן לאיזון פחמן דו חמצני 5%, גודל 200 צילינדר, CGA-296 |
| Regulator | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | פליז חד שלבי 0-100 psi ווסת צילינדר אנליטי CGA-296 עם יציאת מחט. השתמש בשסתום צינור תעופה מתכוונן מפליז כדי לעבור מ -3/8 אינץ', קוטר פנימי, צינורות ויניל תעופה המחוברים לווסת ל-3/16 אינץ', קוטר פנימי, חיבור חברת תעופה הולך לפיפטה איירסטון או פסטור זכוכית. |
| שסתום צינור תעופה מתכוונן | דוקטורס פוסטר וסמית | CD-12061 | שסתום פליז |
| שולחן קשיח | לא ידוע | ידועה | מונחת על גבי שולחן יציב. תשעה כדורי טניס בקוטר 5 אינץ' מבודדים רעידות מהמשטח העליון של השולחן. |
| כדור טניס 5 אינץ' | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: הכדורים לא חתוכים ומוחזקים בתוך מסגרת משולבת בחלק התחתון של דלת החיטוי. |
| טבלת בידוד רעידות חלופית | Newport Corporation | INT1-36-6-N | מערכת בקרת רטט קשיחה, תקינות 1: מידות פני השטח, 3' x 6'Gimbal |
| ISI, International Scientific Instruments, Inc. | שלב מ-SUPER III-A סריקת EM | שלב אוצנטרי 5 צירים: תנועות ליניאריות X, Y ו-Z, ± 20 מ"מ, דיוק 0.1 מ"מ; סיבובים, אנכיים ופלוסמן; 10°, ואופקי, ± 12.5°, עם 1.25° דיוק. הערה: ממכשיר הפירוק. | |
| צ'אק לגימבל | לא ידוע | צ'אק ממיקרוטום ישן מייצור לא ידוע מעובד כך שיתאים לפיר של מחזיק הדגימה של הגימבל | |
| האלטרנטיבי | ThorLabs, Inc. | GN2/M עם MBT602/M | גוניומטר דו-צירי (GN2/M) מותקן על במת מיקרו-בלוק תלת-צירית עם מכוונני בורג אגודל (MBT602/M): תכנן צ'אק כדי להחזיק את ראש הצב עם העין בגובה 12.7 מ"מ מעל פני השטח העליונים של הגוניומטר (מרחק לנקודת סיבוב) |
| מערכת מעקב עיניים מבוססת וידאו | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, שיטת מעקב PC-60 | : וידאו אינפרא אדום על ידי אישון כהה; מצלמה בשחור-לבן (פריט BC02): 30 הרץ, 640 x 480; דרישות מערכת: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; טווח חזותי: אופקי +/- 44°; אנכי +/- 20°; דיוק ~0.5°; רזולוציה מרחבית ~0.15°; רזולוציית גודל האישון ~ 0.03 מ"מ; נתוני עיניים: X, מיקום Y של מבט, גובה ורוחב אישון, פיתול, זמן דלתא, זמן כולל ואזורי עניין (ROI); תקשורת בזמן אמת (פריט 0022): AnalogOut 4 ערוצים עם שמונה ערוצי קלט TTL לסימון קודים לקובץ הנתונים |
| בסיס מגנטי רב-מיקומי | Harbor Freight Tools | פיטסבורג, פריט #5645 | מחזיק מגנטי מגיע עד 12 אינץ' ומייצר 45 ק"ג. של משיכה מגנטית. השתמש כדי למקם את המצלמה. השחילו חורים במכונה בקצה המוט כדי להרכיב מצלמות. |
| מיקרומניפולטור | Kopf | 900 | מניפולציה של 5 צירים להרכבה של אלקטרודת יניקה: X, Y, Z נסיעה ליניארית, 2 צירי סיבוב |
| היקף חיתוך על בום | Lieca | GZ6 | טווח הגדלה, 6.7x – 40x |
| ממריץ עצבים/שרירים | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | ממריץ מתח דופק כפול: שני ערוצי פלט הניתנים להפעלה עצמאית או לסנכרון ליצירת פולסי מתח קבוע לא מבודדים (10 mv עד 150 V). הפולסים יכולים להיות בודדים (10 μ שניות עד 10 שניות), חוזר על עצמו (0.01 הרץ עד 1 קילו-הרץ), ורכבות (1 אלפיות השנייה עד 10 שניות) ומסונכרן עם כניסות ויציאות TTL. שלח יציאות TTL דרך ערוצי הפלט של מחבר DB25 לערוצי הקלט TTL של ViewPoint EyeTracker. הערה: Astro-Med Grass Telefactor כבר לא בעסק. |
| מכשיר בידוד זרם | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | יחידת בידוד גירוי זרם: מאפשרת אספקה בטוחה של זרמים קבועים על ידי ה-S88 לתכשיר. ה-PSIU6 מתחבר באמצעות כבל BNC לאחד מערוצי היציאה של ה-S88. מתגי מכפיל ב-PSIU6 מאפשרים ל-S88 לייצר מגוון רחב של אמפליטודות זרם הנעות בין 0.1 ומיקרו; A עד 15 mA. |
| ממריץ עצבים/שרירים חלופי עם בידוד | A-M Systems | 2100 | ממריץ דופק מבודד: ליחידה יש מבודד מובנה לייצור זרמים קבועים. |
מקורות
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-42....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
