מאמר שיטה

כימות של אוקסין אנדוגני, ציטוקינין במהלך Internode תרבות הוזמנתי למסיבה

DOI:

10.3791/56902

⸱

15 במרץ 2018

 ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נצרי adventitious יכולה להיגרם במקטעים internodal הוזמנתי למסיבה ללא טיפול phytohormone. כדי להעריך את הדינמיקה phytohormone במהלך היווצרות לירות adventitious, מדדנו אוקסין אנדוגני, ציטוקינין בקטעים internodal על-ידי LC-MS/MS.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לירות adventitious צורה היא טכניקה חשוב התפשטות של הגידולים החקלאיים כלכלית ועל לרגנרציה של הצמחים הטרנסגניים. Phytohormone טיפול נדרש אינדוקציה של נצרי adventitious של רוב המינים. אם יורה adventitious יכולה להיגרם נקבעת על-ידי האיזון בין אוקסין ציטוקינין (CK) רמות. מאמץ רב נכנס לקביעת ריכוזים מיטביים ושילובים של phytohormones כל רקמה משמש explants, כל מיני צמחים. ב. הוא אדם חכם, עם זאת, יורה adventitious יכולה להיגרם במקטעים internodal תרבות בינוני ללא טיפול phytohormone. פעולה זו מאפשרת את פלסטיות הגלום הוזמנתי למסיבה עבור תאית התמיינות להערכה. לזירוז יורה adventitious, הוזמנתי למסיבה, אנחנו תרבותי מקטעים internodal ב 24 ° C תחת 15 µmol מ'−2 s− 1 של אור במחזור 14-h אור/10-h כהה. ללא phytohormone B5 בינוני פני השטח למוצק עם מסטיק gellan 0.2% למשך 5 שבועות. לחקור phytohormone dynamics במהלך היווצרות לירות adventitious, מדדנו אנדוגני חומצה אינדול-3-אצטית ואת הגרביים בתוך המקטעים באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית LC-MS/MS. שיטה זו מאפשרת ניתוח של חומצה אינדול-3-אצטית אנדוגני ורמות הגרביים בדרך פשוטה. ניתן להחיל אותה לחקור את הדינמיקה של אוקסין אנדוגני, CK במהלך organogenesis של מיני צמחים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Haberlandt גוטליב (1854-1945) הציע את הרעיון של "totipotency", על ידי הצמח אילו תאים יכולים לחלק, להבדיל, והפק צמחים שלמים גם לאחר בידול מוקדמת שלהם לתוך תאים מסוים סוגי שתילים בוגרים1. בתרבות רקמה, אם התחדשות הצמח יכולה להיגרם או לא נקבעת על ידי שילוב של ריכוז phytohormones exogenously יישומית במצע הגידול. Skoog ומילר מצא כי נצרי adventitious יכולים להיגרם מן קסם טבק באמצעי תרבות המכיל יחס גבוה של הגרביים כדי auxins, ואילו שורשים adventitious יכולים להיגרם על בינוני המכיל יחס נמוך2. מאז הממצאים, תרביות רקמה כבר בשימוש נרחב על התפשטות של הגידולים החקלאיים כלכלית ועל לרגנרציה של הצמחים הטרנסגניים3. נצרי adventitious יכולה להיגרם רקמות חוץ meristem apical לירות, כגון עלים, שורשים, פרקי הגבעולים. Phytohormone טיפול נדרש אינדוקציה של נצרי adventitious של רוב מיני צמחים. עם זאת, ריכוז אופטימלי ושילובים שונים על ידי מינים ובקרב רקמות משמש explants. כך, מאמץ רב נכנס לקביעת ריכוזים מיטביים של שילובים של phytohormones לניסויים.

Carapichea ipecacuanha (ברוט.) ל' אנדרסון (איפקאק) הוא צמח מרפא המכיל אלקלואידים כגון emetine ו- cephaeline, ובעיקר השורשים4. תמציות בסיס משמשים ומכייח, של כל ו של amoebicide5. למרות איפקאק גדל באופן טבעי הגשם הטרופיים של ברזיל, זה מסרבים להגדיר זרעים בתרבות, מקטינה שיעור הנביטה במהלך האחסון זרע ביפן, עם אקלים קר שלה6. במקום זאת, זה הופץ על ידי תרביות רקמה, אשר adventitious לירות7,השיטה היעילה ביותר8הוא היווצרות על פרקי הגבעולים. מעניין, יורה adventitious יכולה להיגרם במין זה ללא טיפול phytohormone8.

נצרי adventitious נוצרות על האפידרמיס באזור הפסגה של מקטעי internodal ללא callusing, אך לא את הבסיס באזור9. הבדל זה מציין קוטביות רקמות בקטעים internodal, שהוא כנראה לפי תקנה phytohormonal. מערכת התרבות איפקאק מאפשר הזדמנות ייחודית לנתח את השינויים ברמות phytohormone אנדוגני במהלך היווצרות לירות adventitious. כאן אנו מציגים שלנו שיטה לניתוח של רמות אנדוגני של אחד אוקסין (חומצה אינדול-3-אצטית (רשות העתיקות)) ואת הגרביים ארבע (isopentenyl אדנין (iP), isopentenyl אדנין riboside (ריבית), טרנס-zeatin (ט ז), טרנס-zeatin riboside (תצרוכת)) בקטעים internodal באמצעות LC-MS/MS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: איפקאק (ipecacuanha ג) שימש במחקר זה כי הוא מקל הניתוח של phytohormones אנדוגני.

1. צמיחה תנאים לזירוז יורה Adventitious הוזמנתי למסיבה

  1. להכין ללא phytohormone B5 בינוני להתאים ל- pH 5.710והוסיפו החניכיים gellan 0.2%. לחטא על-ידי autoclaving.
  2. שופכים 25 מ של המדיום בלוק לתוך צלחת פטרי סטריליות (90 מ"מ × 20 מ"מ).
  3. לחתוך קטעים internodal 8 מ מ של שתילי איפקאק באמצעות אזמל כירורגי עם להב מס 22 על מגש אקריליק סטרילי, ומניחים על המדיום (איור 1).
  4. תרבות ללא phytohormone B5 בינוני ב 24 ° C תחת 15 µmol מ'−2 s− 1 של אור במחזור 14-h אור/10-h כהה למשך 5 שבועות.
  5. לזהות אזורים אני (הפסגה) הרביעי (הבסיס) כל קטע (איור 1B). לספור את מספר יורה adventitious > 0.3 מ מ אורך בכל אזור תחת מיקרוסקופ פעם בשבוע.

2. מיצוי וטיהור של Phytohormones

  1. מכניסים כל אחד הצינורות מדגם 2-mL ארבע חרוז קריסטל 5 מ מ.
  2. חותכים את מקטעי אזורים אני הרביעי (לכל אורך ממ ב 2) באמצעות אזמל כירורגי על מגש אקריליק סטרילי.
  3. לאסוף שמונה מקטעים של כל אזור נפרד מדגם צינורות (10-30 מ"ג טריים משקל).
  4. שוקל, לאחר מכן להקפיא את הדגימות של חנקן נוזלי.
  5. לרסק את הדגימות קפוא באמצעות מהמגן המבוסס על חרוז.
  6. להשעות את הדגימות כתוש ב 1 מ"ל acetonitrile המכילות 500 pg של כל תקן פנימי של אוקסין ואת הגרביים (ד5- רשות העתיקות, d5- ט ז, ד5- תצרוכת, ד6- iP, ד6- ריבית) באמצעות מערבל מערבולת.
  7. להחזיק ב 4 ° C עבור 1 h ולאחר מכן צנטריפוגה-3,500 × g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. לשטוף את צניפה ב- 80% (v/v) acetonitrile המכיל חומצה אצטית 1% (v/v). צנטריפוגה שוב ב 3,500 × g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשלב את supernatants (מתוך שלבים 2.7 ו- 2.8) שפופרת זכוכית חד פעמיות.
  9. להוסיף 600 µL מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v) כל תגובת שיקוע משולב, והם מתאדים את acetonitrile באמצעות רכז ואקום.
  10. Equilibrate הידרופיליות-lipophilic-מאוזן מחסניות עמודה (HLB) על-ידי החלת 1 מ"ל כל של acetonitrile, מתנול מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v).
  11. להחיל פתרון אחד מדגם מכל מחסנית HLB equilibrated.
  12. לשטוף את מכלי הדיו עם 1 מ"ל מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v).
  13. Elute הורמונים כל עם 2 מ ל 80% (v/v) acetonitrile המכיל 1% (v/v) חומצה אצטית שפופרת זכוכית.
  14. להתנדף את acetonitrile, eluate כדי לקבל תמצית במים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v) באמצעות רכז ואקום.
    הערה: לא יבש זה לחלוטין.
  15. Equilibrate מחסניות העמודה מצב מעורב, חזק-קטיון (MCX) על-ידי החלת acetonitrile 1 מ"ל, 1 מ"ל מתנול, 0.5 מ"ל 0.1 M HCl ו 1 מ"ל מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v).
  16. להחיל פתרון אחד מדגם מכל מחסנית MCX equilibrated.
  17. לשטוף את מכלי הדיו עם 1 מ"ל מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v).
  18. Elute רשות העתיקות עם 2 מ ל 30% (v/v) acetonitrile המכיל 1% (v/v) חומצה אצטית שפופרת זכוכית.
  19. לשטוף את מכלי הדיו עם 2 מ ל 80% (v/v) acetonitrile המכיל חומצה אצטית 1% (v/v).
  20. לשטוף את מכלי הדיו עם 2 מ"ל מים ו- 1 מ"ל מים המכילים אמוניה מימית 5%.
  21. Elute את הגרביים עם 2 מ ל 60% (v/v) acetonitrile המכילים אמוניה מימית 5% שפופרת זכוכית.
  22. להתאדות הממיס של כל שבר הורמון באמצעות רכז ואקום ולאחסן ב −30 ° C עד הניתוח LC-MS/MS.

3. LC-MS/MS ניתוח של רשות העתיקות ואת הגרביים

  1. להמיס כל תמצית הורמון בשפופרת עם 600 µL של מתנול ולהעביר את הפתרון בקבוקון התאוששות מוחלטת של הצוואר בורג. להתנדף הממס באמצעות רכז ואקום.
  2. להמיס את השבר רשות העתיקות ב 20 µL 30% (v/v) acetonitrile, ושברים CK במים 20 µL המכיל 1% (v/v) חומצה אצטית ב בורג הצוואר התאוששות מוחלטת בקבוקונים.
  3. לנתח את הדגימות במצב יון חיובי על מערכת MS טריפל-פאול מצויד עם מערכת HPLC.
    הערה: אנו הגדרת התנאים HPLC כמפורט בטבלה1.
    1. עבור • תנאי רשות העתיקות, להשתמש הדרגתי בינארי של 5% - 50% ממס B יותר מ 7 דקות, ואז להגדיל על ידי 98% ממס B להחזיק 1 דקות ו ואז equilibrate למשך 2 דקות ב 5% ממס B בזריקה הקן.
    2. לשימוש • תנאי CK, שיפוע בינארי של 2% - 40% ממס B מעל 5 דקות, 40-70% ממס B ב- 7 דקות, ואז להגדיל על ידי 95% ממס B להחזיק 1 דקות, ואז equilibrate למשך 2 דקות ב 2% ממס B על ידי לקנן הזרקה.
    3. הגדר את יינון ספקטרומטריית electrospray (ESI)-MS פרמטרים של יון מקור כמפורט בטבלה מס ' 2.
  4. השתמש התגובה מרובים ניטור (MRM) המעבר על כימות של כל analyte המופיעה בטבלה 3.
  5. לכמת רשות העתיקות אנדוגני ורמות CK מפני עיקול רגיל של היחס בין ללא תווית התווית על-ידי דאוטריום תקנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 בשבועst , יורה adventitious לא יצרו. השבוע 2nd , הופיע נצרי קטן. את 3rd ו 4 שבועותth , המספר יורה מוגברת בעיקר באזורי הפסגה (I ו- II) (איור 2א). בשבועה 5, המספר של נצרי היה כ- 7 בתוך אזור אני 5 באזור השני (איור 2B). לעומת זאת, רק כמה נצרי נוצרו באזורים III ו- IV.

לפני תרבות, רמת ר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לזהות את ההפצה של phytohormones מעורב organogenesis, חשוב להשתמש בחומרים המפעל שבו organogenesis יכול להיות שנצפו על ללא phytohormone בינוני, כי כאשר phytohormones exogenously חלות explants להשראת יורה או שורשים, הם משפיעים על כל explant, ולכן קשה להעריך את פלסטיות הטבועה של צמחים תאית התמיינות, organogenesis. נצרי adventitious יכולה להיגרם על phytohormone ללא התקשורת תרבות מינים אחרים כגון ל' ציפורן caryophyllus 11Corrêa Aegle marmelos (ל')12, Pennell...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו אסירי תודה למורקאמי אקירה מר המחלקה של החיים יישומית באוניברסיטה Toyo, מר Koudai Taniguchi של מרכז טכנולוגיה לחקלאות גאנמה לסיוע טכני שלהם אנו אסירי תודה גם פרופסור Shosaku Kashiwada של ד ר Uma Maheswari מאיה לרר, Toyo האוניברסיטה לקבלת הצעות שלהם. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי המרכז לחקר החיים, מדעי הסביבה, אוניברסיטת Toyo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
[2H5] חומצה אינדול-3-אצטיתOlchemlm Ltd031 1531תקן פנימי עבור LC-MS / MS
[2H5] טרנס-זיאטיןOlchemlm Ltd030 0301תקן פנימי עבור LC-MS / MS
[2H5] טרנס-זיאטין ריבוזידOlchemlm Ltd030 0311תקן פנימי עבור LC-MS / MS
[2H6] N6-isopentenyl adenineOlchemlm Ltd030 0161תקן פנימי עבור LC-MS / MS
[2H6] N6-isopentenyl adenosineOlchemlm Ltd030 0171תקן פנימי עבור LC-MS /
MS אינדול-3-חומצה אצטיתWako098 00181תקן עבור LC-MS / MS
טרנס-זיאטיןSIGMA-ALDRICHZ0876 תקן 5MGעבור LC-MS /
MS טרנס-זיאטין ריבוזידWako262 01081תקן עבור LC-MS / MS
N6-isopentenyl אדניןSIGMA-ALDRICHD7674 תקן 1Gעבור LC-MS/MS
N6-isopentenyl אדנוזיןACROS ORGANICS22648 1000תקן עבור LC-MS/MS
אצטוניטריל היפרגראד עבור LC-MS LiChrosolvMERCK1.00029.1000ממס עבור LC-MS/
MS מים לכרומטוגרפיה LiChrosolvMERCK1.15333.1000ממס עבור LC-MS/MS
HPLCSHIMADZUבולטות
MSSciex3200QTRAP
אואזיס HLB 30 מ"ג/1 סמ"קווטרסWAT094225 עמודת מחסנית
אואזיס MCX 30 מ"ג/1 סמ"קמחסנית מים186000252עמוד
בורג צוואר בקבוקון התאוששות כולל בקבוקון ווטרס
, 12 x 32 מ"מ מכסה צוואר בורג ומחיצת PTFE/סיליקוןמים
Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 מ"מווטרס186002350עמודת UPLC
Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 מ"מAgilent699775-902עמודת UPLC
מיקרוסקופ דיגיטליLeicaDHS1000
רקמות Lyser IIQIAGEN85300
להב כירורגינוצהמס' 22
ידית אזמלנוצהמס' 4
Savant SpeedVac/מלכודת אדים מחודשתThermo Fisher ScientificSPD111/RVT4104רכז ואקום
טופ זכוכית חד פעמי (13x100 מ"מ)IWAKI9832-1310
צלחת פטריסטרילית INA OPTICAI-90-20
כחול 186002805186000274

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
  2. Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
  4. Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
  5. Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
  6. Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
  7. Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
  8. Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
  9. Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
  10. Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
  11. Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
  12. Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
  13. Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
  14. Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
  15. Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
  16. Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
  17. Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LC MS MS

מאמרים קשורים