לצבירת ראיות תומך ברעיון כי אגרגטים חלבון פתוגניים המשויך מחלות ניווניות להפיץ בין תאים עם תכונות כמו פריון. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת ויזואליזציה בהפצת לתא של פריון כמו אגרגטים באורגניזם מודל, melanogaster דרוזופילה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניטור-לתא שידור של אגרגטים חלבון פריאון-כמו בדרוזופילה Melanogaster
במאמר זה
סיכום
תקציר
צבירת חלבון הוא מאפיין מרכזי של רוב מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD) נוירודגנרטיביות (ALS). אגרגטים חלבון קשורים קשר הדוק עם neuropathology במחלות אלה, למרות המנגנון המדויק שבו צבירת חלבון aberrant משבש הומאוסטזיס סלולרית רגילה לא ידוע. מתעוררים נתונים מספקים תמיכה חזקה על ההשערה את צבירות פתוגניים לספירה, PD, HD, ALS יש קווי דמיון רבים כדי prions, שהינם חלבונים בלבד מדבקים אחראי encephalopathies spongiform מדבקות. Prions עצמית שכפל באמצעות תבניות ההמרה של מקופלת מקורי גירסאות של החלבון אותו, גורם התפשטות פנוטיפ צבירה. איך prions וחלבונים כמו פריון לספירה, מהלך PD, HD ו- ALS מתא אחד למשנהו הוא כיום שטח של חקירה אינטנסיבית. כאן, מתואר מודל דרוזופילה melanogaster המאפשר ניטור של שידור כמו פריון, מתא לתא של אגרגטים מוטציה huntingtin (Htt) המשויך HD. מודל זה מנצל כלים רבי-עוצמה מניפולציה transgene ביטוי ברקמות דרוזופילה שונות רבות, מנצל חלבון cytoplasmic מתויג fluorescently ישירות דוח העברת פריון כמו מוטציה אגרגטים Htt. חשוב מכך, הגישה שנתאר כאן יכול לשמש כדי לזהות גנים הרומן משעולים המתווכות התפשטות של אגרגטים חלבון בין סוגי תאים שונים vivo בתוך. מידע ממחקרים אלה ירחיב את ההבנה מוגבלת של המנגנונים פתוגניים אשר מושתתות מחלות ניווניות ולחשוף הזדמנויות חדשות התערבות טיפולית.
מבוא
ההשערה פריון נקבע כי הסוכן זיהומיות אחראי מדבקות spongiform encephalopathies (למשל, מחלת קרויצפלד - יעקב בבני אדם, scrapie כבשים, מחלה כרונית לבזבז צבאים, איילים, "מחלת הפרה המשוגעת" בבקר ) מורכב אך ורק של חלבון של חומצות גרעין1. מחלות פריון, החלבון פריון הסלולר (PrPC) ההנחה היא שנוצרה, יציב קיפול (PrPSc) מאוד בטא גיליון עשיר, באפשרותך להפיץ עצמית על ידי המרת וגיוס monomeric מולקולות PrPC לתוך עמילואיד יציב אגרגטים. PrPSc אגרגטים להשתמש במנגנון הזה המשכפלת להפיץ בין תאים שונים באורגניזם, אפילו בין אורגניזמים נפרדים2.
חלבון misfolding צבירת ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. צימוד Gal4 ו QF-בתיווך Htt Transgene ביטוי דרוזופילה
- לאסוף ו/או ליצור הטרנסגניים דרוזופילה melanogaster שורות המכילה רקמות ספציפיות Gal4 או ליטראות "מנהלי", כמו גם קווי המכיל פראי-סוג או מוטציה Htt transgenes במורד הזרם של Gal4-UAS38 או QF-QUAS39. ודא החלבונים באים לידי ביטוי מן transgenes הללו מאוחה חלבונים פלורסנט או מתויג epitope כדי לאפשר בידול של מוטציות ובני פראי-סוג Htt transgene מוצרי הזבוב באותו. ראה איור 1.
הערה: אנחנו בדרך כלל משתמשים אקסון 1 שברי הגן האנושי Htt27. עם זאת, ניתן להפיק זבובים הטרנסגניים במקום לבטא את שברי Htt....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השיטות המתוארות כאן להפיק נתונים להדגים פריון, כמו העברה של אגרגטים חלבון Htt מאוכלוסיה תא אחד למשנהו בתוך הזבוב ללא פגע CNS. המרה של Htt פראי-סוג של ' מאטום לשקוף ' punctate הוא ציין על-ידי קרינה פלואורסצנטית ישירה של חלבון כימרי זה YFP עכשיו, הנמען דונלד כתוצאה HttQ91-mCherry ביטוי ORNs התורם (איור 2A-C ואיור 4A, B). דיווח מדויק של אירועים כמו פריון העברה בין אוכלוסיות שני תאים אלה דורש בחירה ז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המספרים של חולים הסובלים ממחלות ניווניות ממשיך לגדול, יש צורך דחוף להגדיל את ההבנה של פתוגנזה מולקולריים של מחלות אלו כך ניתן לפתח טיפולים טובים יותר. כאן, אנו מתארים שיטות המאפשרות לניטור פריון כמו שידור של אגרגטים חלבון פתוגניים בין סוגי תאים שונים באורגניזם מודל, melanogaster דרוזופילה. לאחרונה השתמשנו מתודולוגיה זו כדי להדגים פריון כמו שידור של מוטציה Htt אגרגטים ויוו וכדי לזהות קולטן phagocytic המעביר התפשטות אלה אגרגטים של נוירונים עד עכשיו, דונלד27. הגישה שלנו מנצלת מספר י.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים חברים של מעבדות Kopito לואו, פירס דיונים מועילים רבים במהלך פיתוח שיטות אלה. אנו מודים גם בריאן Temsamrit לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מאוניברסיטת למדעים ונאמנויות צדקה של וו. סמית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מי מלח חוצץ פוספט (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | מדולל ל-1X |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
| Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
| 20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| סרום עיזים רגיל (NGS), Lampire מסונן | מעבדות ביולוגיות | 7332500 | יש להקפיא ולהקפיא עם הקבלה |
| עוף נגד GFP | Aves Labs | GFP-1020 | שימוש בדילול של 1:500 ארנב |
| נגד DsRed | Clontech | 632496 | שימוש בדילול של 1:2000; יכול לזהות חלבונים פלואורסצנטיים מבוססי DsRed (למשל mCherry, mStrawberry, tdTomato, וכו') |
| עכבר נגד Bruchpilot | מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה | nc82 | השתמש בדילול 1:100; יסמן מבנים פרה-סינפטיים פעילים למרות מוח הזבוב |
| FITC אנטי עוף | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | השתמש ב 1:250 דילול |
| Alexa Fluor 568 אנטי ארנב | Life Technologies | A11011 | השתמש ב 1:250 דילול |
| Alexa Fluor 647 נוגדן נגד עכבר | חיים טכנולוגיות | A21235 | שימוש ב-1:250 דילול |
| Slowfade Gold Antifade | Reagent Life Technologies | S36936 | |
| שקופיות מיקרוסקופ (25 x 75 x 1.0 מ"מ) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| כיסוי זכוכית (22 x 22 מ"מ) | Globe Scientific | 1404-15 | |
| Dumont Biology Grade מלקחיים, סגנון 3 | טד פלה | 503 | שימוש ביד לא דומיננטית |
| Dumont ביולוגיה כיתה מלקחיים, סגנון 5 | טד פלה | 505 | שימוש ביד דומיננטית |
| LAS X תוכנת ניתוח תמונות | Leica | ||
| Imaris תוכנת ניתוח תמונות | Bitplane |
מקורות
- Prusiner, S. B. Biology and genetics of prions causing neurodegeneration. Annu Rev Genet. 47, 601-623 (2013).
- Haïk, S., Brandel, J. P. Infectious prion diseases in humans: Cannibalism, iatrogenicity and zoonoses. Infect Genet Evol. 26, 303-312 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
