מאמר שיטה

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

DOI:

10.3791/56912

⸱

8 בינואר 2018

 ,  , 
1R&D Department, Cytoskeleton Inc.

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חוקרים רבים, שינויים post-translational אנדוגני על חלבון המטרה יכול להיות מאוד מאתגר. טכניקות המתוארים כאן לנצל את פירוק ממוטבת מאגר ומסנן מערכת שפותחה עם ספציפי PTM פילוח, מטריצות זיקה לזהות את השינויים זרחון acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 וטירוזין עבור מטרה חלבון באמצעות מערכת יחיד, יעיל.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכשיו זה היטב להערכה כי שינויים post-translational (PTMs) לשחק תפקיד חשוב בוויסות של חלבון מבנה, תפקוד, אשר עשוי להיות חיוני לתפקיד של חלבון נתון הן מבחינה פיזיולוגית והן מבחינה פתולוגית. העשרה של PTMs יש צורך לעיתים קרובות כאשר חוקרת את מצב PTM חלבון המטרה, משום PTMs הם בדרך כלל חולפים, נמוכה יחסית שפע. רבים החסרונות הם שאירעה בעת מועילות PTM של חלבון היעד, כגון מאגר התאמה הנוגדן חלבון המטרה אינה תואמת-IP, לאבדן קשר PTM ואחרים. דרגת קושי מוגדל כאשר חוקרים PTMs מרובים כמו acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 וטירוזין זרחון על חלבון המטרה הנתונה. לימוד שילוב של אלה PTMs ייתכן שיהיה צורך, כמו crosstalk בין PTMs היא שכיחה וקריטיות עבור רגולציה חלבון. לעתים קרובות, אלה PTMs נלמדים במאגרי פירוק שונים ועם יצירות מעכב ייחודי. כדי לפשט את התהליך, מערכת פירוק denaturing ייחודי שפותח את זה ביעילות מבודד ושומר PTMs ארבע אלה; ובכך, מאפשר חקירת crosstalk פוטנציאליות במערכת פירוק יחיד. מערכת סינון ייחודי תוכנן כדי להסיר מזהמות דנ א גנומי מן lysate, אשר הוא תוצר לוואי בעייתיות של denaturing מאגרי. מטריצות זיקה חזקה מיקוד כל אחד PTMs ארבע פותחו בתיאום עם מערכת מאגר כדי למקסם את העשרה וזיהוי המדינות אנדוגני של אלה PTMs 4. הכלים לזיהוי מקיף זה PTM מייעלת את התהליך של קבלת מידע חיוני אודות אם חלבון הוא שונה על-ידי אחת מהפעולות אלה PTMs.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים post-translational (PTMs) הן בעלות רגולציה שינויים ל חלבון, לפיה השינוי הוא שנוספו או הוסרו באופן ספציפי. PTMs לעיתים דינמי, ארעית השינויים לשנות משמעותית את המבנה של החלבון, אינטראקציות עם השותף חלבונים, לוקליזציה המרחבי, ואני בסופו של דבר המאפשר החלבון לבצע פונקציות שונות1,2 , 3 , 4. PTMs נפוצים כל כך הם להגדיל את מספר הטפסים חלבון ייחודי (או proteoforms) ממוצרים ג'ין כ-30,000 מעל למיליון proteoforms5,6. זיהוי PTMs והגדרת את השפעתם על חלבון המטרה היא קריטית לכיוון ההבנה של החלבון פונקציות פיזיולוגיים ופתולוגיים7,8,9,10, 11,12,13,14. לעבוד על חלבונים בחר כאילו טובולין, p53, קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) יש מבואר התפקידים הרגולציה של16,PTMs15,17. מחקרים אלה חשפו את העובדה כי ויסות של חלבונים אלו מתרחשת על ידי מספר PTMs, במקרים רבים לבצע שינויים אלה לעבוד ביחד כדי לקדם את תפקיד ספציפי. מחקרים חדשים הראו כי crosstalk PTM שיתופיות והן שליליות יכול להתרחש על מספר חלבונים שונים18,19,20,21,22, 23,24,25. עם זאת, הפרופילים PTM של הרוב של חלבונים בנויים מ מספר מחקרים בהם השתמשו מודלים שונים ותנאים ייחודיים. מערכת אופטימיזציה לחקור PTMs מרובים במערכת אחת יהיה מאוד מועיל לזכות בתובנה crosstalk PTM פוטנציאליים על חלבון המטרה.

אתגר אחד עם חוקרים PTMs במערכת יחיד הוא PTMs ספציפיים נחקרות באמצעות מאגרים נפרדים פירוק. לדוגמה, הניצול של כמו ריפה או NP-40 מאגרי משמשים בדרך כלל עבור חקירות זרחון או ubiquitination עשוי להיות לקוי לימוד של PTM יציב כמו אוביקוויטין דמוי קטן משנה (סומו) ylation26. בנוסף, מאגרים שאינן denaturing אינם הולמים עבור אינטראקציות חלבון בריא, והוא יכול להוביל שווא חיוביים PTM זיהוי27. חוקרים PTMs במאגר פירוק denaturing עשוי להיות המועדפת, כפי שזה עדיף באופן משמעותי לבודד את החלבונים של תאים סלולריים כל28, מביצועם רוב אינטראקציות חלבון, ימנע פרוטאזות שמשנות את הברית PTM, כגון deSUMOylases 26; עם זאת, denaturing מאגרי עשוי להתפשר על היושרה של אחווה מסוימות ריאגנטים כגון אוביקוויטין מחייב הכלים המבוססים על תחום27. פיתוח מערכת פירוק denaturing, כמו ללמוד מספר PTMs של חלבון בכל מערכת תואמת ריאגנט זיקה יהיה מאוד מועיל עבור PTM crosstalk חקירות.

למרות מאגרי denaturing מפתח יתרונות שאינם denaturing מאגרים עבור חוקרים PTMs, הם משמשים פחות שכיח בגלל החסרונות שלהם משמעותית, כגון אי-תאימות עם חלבון קונבנציונאלי מבחני, משמעותי גנומית זיהום חומצה deoxyribonucleic (DNA), הפרעה ריאגנטים immunoprecipitation (IP)29. מחסרונות אלה עלולה לגרום נזק פוטנציאלי וזמן הכנה מורחבת חלבונים היעד בעת הטיית ה-DNA גנומי. שתי השיטות הנפוצות להטיית DNA כוללים מזרק פירוק ו sonication29. שתי השיטות מחייבות אופטימיזציה מקיפה, לעתים קרובות חוסר הפארמצבטית מדויק. שיטות אלטרנטיביות כדי להסיר את ה-DNA גנומי כוללים התוספת של DNAses; עם זאת, זה עשוי לדרוש מיטוב נוספות ושינויים בהרכב מאגר. בסופו של דבר, שיטה פשוטה לשחזור להסרת זיהום דנ א גנומי יהיה מועיל כאשר עובדים עם denaturing פירוק מאגרי PTM החקירות.

המטרה של טכניקה זו היא לפתח מערכת לבודד ולחקור ubiquitination (Ub), זרחון טירוזין (pY), SUMOylation 2/3 (סומו 2/3) ו- PTMs acetylation (Ac) ב מערכת יחידה לחקור יותר PTM crosstalk על חלבון המטרה. זו מערכת איתור PTM היה מנוצל לחקור במהירות את הפרופיל PTM אנדוגני של מספר חלבונים היעד במערכת אחת. תובנה חדשה crosstalk פוטנציאליים היה מזוהה30,31. בסך הכל, בטכניקה המתוארת כאן שיפור שיטות קיימות כדי לחקור את PTMs ואת PTM crosstalk בשלוש דרכים שונות: 1) מאגר denaturing ייחודי פותחה שמבודד חלבונים מכל התאים הסלולר, אך שהם עדיין תואם PTM זיקה ריאגנטים, 2) מערכת סינון ייחודי פותחה במהירות מסיר זיהום דנ א גנומי שפגע בסימני lysates עם הפארמצבטית גבוהה ולא דורש שום ציוד מיוחד, ו- 3) החרוזים זיקה חזקה, פירוק מערכת, או מעכבות ריאגנטים תואמים; לפיכך, פישוט בידודו של אלה PTMs ארבע על חלבון המטרה להגדיל את העשרה PTM, ולבחון ביעילות crosstalk פוטנציאליים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה לדוגמה: תרבית תאים

  1. מגדלים ארבעה לוחות 150 מ מ של תאים A431 ששינה הנשר של Dulbecco בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור בעובר.
    1. לגדול התאים A431 50% confluency.
    2. סרום להגביל את ארבעת הלוחות של תאים A431 עם סרום ללא DMEM במשך 24 שעות ביממה.
    3. פנקו שתי צלחות של תאים A431 עם 33.3 מ"ג/מ"ל של גורם הגדילה באפידרמיס עבור ח' 1 תשאיר את שאר הצלחות שני לא מטופל.
      הערה: תא תנאי גידול וטיפול המוצגת כאן מספקים דוגמא; עם זאת, מתודולוגיה זו ישימה על רבים לסוגי תאים שונים ותנאי הטיפול.
  2. להכין blastR מאגרי פירוק ודילול כמקובל עם מעכבי (טבלה 1). משלבים מ 2.895 ל blastR פירוק מאגר µL 15 של טירוזין phosphatase מעכב, µL 30 deubiquitinase, מעכב deSUMOylase, µL 30 של היסטון deacetylase (HDAC) מעכב ו 30 µL של מעכב פרוטאז קוקטייל.
    1. משלבים mL 9.65 מאגר דילול blastR µL 50 של טירוזין phosphatase מעכב, µL 100 deubiquitinase deSUMOylase מעכב, 100 µL של היסטון מעכב deacetylase (HDAC), ואת µL 100 של מעכב פרוטאז קוקטייל.
      הערה: ראה טבלה של חומרים עבור הרכב מאגר מידע מעכב.
  3. יוצקים את התקשורת תרבות ולמקם את התאים על קרח. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מ ל 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS).
    1. להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר לפני הוספת blastR מאגר פירוק כדי למקסם את פירוק התא.
      הערה: ראה טבלה של חומרים עבור מאגר הרכב.
  4. הוסף µL 600 blastR מאגר פירוק של כל צלחת 150 מ מ. הכמות של מאגר מבוסס על התשואה הצפויה חלבון (טבלה 2).
    1. Lyse התאים באמצעות המגרד של התא. Lysate יהפוך צמיגה עקב פירוק גרעיני.
  5. השתמש טיפ פיפטה כשתשמור 1 מ"ל להעביר את גולמי lysate לתוך מסנן blastR הונח צינור אוסף 15מל (איור 1). . הנה, משמש צינור בז 15 מ"ל.
  6. השתמש פומפה מסנן שסופקו לחלוטין לדחוס את המסנן blastR ולאסוף את lysate הזרימה דרך, כולל כל הבועות, צינור 15מל (איור 1).
  7. אופציונלי: העברת הבהיר lysate tube microcentrifuge 1.5 mL ו צנטריפוגה lysate כ- 10,000 x g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
    1. להעביר את תגובת שיקוע צינור בז 15 מ"ל.
  8. לדלל את שקופה lysate עם blastR מאגר דילול לאמצעי הסופי של 3 מ עבור כל צלחת 150 מ מ. הכרך האחרון מבוסס על התשואה הצפויה חלבון (טבלה 2).
    הערה: שלב זה חשוב כמו ההרכב הסופי מאגר ישפיע לכתחילה התגובה של IP.
  9. Quantitate ריכוז חלבון (סעיף 2).

2. שיטת כימות

הערה: לנצל assay כימות של חלבון ערכי צבע מוחלטים הסטנדרטי לקביעת חלבון כימות. כאן, כימות חלבון נקבע באמצעות דיוק חלבון מתקדם אדום וזמינותו.

  1. להוסיף 1 מ"ל של דיוק חלבון מתקדם אדום assay מגיב לכל אחד שני וואקום 1 מ"ל.
  2. µL מיקס 10 של מאגר פירוק blastR, µL 40 blastR דילול המאגר בצינור microcentrifuge mL 1.5 נקי על קרח.
    הערה: זה ישמש עבור קריאת הדגימה חלבון ריק.
  3. להוסיף 20 µL של המיקס מאגר פירוק/דילול (מתוך שלב 2.2) cuvette הראשון, שילוב על-ידי היפוך פעמיים עד שלוש פעמים.
  4. הוסף 20 µL של התא מדולל lysate (מתוך הניסוי) כדי cuvette השני, ערבוב לעיל.
  5. דגירה בדגימות עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. ספקטרופוטומטרים ריק עם הדגימה שילוב מאגר פירוק/דילול (מתוך שלב 2.3).
  7. למדוד את ספיגת מדגם lysate (מתוך שלב 2.4)-600 ננומטר.
  8. לקבוע ריכוז חלבון lysate כדלקמן:
    דוגמה הקריאה OD600 x 5 = ריכוז חלבון ב מ"ג/מ"ל
    הערה: קריאות OD מתחת 0.05 או מעל 0.5 קרובים הקיבולת טווח ליניארי של חלבון וזמינותו. עבור קריאות > 0.5, דגימות יכול להיות מדולל. עבור קריאות < 0.05, lysate יותר ניתן להוסיף דיוק חלבון מתקדם אדום assay הכימית (עד 50 µL). ראה טבלה 3 עבור מכפילי כדי להמיר ספקטרופוטומטרים קריאות ריכוז חלבון lysate מ"ג/מ"ל. אם יש חלבון מספקת בצלחת אחת, מומלץ להשתמש לוחות 2 או יותר לפי IP. במקרה זה, יהיה לקצור הצלחות בסדרה, מעביר את µL 300 המקורי של פירוק מאגר בין לוחות.
  9. על סמך ריכוז חלבון, לדלל מדגם עם שילוב מאגר (פירוק blastR חלק 1: 4 חלקים blastR דילול) כדי ריכוז הסופי הרצוי (בדרך כלל 1 mg/mL).
  10. הצמד להקפיא aliquots והמדגמים לא ישמש באופן מיידי.
    1. מאגר דגימות ב-70 מעלות צלזיוס.
    2. המשך סעיף 3.

3. Immunoprecipitation (IP) Assay

הערה: חרוז ריכוזים זיקה, ריכוזי lysate ושעות הדגירה מומלצים הנחיות, עשויות להיות ייחודיות לכל חלבון המטרה או ספציפיים PTM נחקר.

  1. צינורות ריאגנט מניות ' היפוך ' המכיל Ub זיקה חרוזים, חרוזים זיקה pY, סומו זיקה 2/3 חרוזים ו Ac זיקה חרוזים מספר פעמים כדי לוודא החרוזים הם לגמרי resuspended בצינור.
  2. עבור כל IP assay, חרוז aliquot ההשעיה לתוך צינורות microcentrifuge mL 1.5 נפרד על קרח (IP הצינור). כאן, להוסיף 20 µL של חרוזים זיקה אוביקוויטין, µL 30 phosphotyrosine זיקה החרוזים, 40 µL של SUMOylation 2/3 זיקה חרוזים או µL 50 של acetylation זיקה חרוזים בודדים mL 1.5 צינורות microcentrifuge על הקרח.
    הערה: ראה טבלה 4 עבור אמצעי האחסון המומלץ של חרוז השעיה לשימוש עבור כל חרוז זיקה.
  3. צינורות ריאגנט מניות ' היפוך ' המכיל ubiquitination IP שליטה חרוזים, חרוזים שליטה IgG מספר פעמים כדי לוודא החרוזים הם לגמרי resuspended בצינור.
  4. שליטה aliquot חרוזים לכל בקרת תגובת כדי לקבוע מחייב שאינם ספציפיים (שליטה IP הצינור). כאן, להוסיף 20 µL של חרוזים שליטה Ub, 30 µL של חרוזים שליטה pY, µL 40 של סומו שליטה 2/3 חרוזים או µL 50 של Ac שליטה חרוזים בודדים mL 1.5 צינורות microcentrifuge על הקרח.
    הערה: ראה טבלה 4 עבור אמצעי האחסון המומלץ של חרוז השעיה לשימוש עבור כל סוג של זיקה חרוז.
  5. לשמור כמות קטנה של lysate (20 µL) לפעול כפי תספיג קלט השליטה lysate. הוסף µL 5 5 x דוגמת המאגר, להרתיח ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    הערה: ראה טבלה של חומרים עבור מאגר הרכב.
  6. הוסף lysate כל IP צינור, צינור IP שליטה. . הנה, 1 מ ג של lysate שימש לכל תגובה IP ושליטה, וכתוצאה מכך סכום כולל של 8 תגובות IP.
    הערה: 1.0 מ"ג של lysate לכל assay מומלצת כנקודת התחלה. הסכום של lysate יהיה צורך להשתנות בהתאם השפע של חלבון היעד שונה.
  7. דגירה הצינורות על פלטפורמה מסתובבת מעל קצה-ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. כאן, מסובב צינור ATR שימש במהירות 22.
  8. לאסוף חרוזים על ידי צנטריפוגה-3000-5000 g x עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
  9. וארוקן את תגובת שיקוע רב ככל האפשר מבלי להפריע את החרוזים.
  10. רחץ חרוזים ב 1 מ"ל blastR מאגר לשטוף (מעכבי אינם הכרחיים בשלב זה) למשך 5 דקות על 4 ° C מסתובב פלטפורמה.
  11. לאסוף חרוזים על ידי צנטריפוגה-3000-5000 g x עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
  12. וארוקן את תגובת שיקוע רב ככל האפשר מבלי להפריע את החרוזים.
  13. חזור על השלב לשטוף (שלבים 3.10-3.12) עוד פעמיים.
  14. לאחר השטיפה הסופית להסיר לחלוטין את מאגר תגובת שיקוע. הפרעה מזערית של בגדר חרוז מקובל (עד 5% הפסד). הסר תגובת שיקוע שיורית באמצעות קנס נשא חלבון טעינת עצה.
  15. הוסף µL 30 מאגר • תנאי חרוז, resuspend את החרוזים על ידי בעדינות הקשה/מצליף הצד של הצינור. אל תשתמש פיפטה בשלב זה.
    הערה: ראה טבלה של חומרים עבור מאגר הרכב.
  16. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  17. בעדינות העבר ההשעיה חרוז כל עמודה ספין microcentrifuge 1.5 mL הונח צינור microcentrifuge 1.5 mL.
    הערה: מומלץ לבדוק בסוף את הטיפ פיפטה העברה להעברה עדינה אותך...
  18. צנטריפוגה ב-10,000 9,000 g x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאסוף את דגימת ה-IP.
  19. להוסיף 2 µL של מרקפטואתנול כל מדגם ומערבבים היטב.
    הערה: זה נוח להצמיד את המכסה העמודה ספין ולהשתמש זה קאפ הצינור אוסף עיבוד נוסף.
  20. במקום דגימות באמבט מים 95 ° C עבור מדגם לאסוף 5 דק על ידי צנטריפוגה-g x 10,000 עבור 1 דקות ב- RT.
  21. במידת הצורך, לאחסן דגימות ב-70 מעלות צלזיוס, לעצור כאן, או להמשיך לרוץ מרחביות-דף, העברה, וניתוח תספיג (סעיף 4).

4. תספיג ניתוח: זיהוי החלבון עניין

  1. דוגמאות נפרדות על-ידי dodecyl נתרן גופרתי לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) ולהעביר קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים מעבדה32.
  2. להשתמש של נוגדן ראשוני כדי לזהות את גרסאות post-translationally של החלבון עניין. כאן, PD-L1 נוגדן שימש כדי לזהות post-translationally ששונה PD-L1.
  3. השתמש chemiluminescence העדינה זיהוי ריאגנט לזיהוי.
    הערה: הכימית chemiluminescent אמור לשמש בשילוב עם התווית על-ידי HRP משני נוגדן מסוגלת לאתר נוגדן ראשוני.
  4. השתמש נפח של 2 מ של ריאגנט chemiluminescent לכל העברה mini-gel בגודל ממברנה (כ 8 x 7 ס"מ).
    1. לאחר דגירה עם נוגדן המשני המתאים (60 דקות ב RT מומלץ), לשטוף את האבן החשופה 6 x 10 דקות ב30 מ"ל תמיסת באגירה טריס עם tween-20 (TBST).
      הערה: ראה טבלה של חומרים עבור מאגר הרכב.
    2. מיד לפני השימוש, מערבבים 1 מ"ל של ריאגנט chemiluminescent A עם 1 מ"ל של ריאגנט chemiluminescent B (מספיק עבור ממברנה אחת 8 ס מ על 7 ס"מ).
    3. הוספת ריאגנט chemiluminescent ממברנה, דגירה עם נדנדה עדין-RT למשך 1-5 דקות לפני ויזואליזציה של האות חלבון באמצעות לסרטי רנטגן או תשלום מצמידים מכשיר (CCD) המצלמה הדמיה.
      הערה: דגירה קצר יותר, בתקופות הכימית chemiluminescent ייתכן שיהיה צורך שופע מאוד חלבונים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת של כלים אלה כדי לחקור PTM crosstalk על ידי גילוי ביעילות PTMs 4 אלה תלויה באופן חלקי מערכת מאגר ייחודי פירוק. המאגר denaturing blastR ביעילות מבודד חלבונים מכל התאים הסלולר באופן דומה מאגרי denaturing אחרים, אשר מבטיח פרופיל לחלבון מלא (איור 2 א). בנוסף, שומרת על אותות PTM מאוד יציב כמו סומו 2/3, אשר נחלש במהירות במאגרי denaturing כמו radioimmunoprecipitation assay (ריפה) (איור 2B). חשוב, כאשר מדולל כראוי, היא אינה משפיעה על שלמות ריאגנטים זיקה כמו מאגרי denaturing אחרים (למשל, מאגר Laemmli).

משוכה משמעותית בעת עבודה עם מאגרי denaturing הוא היכולת להסיר ביעילות זיהום הדנ א הגנומי. המתודולוגיה קונבנציונאלי להפחתת צמיגות היא להטות את הדנ א באמצעות מחט מזרק או sonicating את הדגימה. איור 3A מראה זיהום דנ א גנומי בתא A431 lysate לאחר הטיפול עם BlastR מסנן, מחט מזרק או sonication. יש הסרה כמעט מלאה של הדנ א באמצעות המסנן ' BlastR ', אשר אינה המקרה באמצעות מחט מזרק קונבנציונאלי או sonication. זיהום דנ א גנומי באופן משמעותי משפיע על חלבון העברה דרך ג'ל אקרילאמיד מרחביות; עם זאת, טיפול עם המסנן BlastR מסיר דנ א גנומי, וכתוצאה מכך חלבון נאותה העברה (איור 3B). שינו נדידת הנגרמת על ידי זיהום הדנ א הגנומי יכול להשפיע באופן משמעותי על פרשנות של שהכלים המערבי; לדוגמה, התבנית EGFR מרוח ראיתי את הבלתי מסוננת lysate עשוי שדבריהן להתפרש כביטוי מוגברת יחסית המדגם מסוננים (איור 3C).

על ידי ניצול מיטבי PTM העשרה וזיהוי במערכת זו, ניתן לקבוע במהירות אם חלבון המטרה משתנה על ידי אחד או יותר PTMs. החקירה של הפרופיל PD-L1 PTM לאחרונה בוצע בעזרת טכניקה זו, התוצאות הראו כי היה PD-L1 ubiquitinated, acetylated, טירוזין phosphorylated בתגובה EGF (איור 4). חשוב, נתונים אלה מדווחים שינויים PD-L1 PTM אנדוגני, אשר ייצג את אחוז קטן של PD-L1 הכולל מזוהה.

figure-results-1
איור 1: סינון DNA גנומי מתא lysate עם מסנן BlastR. מסנן תמונה של BlastR (א) . (B) Lysate נטען את המסנן בו הונח צינור אוסף 15 מ"ל. (ג) הבוכנה מושם לתוך המזרק, lysate מועברת דרך המסנן על-ידי דחיסה. (ד) לאסוף lysate, כולל כל הבועות באמצעות דחיסה מלאה. (ה) מסוננים lysate.

figure-results-2
איור 2: השוואה של מאגר פירוק BlastR כדי פירוק אלטרנטיבי מאגרי. איור 2A מ. Horita et al. 2017. Biosci. נציג. 31 (א) A431 התאים היו lysed עם BlastR ריפה, mPER, פירוק IP, Denaturing (1% מרחביות), ו Laemmli פירוק מאגרי. כל lysates denaturing היו DNA גנומי מוסר על-ידי מסנן BlastR. בידוד של חלבונים מן קרום, cytoplasmic, מיטוכונדריאלי, סמני גרעיני היו נחושים באמצעות נוגדנים נגד החלבונים סמן תא בהתאמה. (B) תאים A431 היו lysed עם BlastR, ריפה 1% מרחביות מאגר denaturing. Lysates היו immunoprecipitated עם הסומו 2/3 או פקד IgG זיקה חרוזים. הדגימות היו מופרדים על-ידי מרחביות-דף, נותחו על ידי תספיג באמצעות נוגדן 2/3-חזרת peroxidase (HRP) של סומו. נציג לחומה של N≥3 ניסויים עצמאית מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3
איור 3: BlastR פירוק סינון יעיל בהסרת הדנ א. (א) A431 התאים היו lysed עם מאגר פירוק denaturing. דנ א גנומי הוסר או לכסנתם עם מסנן BlastR, מחט מזרק או sonication 5, 10, 20 או 30 שניות. 2% lysate נותחה על ידי אתידיום ברומיד, agarose בג'ל. (B) Lysate מתאי A431 lysed עם מאגר denaturing לא מסונן או סינון עם המסנן ' BlastR '. דוגמאות הופרדו עם עמודים מרחביות, visualized באמצעות Coomassie הכתם. (ג) כפילויות דגימות B היו מופרדים על ידי עמודים מרחביות, הועבר PVDF, חלבון EGFR נבדקה באמצעות נוגדן EGFR. נציג שהכלים של N ≥ 3 ניסויים עצמאית מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4
איור 4: זיהוי של EGF-induced השינויים post-translational עבור PD-L1- איור מקורי Horita. et al. 2017. neoplasia30(א). סרום מוגבלת תאים A431 היו גם unstimulated (UT) או מגורה עם EGF למשך שעה אחת לפני פירוק עם מאגר פירוק BlastR. WCL נותחו עבור רמות PD-L1 (מסלולים 1, 2). אוביקוויטין איגוד חרוזים (UBA01) שימשו IP ubiquitinated חלבונים (נתיבים 3,4). חרוזים איגוד Phosphotyrosine (APY03) שימשו IP phosphorylated טירוזין חלבונים (נתיבים 5,6). סומו מחייב 2/3 חרוזים (ASM24) שימשו IP SUMOylated 2/3 חלבונים (נתיבים 7, 8). אצטיל ליזין איגוד חרוזים (AAC01) שימשו IP acetylated חלבונים (נתיבים 9,10). אג איגוד פקד חרוזים שימשו IP שאינם ספציפיים מחייבים חלבונים (נתיבים 11,12). דוגמאות היו מופרדים על-ידי מרחביות-דף, נותחו על ידי תספיג באמצעות נוגדנים PD-L1. אבן חשופה נציג מ- N ≥ 3 ניסויים עצמאית מוצג. כוכביות לבן שימשו לסימון PD-L1 pY ולהקות חלבון Ac. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

חישובים עבור מאגר פירוק BlastR
1.0 mL2.0 mL5.0 mL10.0 mL
מאגר BlastR פירוק965 ΜL1930 ΜLמ ל 4.825מ ל 9.650
טירוזין phosphatase מעכב5 ΜL10 ΜL25 ΜL50 ΜL
מעכב דה-ubiquitinase/דה-sumoylase10 ΜL20 ΜL50 ΜL100 ΜL
HDAC מעכב10 ΜL20 ΜL50 ΜL100 ΜL
מעכב פרוטאז קוקטייל10 ΜL20 ΜL50 ΜL100 ΜL
חישובים עבור מאגר דילול BlastR
מ ל 4.08.0 mL20.0 מ"ל40.0 מ
מאגר BlastR פירוק3.86 mL7.72 mL19.3 mL38.6 mL
טירוזין phosphatase מעכב20 ΜL40 ΜL100 ΜL200 ΜL
מעכב דה-ubiquitinase/דה-sumoylase40 ΜL80 ΜL200 ΜL400 ΜL
HDAC מעכב40 ΜL80 ΜL200 ΜL400 ΜL
מעכב פרוטאז קוקטייל40 ΜL80 ΜL200 ΜL400 ΜL

טבלה 1: פירוק ודילול כמקובל מאגר הכנת תרשים- תרשים מתן ריכוזים של מעכבי להוסיף עבור פירוק ודילול כמקובל מאגר נפח נתון בעת הכנת אנשים רגילים עבור פירוק התא.

תכולת החלבון צלחתנפח BlastR פירוק מאגר מומלציםנפח BlastR דילול מאגר מומלצים
< 1 מ גשילוב החלבון של לוחות מרוביםכדי להפוך את נפח סופי 1.5 mL
1-2 מ ג300 ΜLכדי להפוך את נפח סופי 1.5 mL
2-4 מ ג600 ΜLלהכין 3 מ"ל נפח סופי
4-6 מ ג900 ΜLכדי להפוך 4.5 מ"ל נפח סופי

בטבלה 2: BlastR פירוק/דילול מאגר תרשים. תרשים מתן מומלץ פירוק ומסוג מאגר דילול בעת קבלת lysate.

נפח תא lysate להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט דיוק אדום חלבון Assay (µL)מכפיל לשימוש עם דגימת קריאה OD600
1010
205
303.3
402.5
502

טבלה 3: מכפילי כדי להמיר ספקטרופוטומטרים קריאות מ"ג/מ"ל Lysate. תרשים מתן המרת מספרים עוזרו עם חישוב ריכוז חלבון.

זיקה חרוזיםנפח של חרוז slurry/IP (mL)
Ubiquitination20
Phosphotyrosine30
SUMOylation 2/340
Acetylation50
שליטה חרוזיםנפח של חרוז slurry/IP (mL)
Ubiquitination הבקרה חרוזים20
Phosphotyrsoine הבקרה חרוזים30
SUMOylation 2/3 שליטה חרוזים40
Acetylation הבקרה חרוזים50

בטבלה 4: מומלץ נפח של חרוזים/IP תרשים. תרשים מתן מומלץ כמויות של זיקה חרוזים לשימוש לכל תגובה IP.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישות הראשונית כדי לקבוע אם חלבון המטרה משתנה מאת PTM יכול להתבצע באמצעות הנוגדן הספציפי של חלבון המטרה עבור IP, ואחריו תספיג עם נוגדן PTM (למשל., אנטי-אצטיל ליזין), או באמצעות נוגדן PTM עבור ה-IP, ואחריו תספיג עם היעד חלבון נוגדן ספציפי30,31,33. בעוד שתי הגישות עבודה תיאורטית, ניצול של נוגדן חלבון-במטרה יש מוקשים פוטנציאליים נוספים, כגון הנוגדן לא ייתכן IP תואמים, או שינויים PTM גדול עלול לחסום את האתר זיהוי נוגדנים על חלבון המטרה34 ,35. היתרון של חרוזים זיקה PTM הוא כי התחומים נוגדן או איגוד במיוחד להכיר את PTM עניין; לפיכך, שינויים חלבון המטרה לא צריכים לשנות את זיהוי על ידי החרוזים זיקה. לדוגמה, Ub PD-L1 זוהה עם טכניקה המתוארת כאן, שני אנדוגני מונו - ו פולי-Ub נצפתה (איור 4). פרסום אחרונים מאת Lim ואח. מנוצל במבחנה Ub טכניקות לחקור PD-L1 Ub, התוצאה הייתה דומה מאוד התוצאות שמוצג באיור 436. מעניין, הם גם הופיע IP עם נוגדן PD-L1 להעשיר PD-L1 מתא lysate, Ub היה overexpressed ואיפה MG-132 נוספה כדי להגביר את האות. התבנית Ub לא היה מאוד ברורים מהתבנית במבחנה Ub ועמיד. חקירת אנדוגני Ub PD-L1 במודלים התרבות התא לא בוצעה Lim ואח. דוח כדי להבהיר את ההבדל בין נתוני תרבות, במבחנה שלהם בתא.

חוקרים אם חלבון הוא שונה מאת PTM עשויה להיות מאתגרת, בשל שפע נמוכה שלה אופי חולף37,38, ומחייבת בדרך כלל העשרה דרך IP. יעילות ה-IP של PTMs דורש אופטימיזציה של מספר שלבים מרכזיים, ריאגנטים, כגון פירוק מאגרי ריאגנטים זיקה. כאשר חוקרים PTMs מרובים של חלבון המטרה, מגביר אופטימיזציה הנדרשים הסבירות. ניצול מערכת פירוק blastR הוא שלב קריטי של פרוטוקול זה, כפי שהוא שומר על יכולת ה-IP חזקים, תוך הפעלת PTM זיהוי של pY, סומו 2/3, Ub, Ac PTMs במערכת אחת. טכניקה זו ממטבת את הזמן והמשאבים הנדרשים כדי לקבוע אם חלבון ביעד מסוים הוא שונה על-ידי אלה PTMs ארבעה, ואת פוטנציאל מספק תמונה טובה יותר של PTM crosstalk ביחס השוואת תוצאות PTM המבוצעת באמצעות פירוק מערכות מרובות. החקירה של התאימות של המערכת פירוק blastR עם PTMs חלופיים, כמו גליקוזילציה, בוצעו; עם זאת, זה לא נבדקה בדקדקנות לכל סוגי PTMs.

שופע הדנ א הגנומי יכול להתערב עם מדידות חלבון באמצעות ערכי צבע מוחלטים או שיטות nanodrop, להשפיע על ההעברה של חלבונים ב- ג'ל אקרילאמיד מרחביות, ולמנוע אינטראקציה מטריקס חלבון ואהדה במהלך מבחני ה-IP. השיטה המתוארת כאן מנצל מסנן מיוחדים כדי להסיר זיהום דנ א גנומי, המהווה צעד קריטי נוסף של פרוטוקול זה. כדי להדגיש נקודה זו, בוצעו בדיקות צמיגות לפני ואחרי טיפול סינון blastR, התוצאות הראו ירידה של צמיגות גבוהה כדי צמיגות של מים (נתונים לא מוצג). שינוי זה צמיגות נתמכה על ידי התוצאות איור 3, מציג שכמעט כל ה-DNA גנומי הוסרו. חשוב, ה-DNA הוא לא לכסנתם בשיטה זו, כפי דנ הוטו לא ייתפס על ידי המסנן (נתונים לא מוצג). כלי זה הוא על שיטות קונבנציונליות, כמו sonication או מזרק-DNA-חיתוך, מכיוון שזה דורש אין ציוד מיוחד, מאוד לשחזור, מסיר את הדנ א במקום הטיה זה. יתר על כן, זה לא תגרע חלבון ב- lysate, אשר יכול להתרחש תוך שימוש בשיטות המקובלות29. ניצול למסנן לוקח 5-30 שניות עבור דגימה לעומת שיטות אלטרנטיביות עשוי להימשך דקות אחדות (קרי, מזרק הטיה) ואיפה יכול לגרום מדגם הטרוגניות כמו DNA מזהמים נשארים lysate פירוק יעיל של ה-DNA. ניתוח מקיף של הסינון blastR מראש, שלאחר lysate בוצעה, ו אין הבדל הנצפה בפרופיל חלבון נצפתה על ידי Coomassie, במטרה המערבי, או הכולל, במטרה PTM ניתוחים; לפיכך, השלמות של פרופיל החלבון עשוי לא הושפעו על-ידי סינון החוצה את הדנ א הגנומי. בסופו של דבר, מערכת סינון זו היא מועילה לכל המערבי או יישום ה-IP קיים ואיפה עשוי להשפיע על פרשנות של חלבון ניתוח הדנ א.

חשוב לציין שיש פוטנציאל לגילוי שלילי כוזב, טכניקה זו, אשר עשוי להיות בחלקו בשל זיקה חרוז רוויה, הפרעות באתר איגוד או PTM מיסוך. למשל, חלבון המטרה מסוים ניתן לשנות על ידי Ac ברמות נמוכות מאוד; לכן, זה עשוי לא להיות מבודדת על ידי פאן-אצטיל ליזין זיקה חרוזים ושרויה שופע יותר חלבונים היעד Ac-השתנה. לימודי מתמשך מבוצעות כדי להעריך את גבולות זיהוי ריאגנטים זיקה מנוצל פרוטוקול זה, אבל פרסום האחרונות מציע מגבלה זיהוי מאוד חזקים. הנתונים הראו כי טכניקה זו יכולה לזהות גם מולקולות חלבון המטרה acetylated 17 לכל תא31בהיקף. ובכל זאת, בנסיבות מסוימות כגון תאים הקלד ירידה לפרטים, PTMs ארעי בתגובה לגירויים ספציפיים, או מיסוך של PTMs עקב אינטראקציית חלבון עשוי לגרום כל תוצאות שליליות שגויות. אלה ממלכודות הפוטנציאל של טכניקה זו, כמו גם רוב שיטות PTM IP. לפיכך, מומלץ לאשר את התוצאות תוך שימוש בגישות מרובים.

שינויים כמו גליקוזילציה זרחון הוכחו להתחרות על חומצות אמינו דומה39,40, ו PTMs אחרים כמו ubiquitination, זרחון הוכחו לעבוד ברצף כדי לווסת של חלבון הפונקציה17,41. עבודה על neuropathological חלבון טאו הדגיש את חשיבות crosstalk PTM, איפה טאו hyper-זרחון SUMOylation טאו משופרת השני42. יתר על כן, קבוצה זו הראה כי SUMOylation של טאו למנוע פולי-Ub והשפלה טאו עוקבות, שיכול להוביל צבירה. זהו אחד של דוגמאות רבות של הרגולציה crosstalk PTM, השירות של טכניקה זו יעזור להאיר את החשיבות של PTMs ואת crosstalk שלהם בוויסות חלבונים מפתח על בריאות ומחלה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הוד קדושתו, א. ל. הם עובדים של שלד התא והספקה בע מ הוא מייסד inc. שלד התא

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים מדענים מחקר inc. שלד התא, ד"ר בריאן הובר, אשלי דיוויס על שלהם ביקורת ועריכה של דיונים פוריים על כתב היד. בנוסף, אנו מודים ד ר רוברט Hom על תרומתו במהלך הייצור של כתב היד וידאו. עבודה זו נתמכה על ידי מימון inc. שלד התא

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ליזיס תאים/הסרת DNA גנומי וניתוח
1x פוספט חוצץ מלח (PBS)מתכון נפוץ: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4
BlastR מאגר ליזהCytoskeleton Inc.BLST01תערובת קניינית של חומרי ניקוי, מלחים ותוספי חיץ אחרים
מאגר בדיקת רדיו-אימונו-משקעים (RIPA)מאגרמתכון: Tris-HCl, NaCl, SDS, נתרן דאוקסיכולאט,
מגיב מיצוי חלבון יונקים Igepal (mPER)Thermofisher78503תערובת קניינית של חומרי ניקוי, מלחים ותוספי חיץ אחרים
Immunoprecipitation (IP) LysisPierce87787תערובת קניינית של חומרי ניקוי, מלחים ותוספי חיץ אחרים
1% נתרן דודציל סולפט (SDS) מאגר דנטורינג מאגרנפוץמתכון: PBS, SDS, EDTA, EGTA
Laemmliמאגרמתכון: Tris-HCl, SDS, גליצרול, ברומופנול כחול
מאגר דילולBlastR Cytoskeleton Inc.BDB01תערובת קניינית של חומרי ניקוי, מלחים ותוספי חיץ אחרים
מעכב פרוטאז קוקטיילCytoskeleton Inc.PIC02
N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine (TPEN)Cytoskeleton Inc.
טריכוסטטין A (TSA) & ניקוטינאמידציטוסקלטון בע"מTSA01
נתרן אורתובנדאט פעיל (Na3VO4)Cytoskeleton Inc.מגרדי תאים PYI01
Costar3008
BlastR מסנןCytoskeleton Inc.BLR02
BD מחט מזרק אינסוליןBD08290-3284-11
סוניקטור (סוניפייר ברנסון)ברנסוןסוניפייר 450
דיוק אדום מתקדם מגיב חלבוןציטוסקלטון בע"מADV02
1 מ"ל קובטותפישר14955127
ספקטרופוטומטר (Genesys20)Thermofisher4001ניתן להשתמש בספקטרופוטומרים אחרים למדידת ריכוז החלבון
AgaroseFisherBP1356-500
1kb סולם חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) NEBN3232L
קופסת ג'ל DNAThermofisher7312 B1A
Tris/Borate/EDTA (TBE) מאגרנפוץמתכון: Tris-HCl, חומצה בורית, EDTA
strong>PTM Immunoprecipitation
Phosphotyrosine חרוזיםCytoskeleton Inc.חרוזי APY03 חרוזי
UbiquitinationCytoskeleton Inc.UBA01-חרוזים
SUMOylation 2/3 חרוזיםCytoskeleton Inc.חרוזי ASM24-חרוזי
אצטילציהCytoskeleton Inc.חרוזי AAC04 חרוזי
בקרת פוספוטיזיןCytoskeleton Inc.חרוזי CIG01 חרוזי
בקרת UbiquitinationCytoskeleton Inc.CUB02-חרוזים
SUMOylation 2/3 חרוזי בקרהCytoskeleton Inc.חרוזי CIG01 חרוזי
בקרת אצטילציהCytoskeleton Inc.CIG02-חרוזים
BlastR מאגר כביסהCytoskeleton Inc.BWB02תערובת קניינית של חומרי ניקוי, מלחים ותוספי חיץ אחרים
מאגר פליטת חרוזיםCytoskeleton Inc.BEB01תערובת קניינית של חומרי ניקוי, מלחים ותוספי חיץ אחרים
מיקרו-צנטריפוגהEppendorf5417ניתן להשתמש במיקרו-צנטריפוגות אחרות 
מסובב צינורATRRKVSDניתן להשתמש במסובבי צינור אחרים מקצה לקצה 
טיפים לטעינת חלבוןVWR37001-150
עמודות ספיןCytoskeleton Inc.בלוק חום SPN22
95 ° CBenchmarkBSH1002
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis
5x מאגר דגימהמאגר: ברומופנול כחול, דיתיותרייטול (DTT), גליצרול, SDS, Tris-HCl
נובקס טריז באר 4-20% ג'ל Tris-glyInvitrogenXP04200BOXהטריזים הגדולים מצוינים להעמסת כמויות גדולות
נפוץשל מאגר ריצה: Tris-HCl, גליצין,
SDS seeblue סולם חלבוןLife TechnologiesLC5625
תא אלקטרופורזהInvitrogenXcell תא אלקטרופורזה סורלוק ניתןלהשתמש בתאי אלקטרופורזה אחרים, אולם אלה תואמים לג'לים של novex wedgewell 
ספק כוחBioradPowerPac HCניתן להשתמש בספקי כוח אחרים 
1x מתכון מאגר: Tris-HCl, גליצין, מתנול
תא העברהBioradמיני תא טרנס-כתםניתן להשתמש בתאי העברה אחרים 
Immobilon- ממברנות P (PVDF)מיליפוריותIPVH 304F0
חלב ללא שומןמשגשג813503015095
Tris תמיסת מלח חוצצת עם טווין (TBST)חיץ: Tris-HCl, NaCl, Tween 20
Chemiluminescent DetectionReagent Cytoskeleton Inc.CLRA/CLRB
<חזק>צמיחת תאים וטיפול
מדיום הנשר המותאם של דולבקו ATCC30-2002
סרום בקר עובריATLAS  פ-0500-A 
גורם גדילה אפידרמיסCytoskeleton Inc.CN02-A
150 מ"מ לוחות תרבית תאיםקורנינג430599
נפוץ נפוץ NEM09BB< מתכון נפוץ1x מתכון חיץ העברהמתכון נפוץ

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  2. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Res. 26 (4), 399-422 (2016).
  3. Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
  4. Hunter, T. The genesis of tyrosine phosphorylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).
  5. International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).
  6. Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).
  7. Pellegrino, S., Altmeyer, M. Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress. Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).
  8. Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics. Genome Med. 5 (2), 20(2013).
  9. Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination. N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).
  10. Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions. Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).
  11. Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease. Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).
  12. Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance. Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).
  13. West, A. C., Johnstone, R. W. New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment. J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).
  14. Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).
  15. Gu, B., Zhu, W. G. Surf the post-translational modification network of p53 regulation. Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).
  16. Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).
  17. Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling. Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).
  18. Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
  19. Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation. J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).
  20. Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation. Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).
  21. Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression. Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).
  22. Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. A SUMO-acetyl switch in PXR biology. Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).
  23. Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
  24. Siuti, N., Kelleher, N. L. Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry. Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).
  25. Mischerikow, N., Heck, A. J. Targeted large-scale analysis of protein acetylation. Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).
  26. Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).
  27. Emmerich, C. H., Cohen, P. Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting. Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).
  28. Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice. Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).
  29. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).
  30. Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton. Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).
  31. Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway. Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).
  32. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  33. Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons. J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).
  34. Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
  35. Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
  36. Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5. Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).
  37. Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries. Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).
  38. Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W. Quantifying ubiquitin signaling. Mol Cell. 58 (4), 660-676 (2015).
  39. Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins--a role in nuclear localization. Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).
  40. Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells. Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).
  41. Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor. Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).
  42. Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PTMSUMOylationBlaster Lysis BufferWestern BlotPD L1EGF

מאמרים קשורים