בפרוטוקול הנוכחי מציג ניסיוני ההליכים כדי להמריץ מקרופאגים בתרבית כדי להיות ניחן היכולת לשחרר מולקולרי גורמים המקדמים neurite תוצר. טיפול של מחנה לתרבויות המשנה נוירון-מקרופאג המניע את המקרופאגים לייצר בינוני ממוזגים שמחזיק neurite חזק תוצר פעילות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
נוירון-מקרופאג תרבויות שותפה להפעלת מקרופאגים הפרשת גורמים מולקולרית עם פעילות תוצר Neurite
במאמר זה
סיכום
תקציר
יש ראיות חזקות מקרופאגים יכולים להשתתף התחדשות או תיקון של מערכת העצבים פצועים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שבו המקרופאגים הם המושרה לבינונית התוצרת ממוזגים (ס מ) המקדמת תוצר neurite. שורש העזוב למבוגרים גנגליון (DRG) נוירונים בחריפות הפומבית, מצופה. לאחר הנוירונים stably מחוברים, מקרופאגים הצפק הם שיתוף בתרבית על הוספה תרבות תאים בשכבות על אותו טוב. Dibutyryl שמחזורי AMP (db-מחנה) מוחל על התרבויות שותף במשך 24 שעות, לאחר מכן להוסיף התרבות התא המכיל את המקרופאגים מועבר היטב אחר כדי לאסוף ס מ עבור 72 h. ס מ התרבויות שיתוף שטופלו db-מחנה, כאשר חל נפרדות למבוגרים DRG נוירון תרבות, תערוכות פעילות תוצר neurite חזקים. ס מ שהתקבל מן התרבויות db מחנה-שטופלו המורכב סוג תא בודד לבד, DRG נוירון או מקרופאג הצפק, לא להפגין פעילות תוצר neurite. אפשרות זו מציינת כי האינטראקציה בין הנוירונים ו מקרופאגים היא הכרחית עבור ההפעלה של מקרופאגים הפרשת גורמים מולקולרית עם פעילות תוצר neurite ס מ. לפיכך, הפרדיגמה תרבות משותפת שלנו גם יהיה מועיל ללמוד איתות המערכת באינטראקציה נוירון-מקרופאג כדי לגרות את המקרופאגים כדי להיות ניחן הפנוטיפ משובי pro.
מבוא
מגוון רחב של מחקרים ניסו לשפר את מערכת העצבים המרכזית האקסון חידוש לאחר הפציעות של חוט השדרה או המוח. תגובות דלקתיות, באופן בלתי נמנע המלווה את הפגיעה במערכת העצבים, נחשבים באופן מסורתי להשתתף משני תהליכים פתולוגיים שמוביל התוצאות המזיקות1,2. אכן, מתילפרהדניזולון יכול לדיכוי תגובות דלקתיות הוא הטיפול היחיד שאושרו עבור פגיעה בחוט השדרה חריפה3. עם זאת, מחקרים מאוחרים יותר סיפקו ראיות כי מקרופאגים, סוג תאים דלקתיים נציג, יכולים להשתתף התחדשות או תיקון של מערכת העצבים פצועים-4,-5,-6. לדוגמה, שחדר מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים המערבות בעלי חיים אושרו על ידי מוסדיים חיה אכפת ועל שימוש הוועדה של ד אלעג'ו הספר לרפואה של אוניברסיטת.
1. תרבות הכנה של נוירון הפומבית DRG למבוגרים
- לפני הגדרת התרבות, מעיל מראש צלחת 6-ובכן עם פולי-D-ליזין ו laminin. דגירה צלחת 6-ובכן עם 0.01% פולי-D-ליזין ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים.
- דגירה לצלחת עם פתרון laminin ריכוז של 3 µg/mL עבור 2 h בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים. יבש את הצלחת בטמפרטורת החדר לפחות לשעה.
- המתת חסד עכבר בתוך תא2 ושות שקופה מחובר צילינדר גז דחוס של2
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אנו מתארים פרוטוקול שיכולות לייצר מקרופאגים מסוגל הפרשת גורמים מולקולרית עם פעילות תוצר neurite. מקרופאג ס מ שהתקבל מן התרבויות שיתוף שטופלו db-מחנה הביא תוצר neurite חזקים כאשר חל על תרבות נוירון DRG נפרד (איור 2 א). לשם השוואה, ס מ שהתקבל מן התרבויות שיתוף שטופלו PBS לא לגרום neurite תוצר במשך 15-h התרבות שלנו (איור 2B). כאשר db-מחנה מטופלת לתרבות עם מקרופאג לבד, ס מ. השיג ממצב זה לא היה יעיל בתמיכה neurite תוצר (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ישנם מספר שלבים קריטיים עבור הדור של מערכת זו תרבות משותפת. זה חשוב להבטיח העכבר DRG נוירונים ו מקרופאגים הצפק מוכנים טרי ובריא. שאנו חווים neurite מופחתת פעילות תוצר של ס מ ניתוח כל DRGs לקח יותר מ 30 דקות. בנוסף, הזיהום של רכיבי הדם מקרופאגים הצפק גם הובילו לירידה של neurite תוצר פעילות ס מ. כדי להפיק נוירון חזקים-מקרופאג אינטראקציה מאת db-מחנה, שטיפה יהיה גם שלב קריטי כדי להבטיח הסרה מלאה של פסולת רקמות ולמניעת שעשוי להיות שנותרו ציטוטוקסיות רכיבים, כגון collagenase או RBC פירוק המאגר. נקודה נוספת כדי להיות והדגשתי הי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
פרוטוקול זה נתמך על ידי מענק ה-NRF-2015R1A2A1A01003410 משרד המדע, טכנולוגיית מידע, תכנון העתיד, הרפובליקה של קוריאה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תרבית תאים להכניס קרום PET שקוף 0.4μ m גודל נקבוביות | קורנינג, Falcon | 353090 | קרום PET שקוף עם 0.4-μ גודל נקבוביות M, לצלחת 6 בארות |
| 70-μ m מסננת תאי ניילון | קורנינג, Falcon | 352350 | |
| שקופית תרבית 8 בארות | Biocoat | 354632 עם יישום אחיד של מאגר ליזה של תאי דם אדומים פולי-D-ליזין | |
| Qiagen | 158904 | ||
| קולגנאז מ-Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | מכיל 1% גלוטמקס ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין |
| B-27, ללא סרום | Thermo Fisher Scientific, | תמיסה חוץ-תאית | 17504-044 |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| פולי-D-ליזין הידרוברומיד | סיגמא-אולדריץ' | P6407-5MG | |
| למינין | תרמו פישר מדעי, Invitrogen | 23017-015 | |
| אדנוזין 3', 5'-מונופוספט מחזורי, N6, O2'-dibutyryl-, מלח נתרן | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% סרום עיזים רגיל | תרמו פישר 16210072 | ||
| Triton-X-100 | Daejung כימיקלים ומתכת Co | 8566-4405 | |
| אנטי ובטא; III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | נוגדן חד שבטי |
| לעכבר עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני | תרמו פישר מדעי, Invitrogen | A11005 | |
| המציטומטר | Marienfeld-Superior | N/A | |
| תרבית תאים CO2 חממה | Panasonic | N/A | |
| סטריאומיקרוסקופ | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| שייקר טוויסט | FINEPCR | Tw3t | |
| צנטריפוגה שולחנית | Sorvall | N/A | |
| IX71 | |||
| FBS (סרום בקר עוברי)VWR | International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | נירוסטה, 14 ס"מ, מעוקל, פעולה משותפת אחת |
| מספריים עדינות - טונגסטן קרביד & ToughCut | FST (כלי מדע עדין) | 14558-11 | חד, משונן |
| Dumont #7 מלקחיים | FST (כלי מדע עדין) | 11272-30 | דומוקסל, 0.07 x 0.04 מ"מ, |
| מספריים קפיציים מעוקלים של Vannas | FST (כלי מדע עדין) | 15000-00 | ישר, 3 מ"מ חדשני, חד |
| Qualitron DW-41 מיקרו-צנטריפוגה | Artisan Technology Group | DW-41 | מתח כניסה: 115VAC |
מקורות
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
