מאמר שיטה

דגם פרה העכבר של אוסטאוסרקומה כדי להגדיר את התקשורת חוץ-תאית שלפוחית בתיווך בין גידול בתאי גזע Mesenchymal

DOI:

10.3791/56932

⸱

6 במאי 2018

 ,  , 
1Neuro-oncology Research Group, VU Medical Center, 2Exosomes Research Group, Department of Pathology, VU Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזרקה ישירה של נגזר סרטן שלפוחית חוץ-תאית (EVs) שמוביל התכנות של מח העצם תמיכה התקדמות הגידול; עם זאת, אילו תאים לתווך את האפקט הזה לא ברור. במסמך זה, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לחקור בתיווך EV הגידול-mesenchymal תאי גזע (MSC) אינטראקציות ויוו, חשיפת תפקיד מכריע עבור EV משכילים MSCs ב גרורות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתוך microenvironment הגידול, תושב או מגויסים בתאי גזע mesenchymal (MSCs) לתרום התקדמות ממאיר של מספר סוגי סרטן. תחת השפעתו של אותות סביבתיים מסוימים, אלה בתאי גזע בוגרים יכולים לשחרר מגשרים paracrine המוביל הגידול המואץ גרורות. הגדרת crosstalk בין הגידול MSCs ישנה חשיבות רבה כדי להבין את המנגנונים שבבסיס התקדמות סרטן ולזהות יעדים הרומן התערבות טיפולית.

תאים סרטניים לייצר כמויות גבוהות של שלפוחית חוץ-תאית (EVs), אשר יכולים להשפיע עמוקות על אופן הפעולה של התאים היעד microenvironment את הגידול או באתרים מרוחקים. הגידול EVs לתחום מולקולות פונקציונלי, לרבות RNAs דלקתיות, חלבונים (onco), אשר יכול לחנך סטרומה תאים כדי לשפר את אופן הפעולה גרורתי של תאי סרטן או להשתתף היווצרות נישה מראש גרורתי. במאמר זה, אנו מתארים את התפתחות סרטן פרה העכבר מודל המאפשר הערכה ספציפית של crosstalk EV בתיווך בין גידול בתאי גזע mesenchymal. ראשית, אנו מתארים לטיהור ודה אפיון של EVs מופרש הגידול והערכה של ההפנמה EV מאת MSCs. לאחר מכן נעשה שימוש מתכלה מבוסס-חרוז מולטיפלקס כדי להעריך את שינוי של הפרופיל ביטוי ציטוקינים MSC המושרה על ידי סרטן EVs. לבסוף, אנו ממחישים את הדור של דגם העכבר xenograft orthotopic ביולומנאסן של אוסטאוסרקומה זה recapitulates את האינטראקציה הגידול-MSC, להראות את התרומה של משכילים EV MSCs היווצרות וצמיחה של גרורות הגידול.

המודל שלנו מספק את ההזדמנות כדי להגדיר איך סרטן EVs לעצב סביבה התומכים בהגידול, וכדי להעריך אם המצור של התקשורת EV בתיווך בין הגידול MSCs מונע התקדמות סרטן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microenvironment הגידול משתתפת באופן פעיל ביותר, אם לא כל, היבטים של התקדמות tumorigenesis, סרטן, כולל היווצרות גרורות, ההתפתחות של עמידות הרפוי1. זה מדגיש את הצורך orthotopic פרה סרטן בעכבר דגמים המאפשרים ניתוח של אינטראקציות מורכבות הגידול-משתית המתרחשים הנישה הגידול.

בין המרכיבים הסלולר רבים של microenvironment הגידול, גזע mesenchymal (MSCs) בחום לתרום התקדמות סרטן מספר סוגי סרטן כגון סרטן השד, סרטן הערמונית, גידולים במוח, מיאלומה נפוצה, אוסטאוסרקומה2 ,3,4,5,6,7. MSCs הם תאי גזע multipotent השוכנים ברקמות שונות למבוגרים ו עוברית, כולל מח עצם, רקמת שומן, שליה, דם חבל הטבור ועוד8,9. בתגובה אותות דלקתיים שנוצרו על-ידי סרטן, MSCs להעביר לעבר אתרי הגידול, לשלב microenvironment הגידול, להבדיל בסופו של דבר לתוך התאים התומכים בסרטן10. אלה הקשורים לסרטן MSCs מספקים הגורמים החיוניים (קרי, גורמי גדילה, נוגדנים, ציטוקינים ו מגשרים לדיכוי המערכת החיסונית) התקדמות הגידול פועלים על תאים סרטניים, וגם על שמסביב משתית2, 3 , 11 , 12 , 13. בזמן השפעת קידום גידול סרטן-הקשורים MSCs נחקרו במודלים סרטן רבים, המנגנון שבו תאים סרטניים לתכנת MSCs לעצב גומחה קידום סרטן הם הבינו כהלכה. כאן נתאר את הדור של מודל xenograft orthotopic במיוחד מאפשר הלימוד של אינטראקציה פרו-tumorigenic בין תאים סרטניים עצם MSCs דרך שלפוחית חוץ-תאית (EVs).

EVs הם מתווכים מכריע של המערכת התקשורת בין גידול תאי סטרומה14. EVs לשאת מולקולות פונקציונלי של התא מקור כולל חלבונים, ליפידים ו RNAs רגולטוריות. ברגע שוחרר בחלל חוץ-תאית, שלפוחית אלה שאפשר לקחת על ידי התאים שמסביב או נשא לאתרים מרוחקים דרך הדם או את זרימת הלימפה, יכולים להשפיע עמוקות בהתנהגות התא היעד. 15 , 16 , 17 למשל, ספיגת של סרטן EVs על ידי fibroblasts סטרומה עלולה לגרום בידול myofibroblast להאצת הגידול בצמיחה ויוו18,19, הפנמה מאת אנדותל ותמיכה אנגיוגנזה התאים יכולים לעורר אנגיוגנזה ולהגדיל את חדירות כלי דם16,20, אינטראקציה עם תאים חיסוניים עלול להוביל לדיכוי התגובה החיסונית antitumor21.

אנחנו לאחרונה הפגינו, באמצעות מודל העכבר xenograft orthotopic ביולומנאסן של אוסטאוסרקומה, כי תאים סרטניים לשחרר כמויות גבוהות של EVs הפקודה MSCs כדי לרכוש הפנוטיפ pro-tumorigenic ו- pro-גרורתי. אפקט זה הוא עקב שינוי דרמטי בפרופיל MSC ציטוקין ביטוי (המכונה "MSC education), ניתנת למניעה על ידי הממשל של נוגדן interleukin-6 טיפולי קולטן (IL-6R)7. העבודה שלנו הוכיח כי סרטן EVs הם מאפננים מכריע של התנהגות MSC, ובכך לספק תירוץ עבור גישות ממוקדות microenvironment לעצור את התקדמות אוסטאוסרקומה. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לחקור את הגידול-MSC בתיווך EV אינטראקציה ויוו. מודל זה נועד: 1) במיוחד להגדיר התיקונים EV-induced סרטן של התנהגות MSC microenvironment הגידול, 2) להעריך כמה אינטראקציה זו תורמת הגידול עצם היווצרות גרורות ושל 3) מחקר אם מפריעים ה crosstalk בתיווך EV ויוו מונע התקדמות סרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות adipose בידוד תאי גזע mesenchymal היו מתקבל מהמחלקה לכירורגיה פלסטית של בית החולים Tergooi (הילברסום, הולנד) לאחר אישור על ידי הוועדה האתית המוסדית, נכתב מדעת. MSCs אדיפוז GFP-חיוביים התקבלו מ מחלקת הרפואה ומדעי כירורגי לילדים ומבוגרים (אוניברסיטת מודנה, רג'יו אמיליה).

הניסויים בוצעו בהתאם לחוק ההולנדי על ניסויים בבעלי חיים, הפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה על ניסויים בבעלי חיים של מרכז רפואי אוניברסיטת VU, אמסטרדם, הולנד.

1. בידוד של מופרש גידול שלפוחית חוץ-תאית.

  1. להכין מדולדל EV עוברית שור סרום (FBS) על-ידי צריך שתוציאו FBS ב g x 70,000 בן לילה (16 שעות), בלי בלמים, ב 4 ° C באמצעות של הרוטור דלי אולטרה מתנדנדים (מצפה 1h לציון ההאטה). בזהירות לאסוף את תגובת שיקוע (FBS מדולדל EV) מבלי להפריע בגדר. לסנן את FBS מדולדל EV עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
  2. להכין מדולדל EV בינוני תרבות על-ידי שכשהם בינוני של Iscove שונה Dulbecco (IMDM) עם 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין µg/mL 100, גלוטמין 2 מ מ (1 x P/S/G) ו-5% FBS מדולדל EV.
  3. זרע תאים6 143B 3 x 10 ב-175 ס מ2 מבחנות, תרבות אותם מדולדל EV בינוני תרבות באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2. כאשר התאים הם 80-90% confluent (בדרך כלל אחרי h 36 עד 48 שעות), לאסוף את תגובת שיקוע 8 x 175 ס מ2 מבחנות (28 מ"ל/הבקבוק) לבידוד-EV.
  4. מראש לנקות את תגובת שיקוע תא להסיר תאים ופסולת תאים על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית (צריך שתוציאו את תגובת שיקוע של שהימרת בסיבוב הקודם בכל פעם) לפי הפרוטוקול הבאים:
    1. Centrifuge את תגובת שיקוע פעמיים ב 500 g x 10 דקות.
    2. Centrifuge את תגובת שיקוע פעמיים ב- 2000 x g למשך 15 דקות.
    3. Centrifuge את תגובת שיקוע פעמיים ב 10,000 g x למשך 30 דקות.
    4. לבצע כל centrifugations ב 4 ° C עם האצה מקסימלית, הגדרות מהירות ההאטה. לאחר כל שלב, בזהירות לאסוף את המכילים EV תגובת שיקוע, כשמאחוריו בערך 1 מ"ל. המשך מיד לשלב 1.5 או חנות מאושר מראש ממוזגים בינוני ב-80 מעלות צלזיוס עד בידוד EV.
  5. לבודד EVs מאת צריך שתוציאו מאושר מראש ממוזגים המדיום פעם ב- 70,000 g x עבור 1 h, לאט בלם, ב 4 ° C צינורות אולטרה-צנטריפוגה (נפח סופי 38.5 mL/צינור) באמצעות של הרוטור דלי אולטרה מתנדנדים.
  6. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, עוזב את בערך 1 מ"ל מאחור, resuspend כדורי המכיל EV באמצעי האחסון הנותרת, בריכה אותם כל בצינור ultracentrifuge אחד ולהוסיף באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עד התחתית מלאה מילוי (נפח סופי 38.5 mL).
  7. צנטריפוגה שוב ב 70,000 x g עבור h 1-4 ° C, ללא בלמים (מצפה 1h לציון ההאטה). בזהירות להסיר את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר הן משאירות 100-200 µL.
  8. Resuspend EV-גלולה ולכוונן את העוצמה הסופי כדי 200 µL עם PBS (סטנדרטית עבור EV כל-ומשום). להשתמש בתכשיר EV באופן מיידי או לאחסן ב- 80 ° C עד לשימוש22.
    הערה: EVs ניתן לאחסן 6 חודשים ב-80 מעלות צלזיוס.

2. EV אפיון.

EVs מטוהרים, ניתן לאבחן על ידי שידור מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM)23.

  1. Preps EV לערבב עם אמצעי אחסון שווה של 4% paraformaldehyde במאגר פוספט.
  2. המעיל 200 mesh Formvar פחמן-מצופה ניקל TEM רשתות עם 5 µL EV השעיה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. שמלמדות את הדגימות EV על רשתות TEM עם 1% גלוטראלדהיד במאגר 0.1 M פוספט (pH 7.0), לעומת uranyl אוקסלט (pH 7.0), להטביע בתערובת של 4% uranyl אצטט ו- 2% מתיל תאית ביחס של 1:9 על קרח.
  4. הסר רשתות עם לולאות פלדת אל-חלד, למחוק את עודפי הנוזלים עם נייר סינון כדי להבטיח של עובי המתאים של הסרט מתיל תאית.
  5. לאחר ייבוש, לבחון רשתות עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, לכידת תמונות עם מצלמה דיגיטלית מצמידים את התוכנה התמונה המתאימה.

3. חינוך של MSCs מאת EVs נגזר הגידול.

  1. הכן MSC תרבות בינוני על ידי שכשהם אלפא-מינימום הכרחי בינוני (אלפא-מ) עם 4% מדולדל EV האנושי Lysate טסיות (hPL)24, הפרין (10 U/mL) ו- 1 x P/S/G.
    הערה: hPL מדולדל EV מתקבל בעקבות ההליך המתואר בסעיף 1.1.
  2. זרע 1.4 x 106 MSCs שומן, נגזר לפי 75 ס מ2 הבקבוק, תרבות אותם במדיום מדולדל EV MSC-תרבות באינקובטור 37 ° C ו 5% CO2.
  3. כאשר תאים להגיע למפגש 70%, להוסיף 143B אוסטאוסרקומה - או שליטה אנושית fibroblasts (hf)-EVs, 10 µL EV הכנה/cm2 של תרבות את הבקבוק. תקופת דגירה של 24 שעות, הוסף את אותה כמות של EVs על 6 שעות נוספות. הערה: fibroblasts בני אדם מתורבתים של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) 10% FBS ו EVs מבודדים כמתואר בסעיף 1.
  4. לאסוף את תגובת שיקוע MSC, צנטריפוגה x 1-500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° C (עם ההאצה המרבית ואת הגדרות מהירות ההאטה), להעביר צינור ולאחסן את תגובת שיקוע שנוקה ב- 80 ° C כדי לאפשר ניתוח ציטוקין בעתיד (סעיף 5).
  5. עבור ויוו ניסויים (סעיף 6), לחנך GFP-חיוביות MSCs25 כמתואר בסעיפים 3.1 ל 3.3, לאסוף את התאים, resuspend אותם ב- PBS ב ריכוז הסופי של 10 תאים6 לכל 100 µL. תאים לשמור בקירור עד זריקה.

4. EV הפנמה וזמינותו.

כדי להמחיש EV ספיגת מאת MSCs, תווית EVs עם ירוק-פלורסנט מקשר צבע (GFLD) (זמינים מסחרית) ע פ הפרוטוקול של היצרן:

  1. בקצרה, להוסיף 180 µL של diluent ההכנות EV 200 µL. למהול 1 µL של GFLD צבע ב- 50 µL של diluent, ולהוסיף 20 µL של צבע מדולל ההכנות EV מדולל.
  2. בעדינות לערבב על-ידי pipetting, תקופת דגירה של 3 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  3. הוסף 5 מ של BSA 0.1% ב- PBS, להעביר צינורות אולטרה-צנטריפוגה ולמלא את הצינור עם PBS (נפח סופי 38.5 mL/צינור).
  4. צנטריפוגה 1 x ב- 70,000 g x עבור h 1-4 ° C, ללא בלמים (מצפה 1h לציון ההאטה). בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend EV-בגדר שכותרתו באמצעי אחסון הסופי של 200 µL (להתאים את אמצעי האחסון עם PBS).
  5. להוסיף את EVs שכותרתו התרבות MSC או לאחסן אותם ב- 80 ° c לאחר דגירה לילה, להעריך הפנמה שלפוחית על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, flow cytometry7.

5. הערכה של פרופיל ביטוי ציטוקינים MSC.

  1. עבור כימות מולטיפלקס של אינטרלוקין-8 (IL-8), אינטרלויקין-1β (IL-1β) interleukin-6 (IL-6), אינטרלויקין-10 (IL-10), גידול נקרוזה מקדם (TNF), רמות החלבון אינטרלוקין - 12p 70 (IL - 12p 70) MSC ממוזגים בינוני (ראה שלב 3.4), להשתמש cytometric זמינים מסחרית חרוז מערך (כקבוצת) עבור האדם ציטוקינים דלקתיים ההוראות של היצרן.
  2. בקצרה, לערבב את החרוזים לכידת מצומדת נוגדן, להוסיף אותם לכל הצינורות וזמינותו. להוסיף הצינורות דילולים סטנדרטי של ציטוקינים או הדגימות בינוני ממוזגים.
  3. להוסיף את ריאגנט לזיהוי, דגירה 3 שעות ב- RT.
  4. לשטוף את החרוזים עם הפתרון כביסה שסופקו. למדוד את הדגימות באמצעות cytometer זרימה ולנתח את הנתונים לפי הוראות היצרן.

6. דור של מודל העכבר Orthotopic Xenograft של אוסטאוסרקומה.

  1. לאפשר עכברים Athymic בעירום-Foxn1nu בת שבוע 6, נקבה, להתאקלם למשך לפחות שבוע לפני תחילת ההליכים ניסיוני.
  2. יום אחד לפני הליך כירורגי, כמו פרי-פעיל נגד כאבים להוסיף אקמול המים לשתייה. לדלל "הפתרון אקמול לילדים" (ראה טבלה של חומרים) עם מים כדי לקבל ריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל. מבוסס על צריכת המים הממוצעת של 150 מ"ל/ק"ג/יום, משקל גוף ממוצע של 20 גרם, מינון זה הוא מספיק להגיע מינון של 6 מ ג/עכבר/יום (300 מ"ג/ק"ג/יום).
  3. המשך טיפול כאבים עד 24 שעות לאחר הניתוח, או יותר, אם החיות מראים סימנים של כאב.
  4. ביום של הליך כירורגי, לאסוף את 143B תאים לוציפראז-חיובי (Fluc) בתרבית (שיצרה בעבר התמרה חושית lentiviral) על ידי צריך שתוציאו על 300 גרם x 10 דקות, resuspend את התאים-ריכוז של 2 x 105 תאים/µL ב- PBS. תמשיכו התליה תא על הקרח עד 6 שעות.
  5. אוטוקלב ציוד כירורגי. להכין ו לנקות אזור העבודה במקום פינצטה ומספריים סטיריליים על גליונות סטרילי. עשרים דקות לפני הליך כירורגי (שלב 6.8), להחדיר את החיות subcutaneously הבופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג, מדולל ב- saline 0.9%) כמו כאבים באמצעות מזרקים אינסולין 0.5 mL (מחט בקוטר 29).
  6. לפני מאלחש כל בעל חיים, ממלאים מזרק 10 µL לפחות 1 µL של התליה תא מרוכז (Fluc) 143B (ראה שלב 6.4).
  7. עזים ומתנגד החיה עם הרדמה שאיפה איזופלוריין (2-3% חמצן). בדוק את הרמה של הרדמה על ידי הבוהן-צובט החיה. כאשר החיה לא מגיבים צביטות, קרי, שזה עמוק הוא מורדם, להחיל משחה על העיניים כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
  8. מקם את החיה על גבו עם הראש במסיכת הרדמה ועם הרגליים כלפי המפעיל. להגמיש את הברך השמאלית. לנגב את העור עם 70% אתנול ולהחיל לידוקאין (2%) עם טיפ כותנה 3 פעמים כמו כאבים מקומיים.
  9. להשתמש סכין כירורגי סטרילי לעשות חתך קטן (כ 5 מ מ) על העור מתחת לברך לחשוף את עצם השוקה. תרגיל הקדמוניות של עצם השוקה, כ- 2 מ מ מתחת לברך באמצעות מקדחה טוויסט מיקרו 0.8 מ מ. להיות זהיר לא. כדי לקדוח בשני cortices השוקה.
  10. מזריקים µL 1 תא ההשעיה (כ 2 x 105 תאים) לאט לאט (בכ-5 שניות) לתוך החור באמצעות מחט 26-מד. לסגור את החור עם טיפונת של רקמות דבק כדי למנוע זרם אחורי של ההשעיה.
  11. סגור את העור עם התפרים monofilament וטיפה אחת של דבק רקמות. תן את שחזור בעלי חיים בסביבה מחומם היטב (שימוש מנורת חימום). אין להשאיר בעלי חיים ללא השגחה עד שהם יש חזרה להכרה מספקת כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. רק לאחר החיות הם החלימו לחלוטין מן ההרדמה, להחזיר אותם לכלובים שלהם.
  12. יומיים לאחר חיסון הגידול, להזריק EV משכילים או נאיבית GFP-חיוביות MSCs (106 תאים ב- 100 µL PBS, ראה שלב 3.5) דרך הווריד בעזרת מזרק אינסולין 0.5 mL בווריד הזנב של העכברים.
  13. בעקבות הגידול ביולומינסנציה הדמיה26 פעמיים בשבוע. לשם כך, להחדיר את i.p. עכברים 150 µL D-luciferin (30 מ"ג/מ"ל) עם מזרק אינסולין. עשר דקות לאחר ההזרקה, מקם את החיות ב ביולומינסנציה מערכת הדמיה ומדידת הפוטון-שטף שנוצר על ידי תאים סרטניים.
  14. בנוסף, למדוד את הקוטר של העצם-הגידול העיקרי עם caliper. עוצמת הקול של הגידול (ב מ מ3) מוערך על ידי רוחב x אורך2 x 0.5.
  15. הערה: נקודות קצה הומאני מוגדרים בקוטר של גידול > אובדן 15 מ"מ או משקל > 15%.

7. הערכת מספר נודולה בריאה

  1. כאשר אחד מבעלי החיים מגיע נקודת הקצה הומאני שהוגדרו בשלב 6.14 (בכ-3-4 שבועות), לסיים את הניסוי, לאסוף ולנתח כל רקמות הרלוונטיים.
  2. עשר דקות לפני euthanization, להזריק 150 µL D-luciferin (30 מ"ג/מ"ל) בעזרת מזרק אינסולין 0.5 mL.
  3. עזים ומתנגד החיות עם הרדמה שאיפה איזופלוריין (ראה שלב 6.7). לאשר את העומק של הרדמה על ידי העדר תגובות של העכבר כדי לצבוט את הבוהן. המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם27.
  4. לאסוף את הריאות, הכבד, הטחול והכליות באמצעות פינצטה ומספריים מעוקר. לשטוף את האיברים ב- PBS להסיר סימני דם. ולשים אותם על צלחת פטרי.
  5. מקם את צלחת פטרי עם האיברים ביולומינסנציה מערכת הדמיה. למדוד את האות ביולומינסנציה משני הצדדים של האיברים. מיד לאחר מדידה, מזנקת האברים בפורמלין 4% לקבע אותם (24-72 שעות, ב- RT) לבדיקה היסטולוגית בעתיד.
  6. לעבד את התמונות שהושג עם תוכנת הדמיה המתאימה על ידי קביעת סף ידנית. לספור את מספר גושים ריאות על כל תמונה. לספור את המספר הכולל של הריאה גושים בשני הצדדים של הריאות.

8. ניתוח היסטולוגית

  1. לצורך בדיקה היסטולוגית של רקמות הריאה:
    1. להטביע את האיברים פורמלין-קבוע פרפין והכן 6 שקופיות רקמות מיקרומטר.
    2. Deparaffinate רקמת הריאה שקופיות ולבצע אנטיגן אחזור על ידי הרתחה אותם למשך 15 דקות 0.01 M ציטראט מאגר (pH 6).
    3. דגירה השקופיות אופקית בטמפרטורת החדר עם vimentin נגד 1:150 נוגדנים (200 µg/mL) מדולל ב נוגדן-diluent (זמינים מסחרית) ובעקבות כך עם הנוגדן המשני, התווית על-ידי HRP (0.5 מ"ג/מ"ל, דילול שבערך). כתם הרקמות עם 3'-diaminobenzidine (DAB) ו hematoxylin מונה מכתים.
    4. להתבונן השקופיות רקמות מוכתם נעזרת במיקרוסקופ אופטי מצמידים את המצלמה המתאימה והתוכנה התמונה.
  2. כדי להעריך את הנוכחות של MSCs GFP-חיוביות ב- tibias העכבר:
    1. Decalcify את tibias בחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) 0.24 מ', pH 7.2-7.4. רענן מאגר EDTA בכל יום עד העצמות להיות גמיש (כ 1 בשבוע).
    2. מייבשים tibias, לחדור אותם עם פרפין. להטביע את tibias (כולל רקמות אוסטאוסרקומה) בבלוקים פרפין.
    3. השתמש מיקרוטום להכין 6 מקטעים פרפין מיקרומטר. במקום הסעיפים פרפין על גבי מדרון זכוכית. לאחר הייבוש, לאחסן שקופיות ללילה בטמפרטורת החדר.
    4. לבצע אחזור אנטיגן בתיווך חום באמצעות מאגר ציטראט (ראה 8.1.2) כתם הרקמות עם נוגדן anti-GFP (כל תרופת-נגד) ב- 1:900 לדילול ב נוגדן-diluent. Counterstain הרקמות עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי).
    5. לבחון את השקופיות רקמות עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצמידים את תוכנת הדמיה המתאימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, חרשנו את היכולת של EVs מופרש אוסטאוסרקומה שיקנו MSCs הפנוטיפ pro-tumorigenic ו- pro-גרורתי. אנו מראים כי תאים אוסטאוסרקומה לשחרר EVs exosome כמו זה הם לנחלתו של MSCs. אנו נמדדים משינוי של פרופיל ביטוי ציטוקינים MSC המושרה על ידי סרטן EVs, להעריך את ההשפעה של MSCs משכילים EV על הגידול ויצירת גרורות. ייצוג כללי של תכנון המחקר מודגם באיור1.

EVs שפורסמו על ידי תאים 143B אוסטאוסרקומה או שליטה א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מופרש גידול שלפוחית חוץ-תאית (EVs) יכול לשנות את הפיזיולוגיה של מקומי ומרוחק לתאי mesenchymal כדי ליצור סביבה תומכת-הגידול. כאן נתאר את הדור של דגם פרה העכבר של אוסטאוסרקומה המאפשר ניתוח של EV בתיווך האינטראקציות בין תאים סרטניים, תאי גזע mesenchymal (MSCs) ויוו. אנו מראים כי הזרקת מערכתית של גידול אנושי משכילים EV MSCs בעכברים הנושאת אוסטאוסרקומה xenografts חריפה מקדמת היווצרות וצמיחה של גרורות סרטן על ידי הפעלת IL-6/STAT3 מסלול איתות7.

מחקרים שנעשו לאחרונה הר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ס. ר Baglio נתמכה על ידי התחברות מאת Associazione Italiana לכל סול החיפוש אחר la Cancro (למקורות) שותפה במימון על ידי האיחוד האירופי. בנוסף, הפרויקט הזה קיבל מימון אופק 2020 תכנית של האיחוד האירופי מחקר וחדשנות בהסכם גרנט מארי Sklodowska-קירי לא 660200 (לס. ר Baglio).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד
אולטרה צנטריפוגהBeckmanOptima L-90K
רוטור SW32TiBeckman369650המכונה בכתב היד רוטור דלי מתנדנד במיוחד
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורZeissEM109או מצלמה דיגיטלית TEM דומה
NikonDMX 1200Fאו מצלמה דומה
תוכנת הדמיה TEM ניקוןACT-1
מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeissImager.D2מיקרוסקופ פלואורסצנטי
דומה FMZeissZEN Blue
IncubatorNuaire4750E
HettickROTANTA 460R-80
מקפיאתרמו אלקטרו תאגידn.a.
FACSBDBD FACScaliburאו ציטומטר זרימה דומה
מקדחהFermFCT-300עם מקדחה 0.8 מ"מ
מקדחות מיקרו טוויסט HSS, 0.8 מ"מProxxon28 8520.8 מ"מ מקדחה
מצלמת IVISXenogenIvis Luminaהמכונה בכתב היד מצלמת ביולומינסנציה. Xenogen הוא כעת חלק מתוכנת התמונה Perkin Elmer
Living 2.60Xenogen / Igor Porn.aXenogen הוא כעת חלק מ- Perkin Elmer
10 µ L מזרקהמילטוןנוירוס דגם 1701 מחט RN
: מחט המילטון RN למזרק, מד 26, Pointstyle AS, אורך מותאם אישית 2 ס"מהמילטוןn.a.קליפר
MitutoyoG08004463
AutoclaveAstelln.a.מנורת
חוםפיליפסn.a.
<חזק>מדיה תרבותית
סרום בקר עובריHycloneRYG35912
טסיות דם ליזאטn.a.n.a.IMDM
בינונילונזהBE12-722F
אלפא-MEM בינונילונזהBE02-002F
DMEM בינונילונזהBE12-614F
עט/סטרפטוק/גלוטמיןGIBCO10378-016
הפריןLEO012866-08
טריפסין/EDTA (10x)GIBCO15400-054
<תאים חזקים>
שומנים ללא MSCsn.a.n.a.gp
חיוביים ל-GFP
אנושייםn.a.n.a.
143B תאיםATCCCRL-8303
תאי FLUC-143BATCCCRL-8303תמורים
<חזקים>חד פעמיים
צלוחיות תרבית 175 סמ"רצינורות CELLSTAR660175
50 מ"לגריינר ביו-אחד210261
צינורות הקפאה377224תרמו-מדעי
שפופרות אולטרה-שקופותבקמן344058המכונה בכתב היד שפופרות אולטרה-צנטריפוגות
0,22 ומיקרו; m פילטרMillexSLGV033RS
200 רשת רשתות ניקל מצופות פחמן FormvarEMS (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית)
0.5 מ"ל מזרקי אינסולין עם מחט 29GTerumoU-100 
צלחת פטריסיגמא - AldrichP7612
נייר סינון תרמו פישר סיינטיפיק50363215
<ריאגנטים חזקים>ערכות
פרפורמלדהידאלפא אייזר43368.9M
PBSבראון220/12257974/110
גלוטראלדהידEMS (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית)16300
אורניל אוקסלטEMS (מיקרוסקופ אלקטרונים מדעים)22510
אוראני אצטטEMS (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית)22400
מתיל צלולוזEMS (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית)1560
PKH67סיגמאמיני67-1ktהמכונה בכתב היד GFLD
BSASigmaA8412
CBA - ערכת ציטוקינים דלקתיים אנושייםBD551811
פורמלדהיד 37%VWR104003100
להבים כירורגיים מפלדת פחמןSwann-Morton206המכונה בכתב היד נוגדן סכין כירורגית
אנטי אנושי וימנטיןסנטה קרוזsc-6260שיבוט
V9 מדלל נוגדניםDAKOS0809
HRP תווית נוגדן IgG נוגדן IgGTechnologies32230
DAB-kitDAKOK500711
המטוקסיליןSigmaGHS232
EDTA-buffer
buffern.a.n.a.rabbit
פוליקלונלי נוגדן אנטי-GFPAbcamn.a.Ab290
DAPI Life TechnologiesD1306
אקמול, סירופ 120 מ"ג / 5 מ"לבאיירn.a.Sinaspril, תמיסת אקמול לילדים
איזופלורן 1000 מ"ג/גרםבית מרקחת Vumcn.a.buprenofine
הידרוכלוריד, 0.3 מ"ג/מ"לIndivior UK Limited
2%Vumc בית מרקחתn.a.70
% אתנולVWR93003.1006
דבק רקמותDerma + Flex, נוסחה רפואית ציאנואקרילטVygonLB604060
טיפות עיניים: Vidisec Carbogel, 2 מ"ג / מ"לBausch + Lombn.a.D-luciferin
, מלח אשלגןזהב ביוטכנולוגיהLUCK-1
זכוכית שקופיותתרמו סיינטיפיק630-0954
לולאות נירוסטה n.a.n.a.
<ניסויים בעכברים חזקים>עכברים,
Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,  נקבה, 6 שבועות עם ההגעה, סטטוס חיידקים תואם FELASAENVIGOn.a.בית
חכם עיסת נייר (העשרה בכלוב)Bio Servicesn.a.חומר
מצעי אלפא-דריניירות מיוחדים Shepperdn.a.
מזון עכברים: Teklad גלובלי 18% חלבון דיאטת מכרסמיםENVIGO2918-11416M
תפריםEthiconV926H
מספרייםSigma-AldrichS3146-1EA(או דומה)
פינצטהSigma-AldrichF4142-1EA(או דומה)
או תוכנת הדמיה n.a.n.a.a.פיברובלסטים Life n.a.n.a.Citrate n.a.lidocaine-HCL

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
  3. Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795(2013).
  4. Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
  5. Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
  6. Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
  7. Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
  8. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  9. Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
  10. Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31(2017).
  11. Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
  12. Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
  13. Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
  14. Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  15. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  16. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
  17. Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
  18. Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
  19. Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
  20. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
  21. Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
  22. Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
  23. Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127(2015).
  24. Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
  25. Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
  26. Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
  27. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  28. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  29. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  30. Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
  31. Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
  32. Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
  33. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  34. Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים