הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטה פשוטה ומהירה להשיג גידול איכותיים הדנ א של דגימות קליני-פתולוגיים באמצעות מגע ההטבעה ציטולוגיה

10.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56943

⸱

21 במרץ 2018

 ,  ,  , 
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

במאמר זה

סיכום

קבלת דנ א גנומי באיכות גבוהה רקמות הגידול, מהווה צעד ראשון חיוני לניתוח שינויים גנטיים באמצעות רצף הדור הבא. במאמר זה, נציג שיטה פשוטה ומהירה כדי להשיג שלמות הדנ א של מגע ההטבעה ציטולוגיה דגימות ולהעשיר תאים סרטניים.

תקציר

זה חיוני כדי לקבוע את מצב mutational בסרטן לפני ניהול וטיפול בתרופות ספציפיות יישוב מולקולרית לחולי סרטן. בהגדרה קלינית, פורמלין-תיקון רקמות (FFPE) פרפין-מוטבע נמצאים בשימוש נרחב עבור בדיקה גנטית. עם זאת, FFPE DNA בדרך כלל פגום, מקוטעת במהלך תהליך פיקסציה עם פורמלין. לכן, FFPE DNA היא לפעמים לא נאותה בדיקות גנטיות עקב איכות נמוכה והן את כמות ה-DNA. כאן אנו מציגים שיטת מגע ההטבעה ציטולוגיה (טיק) להשיג DNA גנומי תאים סרטניים, אשר יכול להיות שנצפו תחת מיקרוסקופ. מספרי הטלפון הנייד מורפולוגיה, סרטן תאים שניתן להעריך באמצעות דגימות טיק. יתר על כן, הפקת דנ א גנומי מדגימות טיק יכולה להסתיים בתוך יומיים. הסכום הכולל ואיכות DNA טיק שהושג באמצעות שיטה זו הייתה גבוהה יותר מזו של ה-DNA FFPE. שיטה זו מהירה ופשוטה מאפשרת לחוקרים להשיג DNA באיכות גבוהה עבור בדיקות גנטיות (למשלניתוח רצף של הדור הבא, ה-PCR דיגיטלי, בזמן אמת כמותיים PCR), כדי לקצר את משך העבודה על דיווח תוצאות.

מבוא

הדור הבא רצפי טכנולוגיה סיפקה החוקרים התקדמות משמעותית ניתוח הגנום מידע וריאציות גנטיות, מחלות Mendelian, נטייה תורשתית ו סרטן 1,2,3 . סרטן הגנום אטלס (TCGA) של קונסורציום גנום הסרטן הבינלאומי (ICGC) רדף את הזיהוי של שינויים גנטיים של מספר סוגי סרטן נפוצים4. מאות סרטן חיוני הנהג גנים זוהו בהצלחה ולאחר כמה מולקולות אלה מיועדים עבור סמים פיתוח1,5,6.

בהגדרה קלינית, דגימות FFPE משמשים אבחנה פתולוגית ולבדיקה מולקולריות למחלות שונות, כולל סרטן. אולם, במהלך תהליך פיקסציה עם פורמלין, חלבון-דנ א או DNA-DNA cross-linking מתרחש, פיצול הדנ א הוא המושרה. לפיכך, דגימות די אן איי FFPE אינם תמיד מתאימים לבדיקה גנטית עקב איכות נמוכה והן את כמות ה-DNA-7,-8,-9. בנוסף, לוקח מספר ימים כדי להכין דגימות FFPE, מיומנות טכנית יש צורך להכין במדויק את הסעיפים. לכן, רצוי לפתח שיטה פשוטה ומהירה להשגת DNA ללא פגע באיכות גבוהה.

ציטולוגיה היא שיטה אלטרנטיבית לאבחון פתולוגי. הכנת הדוגמא cytological הוא פשוט יותר, פחות גישה יקר, מהירה יותר לעומת הכנה FFPE10. הטכניקה טיק בוצע נטור הלימפה וברקמות שולית של חולי סרטן השד לאבחון מהיר פוסט11,כמה שנים12. עם זאת, ישנם דיווחים מעטים יש בחן אם הדנ א הגנומי באיכות גבוהה יכול להיות מופק דגימות טיק, ומשמש לצורך ניתוח גנטי מאוחר יותר. דגימות cytological בדרך כלל מוכתמים פאפאניקולאו (Pap) או צביעת Giemsa ולאחר בעבר דיווחנו כי כמות ואיכות DNA מופק טיק דגימות (במיוחד שהוכתמו Giemsa דגימות) נעלים על דגימות המתקבל FFPE רקמות13. לעומת Pap מכתים, צביעת Giemsa יש יתרון שאינו דורש פחות הליכים מוכתמים. ב- Pap מכתים, לאחר הדגימות קבוע, צבעונית, הם חייב להיות מותקן עם הרכבה בינונית (למשל, Malinol) להבחנה בין דגימת תוכן, כגון תאים סרטניים, תאים נורמליים ותאים דלקתיים תחת מיקרוסקופ. אם הדגימה Pap מוכן ללא השלב הרכבה, זה כמעט בלתי אפשרי לקיים את התאים במיקרוסקופ כי הדגימה הוא מיובש. לשם השוואה, צביעת Giemsa יכול להיות שנצפו במדינה מיובשים, לכן, הצעד הרכבה אינו נחוץ לצורך הערכה סלולרית מהירה. עבור microdissection, צביעת Giemsa הוא מתאים יותר כי זה דורש דגימות יבש.

בדו ח זה, אנו להציג שיטה פשוטה ומהירה להכנת דגימות טיק עם צביעת Giemsa, להדגים כי טיק הוא מקור טוב יותר עבור ה-DNA לעומת דגימות FFPE.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. טיק הכנה מהירה הערכת מיקרוסקופיים באמצעות זכוכית רגילה מחליק

  1. בצע טיק ההכנה בהקדם האפשרי לאחר רקמת פתולוגיים קליניים חומרים זמינים. אם מיד אין אפשרות להכין דגימות טיק, שומרים שהחומרים רקמות מכוסה עם תמיסת מלח לחלח גזה סטרילית ולאחסן במקרר כדי למנוע התייבשות של רקמות.
  2. להכין 5 מ מ3 רקמות חומר כגון גידולים מוצקים (כגוןהכבד, הריאות, רקמות השד) מתקבל קלינית על ידי ניתוח או אנדוסקופיה.
    1. לנגב את הרקמה עם גזה סטרילית מצופה עם תמיסת מלח פיזיולוגית ולהסיר בעדינות דם, אם השטח רקמות יש הרבה דם.
    2. עבור דגימות מיקרוסקופיים כגון ביופסיה חומר, לשמור את הדגימה לחלח עם גזה סטרילית טבולים תמיסת מלח פיזיולוגית.
  3. לחתוך לחתוך את הרקמות עם סכין חיתוך, לחשוף את פני השטח של הנגע הגידול, אם ההמונים גידול אינם גלויים בגסות.
  4. לגעת השטח הגידול של דגימות resected לשקופית זכוכית רגילה מספר פעמים עם ידיים בכפפות. באופן חזותי אשר שלאזור נגע היא מעל 80% של השקופית זכוכית רגילה.
  5. בקלילות לחצו על השקופית זכוכית רגילה נגד naphthalate פוליאתילן (עט) שקופית ממברנה, לשפשף בעדינות 2 - 3 פעמים עם ידיים בכפפות. באופן חזותי אשר שהתאים מועברים משקופית זכוכית רגילה השקופית ממברנה עט.
  6. מילה נהדרת של זכוכית וגם עט ממברנה שקופיות עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. כתם על השקופית זכוכית רגילה לבדיקה cytological ישירה. טובלים בשקופיות זכוכית עם מקבע פתרון עבור 5 s ולאחר מכן הכתם עם Giemsa מכתים פתרון עבור 15 s.
  8. להעריך לבין מסך את הגידול התכנים ואת cellularity על השקופית זכוכית רגילה לחלוטין עם מיקרוסקופ להערכה מהירה. להעריך את תאי הגידול מבוסס על מספר קריטריונים; הגדלת גרעיני קריוטיפ נורמלי, כרומטין שופע, חלוקה לא שווה של תאים, יחס של רכיב רכיב/cytoplasmic גרעינית, גודל תא תא קוטביות.

2. הכנה של הסרט שקופיות ממברנה עט בדיקות סקר גנטיות

  1. אם המדגם מציגה גידול cellularity למעלה מ-60% על ידי הערכה מהירה מיקרוסקופיים (שלב 1.8), נחתך הסרט הגידול-נגע של השקופיות ממברנה עט להפקת DNA, בכפפה ידיים. להעביר את הסרט לחתוך צינור microcentrifuge סטרילי עם pincette והידיים בכפפות.
  2. אם cellularity הגידול נקבע כ נמוך (פחות מ- 60% של התכנים הגידול) ע י הערכה מהירה מיקרוסקופיים (שלב 1.8), לייזר לשימוש ללכוד את microdissection, להשיג דגימות הגידול.
    1. לבצע Giemsa מכתים כדי להעריך את תאי הגידול באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.
    2. חותכים את הסרט של השקופית ממברנה PEM על ידי לייזר מתאים ללכוד microdissection.
    3. להעביר את הסרט לחתוך צינור microcentrifuge סטרילי עם pincette והידיים בכפפות.
    4. לאחסן את הצינור microcentrifuge המכילים הסרט ב 4 ° C עד מיצוי DNA (הפרוטוקול ניתן להשהות כאן).

3. דנ א החילוץ

  1. לבצע הפקת דנ א מדגימות טיק או FFPE הרקמה באמצעות ערכת חילוץ FFPE DNA על-פי הוראות היצרן עם שינויים מזעריים. ערכת מקביל זמין עבור השלב מיצוי הדנ א FFPE.
  2. להוסיף µL 180 מאגר פירוק רקמת (ה-pH = 8.3) כדי ברכבת התחתית microcentrifuge המכיל סרט עם פיפטה 200 ידנית-µL. הוסף 20 µL של proteinase K עם פיפטה 20 ידנית-µL, שילוב על-ידי vortexing עם מערבל מערבולת במהירות מרבית (כ 2500 סל ד) עבור 5 s.
  3. דגירה בדגימות ב 56 ° C בלילה עם אינקובטור אוויר.
  4. דגירה בדגימות FFPE, טיק ב 90 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום 1 h ו- 10 דקות, בהתאמה. ספין בקצרה דרך צינור microcentrifuge ב g x 1,500 5 s בטמפרטורת החדר עם צנטריפוגה מיני.
  5. להוסיף 200 µL פירוק מאגר הדגימה עם 200-µL פיפטה, לערבב ביסודיות על ידי vortexing במהירות המרבית עבור 5 s.
  6. להוסיף 200 µL של אתנול (96-100%) עם פיפטה 200-µL ולערבב היטב על ידי vortexing במהירות המרבית עבור 5 ס' בקצרה ספין דרך צינור microcentrifuge ב g x 1,500 5 s בטמפרטורת החדר עם צנטריפוגה מיני.
  7. בזהירות להעביר את כל lysate העמודה ספין עם 1,000-µL פיפטה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות ב- 25 ° C.
  8. מקם את העמודה ספין צינור נקי 2-mL אוסף עם ידיים בכפפות, ולמחוק את הצינור אוסף המכיל את הזרימה דרך לתוך קופסת פלסטיק סילוק.
  9. להוסיף 500 µL מאגר שטיפת העמודה ספין עם 1,000-µL פיפטה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות ב- 25 ° C.
  10. מקם את העמודה ספין צינור נקי 2-mL אוסף עם ידיים בכפפות, ולמחוק את הצינור אוסף המכיל את הזרימה דרך לתוך קופסת פלסטיק סילוק.
  11. להוסיף 500 µL מאגר שטיפת העמודה ספין עם 1,000-µL פיפטה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות ב- 25 ° C.
  12. למחוק את הצינור אוסף המכיל את הזרימה דרך לתוך קופסת פלסטיק סילוק. מקם את העמודה ספין צינור נקי 1.5-mL microcentrifuge עם ידיים בכפפות, צנטריפוגה-g x 20,000 עבור 3 דקות 25 ° c כדי לייבש את הקרום.
  13. מקם את העמודה ספין צינור איגוד ה-DNA-נמוכה עם ידיים בכפפות.
    1. להוסיף 40-50 µL • תנאי מאגר המרכז של הקרום עם פיפטה 100-µL.
    2. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 1 דקות ב- 25 ° C.
    3. לאחסן דגימות ה-DNA ב-20 ° C עד השלב הבא (הפרוטוקול ניתן להשהות כאן).

4. הערכה של איכות DNA על ידי בזמן אמת כמותיים PCR

  1. הכנת המיקס ראשיים צינור microcentrifuge סטרילי עם פיפטה, כדלקמן: 10 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR בזמן אמת, µL 1 של 20 x RNase P פריימר-בדיקה מיקס (גודל אמפליקון: 87 bp), ו- 8 µL של מים נטולי נוקלאז סטרילי.
  2. הכנת המיקס המאסטר השני בצינור microcentrifuge סטרילי אחת כדלקמן: 10 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR בזמן אמת, µL 1 של 20 x RNase P פריימר-בדיקה מיקס (גודל אמפליקון: 268 bp), ו- 8 µL של מים נטולי נוקלאז סטרילי.
  3. ביצוע דילולים טורי של DNA גנומי לשליטת האדם (המסופקים בערכה) 4 פעמים עבור עיקול רגיל 5 הנקודות ולקבוע את ריכוזי מוחלט דנ א13.
  4. להוסיף µL 19 של תערובות שני מאסטר מוכן (להכין בשלב 4.1 ו- 4.2) לתוך בארות נפרדים של צלחת תגובה 96-ובכן אופטי עם פיפטה 20-µL.
  5. להוסיף 1 µL של FFPE DNA או טיק DNA כדי להפריד בארות המכיל את התמהיל התגובה עם פיפטה 2-µL. להוסיף 1 µL של מים נטולי נוקלאז לבאר נפרד המכיל את תערובת התגובה עבור הפקד בתבנית אין.
  6. להחזיק את הצד ללא דבק של סרט דביק אופטי, לקלף המגן גיבוי מהמרכז של הסרט. בעדינות לגרור את המוליך על הסרט, לאטום את הסרט יניף 96-ובכן.
  7. מערבבים בעדינות את הצלחת 96-ובכן באמצעות מערבל 96-ובכן צלחת 10 s בטמפרטורת החדר 2,000 סל ד. Centrifuge את הצלחת בקצרה-1000 g x עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. כוח על מכשיר PCR, הוסף הצלחת 96-ובכן בזמן אמת. הפעל את תגובות PCR באמצעות פרוטוקול הבאים: 95 ° C עבור 20 s, ואחריו 45 מחזורי 95 ° C עבור 1 s ו- 60 ° C עבור 20 ס' שימוש "עיקול רגיל" ו- "מצב מהיר".
  9. להעריך את הפיצול DNA עם היחס של DNA (כימות יחסית; RQ) השיג עבור אמפליקון ארוך (268 bp) אמפליקון קצר (87 bp). RQ הוא הערך הממוצע של הערך את זמן אמפליקון אומר של קצר אמפליקון13.

5. הכנה של הספרייה רצף של הדור הבא

  1. היכונו הספרייה רצף רצף הדור הבא על פי הוראות היצרן.
  2. להכין את התמהיל מולטיפלקס PCR ראשיים צינור microcentrifuge סטרילי עבור דגימה כדלקמן: 4 µL של 5 x PCR מולטיפלקס התגובה פתרון, 4 µL של 5 x פריימר בריכה, µL ≤6 טיק או FFPE דנ א (1-100 ng), ולהוסיף מים נטולי נוקלאז 20 µL.
    1. הוסף המיקס מאסטר מולטיפלקס PCR PCR שפופרת, לערבב בעדינות על-ידי הקשה את הצינור.
    2. ספין בקצרה דרך צינור microcentrifuge ב g x 1,500 5 s בטמפרטורת החדר עם צנטריפוגה מיני.
  3. הפעל את תגובות PCR באמצעות פרוטוקול הבאים: 99 º C למשך 2 דקות, ואחריו 20 מחזורים של 99 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C 4 דקות, החזקת שלב 10 מעלות צלזיוס. בקצרה ספין דרך צינור PCR עם צנטריפוגה מיני ב 1,500 x g 5 s בטמפרטורת החדר.
    הערה: לקבוע את מספר מחזורי מבוסס על מספר זוגות פריימר.
  4. פותחים את המכסה של הצינור PCR, וכן להוסיף 2 µL של האנזים הגבלה עם פיפטה 2-µL. . סגור את המכסה של צינור ה-PCR, לערבב בעדינות על-ידי הקשה הצינור PCR בקצרה ספין דרך צינור PCR עם צנטריפוגה מיני ב 1,500 x g 5 s בטמפרטורת החדר.
  5. הפעל את תגובות PCR באמצעות פרוטוקול הבאים: 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 60 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, וצעד מחזיק 10 מעלות צלזיוס. בקצרה ספין דרך צינור PCR עם צנטריפוגה מיני ב 1,500 x g 5 s בטמפרטורת החדר.
  6. להוסיף מתאם מצדו מיקס מאסטר לתוך כל טוב המכילה את amplicons ה-PCR מתעכל עם פיפטה כדלקמן: µL 4 של מתאם מצדו פתרון, 0.5 µL של ברקוד, 0.5 µL של מתאם, µL 2 של מים נטולי נוקלאז ו 2 µL של ה-DNA ליגאז. . סגור את המכסה של צינור ה-PCR, לערבב בעדינות על-ידי הקשה בקצרה ספין דרך צינור PCR עם צנטריפוגה מיני ב 1,500 x g 5 s בטמפרטורת החדר.
  7. הפעל את תגובות PCR באמצעות פרוטוקול הבאים: 22 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 68 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, וצעד מחזיק 10 מעלות צלזיוס.
  8. לטהר את ספריית רצף עם חרוזים מגנטי לפי הוראות היצרן.
  9. העברת הפתרון הספרייה ובין אם-לא מתאם לתוך הצינור נמוך-איגוד ה-DNA 1.5-mL. הוסף µL 45 של beads מגנטי לתוך הצינור נמוך-איגוד ה-DNA לטיהורst 1. לערבב בעדינות על-ידי הקשה הצינור, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. למקם את הצינור איגוד ה-DNA-נמוכה מתלה מגנטי, ולאחר מכן תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר עד הפתרון ברור. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע עם פיפטה 200-µL מבלי להפריע את החרוזים מגנטי.
  11. להוסיף 150 µL של אתנול 70% טריות עם פיפטה 200-µL ולאחר מכן להעביר את הצינור כדי לצד של המגנט לשטוף את החרוזים. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע את החרוזים מגנטי.
  12. חזור על שלב 5.11 לרחיצה השני.
  13. בקצרה ספין דרך צינור עם מיני צנטריפוגה ב 1,500 x g 5 s בטמפרטורת החדר. למקם את הצינור נמוך-איגוד ה-DNA מתלה מגנטי, וזורקים בקפידה את טיפות אתנול עם פיפטה 10-µL.
  14. הוסף µL 50 של טה נמוך לתוך הצינור נמוך-איגוד ה-DNA המכיל בגדר beads מגנטי כדי לפזר את החרוזים. תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  15. למקם את הצינור נמוך-איגוד ה-DNA מתלה מגנטי, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות עד הפתרון ברור.
  16. להעביר את µL 50 של תגובת שיקוע לתוך הצינור נמוך-איגוד ה-DNA חדש ולהוסיף µL 75 של beads מגנטי עם פיפטה 100-µL לטיהור 2nd . לערבב בעדינות על-ידי הקשה הצינור, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  17. למקם את הצינור נמוך-איגוד ה-DNA מתלה מגנטי, ולאחר מכן תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר עד הפתרון ברור. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע עם פיפטה 200-µL מבלי להפריע את החרוזים מגנטי.
  18. להוסיף 150 µL של אתנול 70% טריות עם פיפטה 200-µL ולאחר מכן להעביר את הצינור כדי לצד של המגנט לשטוף את החרוזים. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע את החרוזים מגנטי.
  19. חזור על שלב 5.18 לרחיצה השני.
  20. בקצרה לסובב דרך צינור באמצעות צנטריפוגה מיני ב 1,500 x g 5 s בטמפרטורת החדר. למקם את הצינור נמוך-איגוד ה-DNA מתלה מגנטי, וזורקים בקפידה את טיפות אתנול עם פיפטה 10-µL.
  21. הוסף µL 50 של טה נמוך לתוך הצינור נמוך-איגוד ה-DNA המכיל בגדר beads מגנטי כדי לפזר את החרוזים. תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  22. למקם את הצינור נמוך-איגוד ה-DNA מתלה מגנטי, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות עד הפתרון ברור.
  23. להעביר את µL 45 של תגובת שיקוע המכיל ספריית מטוהרים לתוך הצינור נמוך-איגוד ה-DNA חדש עם פיפטה 100-µL.

6. לכמת את הריכוז ספריית מאת בזמן אמת כמותיים PCR

  1. לקבוע את הריכוז של כל ספריה על פי הוראות היצרן13.
    1. להכין פתרון דילול 20-fold כדלקמן: לערבב 2 µL של ספריית מטוהרים µL 38 של נוקלאז ללא מים בצינור נמוך-איגוד ה-DNA עם פיפטה 2-µL, 100-µL.
    2. לאחסן את ספריות מדולל ב-20 ° C עד שלב 7.3.
  2. להכין פתרון דילול 200-fold כדלקמן: לערבב µL 5 של הספרייה 20-fold מטוהרים מדולל (להכין בשלב 6.1), 45 µL של נוקלאז ללא מים בצינור נמוך-איגוד ה-DNA.
  3. להכין פתרון דילול 2,000-fold כדלקמן: לערבב µL 5 של הספרייה 200-fold מטוהרים מדולל (להכין בשלב 6.2), 45 µL של נוקלאז ללא מים בצינור נמוך-איגוד ה-DNA.
  4. מכינים את תערובת הבסיס התגובה כדלקמן: לערבב 10 µL של 2 x מיקס מאסטר פתרון 1 µL של 20 x פריימר-בדיקה פתרון assay בצינור microcentrifuge סטרילי עם פיפטה ואז לערבב על ידי הקשה על הצינור. הוסף µL 11 של המיקס מאסטר התגובה לתוך הבארות של תגובה 96-ובכן אופטי.
  5. להוסיף כל טוב עם פיפטה 10-µL µL 9 של הספרייה מדולל 2,000-fold, 9 µL של כל פקד רגיל או µL 9 של נוקלאז ללא מים.
  6. להחזיק את הצד ללא דבק של סרט דביק אופטי, לקלף המגן גיבוי מהמרכז של הסרט.
    1. בעדינות לגרור את המוליך על הסרט, לאטום את הסרט יניף 96-ובכן.
    2. מערבבים בעדינות את הצלחת 96-ובכן באמצעות מערבל 96-ובכן צלחת 10 s בטמפרטורת החדר.
    3. Centrifuge את הצלחת בקצרה-1000 g x עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. כוח על מכשיר PCR, הוסף הצלחת 96-ובכן בזמן אמת. הפעל את תגובות PCR באמצעות פרוטוקול הבאים: 50 º C למשך 2 דקות, 95 ° C עבור 20 s, ואחריו 40 מחזורי 95 ° C עבור 1 s ו- 60 ° C עבור 20 ס' שימוש "עיקול רגיל" ו- "מצב מהיר".
  8. לחשב את הריכוז ספריית מדולל על-ידי הכפלת ריכוז שקבע עם qPCR 2,000.

7. רצף הדור הבא

  1. התנאי בניהול ותכנון להגדיר את הפרמטר לרוץ בתוך התוכנה.
    1. לחצו על [תוכנית כרטיסיית] ו- [תבנית], ובחר את שיטת ההפעלה המתאים.
    2. בחר את יישום והסוג טכניקה, ולאחר לחץ על [הבא].
    3. בחר את כלי ערכת הכנת המדגם (אופציונלי), סוג ערכת ספריה, תבנית קיט, רצף ערכת, לבסס מצב הכיול, צ'יפ סוג, לשלוט רצף (אופציונלי), ו ברקוד סט ולאחר לחץ על [הבא].
    4. בחר תוספים ' ולחץ על ' [הבא] '.
    5. בחר פרוייקט ' ולחץ על ' [הבא] '.
    6. בחר הפניה כברירת מחדל וקבצי המיטה של אזור ממוקד.
    7. הקלד את השם לדוגמה, בחר את הברקוד, ולחץ [להפעיל תוכנית].
  2. לבצע הכנת תבנית, צ'יפ שם מכשיר אוטומטי לפי הוראות היצרן. להפשיר את מחסנית ריאגנט בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות לפני השימוש.
  3. לדלל את ספריית מדולל במים נטולי נוקלאז לפי ריכוז ספריית שחושבו בצעד 6.8 ולעשות 20 ספריות pM.
    1. היכונו ספרייה במאגר רצף וחנות על קרח.
    2. להוסיף 25 µL של הספרייה במאגר עם פיפטה 100 µL לתחתית הצינור הדגימה. השתמש במאגר הספריה בתוך 48 שעות.
  4. כוח, פתח את המכסה של הכלי האוטומטי.
    1. מקם את רצף צ'יפ צ'יפ מתאם, העשרה מחסנית, עצה מחסנית, PCR צלחת, PCR מסגרת חותם, שחזור שפופרת, פתרון מחסנית, ריאגנט מחסנית למיקום המתאים של המכשיר האוטומטי.
    2. לגעת [הגדרת הפעלה] ו- [צעד אחר צעד] על המסך.
    3. סגור את המכסה ולגעת [הסימון התחלה] על המסך.
    4. לאחר שחולקה סריקה תהליך, לגעת [הבא] על המסך.
    5. בדוק את תוכן התצוגה (סוג ערכת, סוג שבב, צ'יפ מזהה, לדוגמה מזהה, תוכניות), לקבוע את הזמן ולאחר לגעת [אישור] על המסך.
  5. לאחר שסיים את טעינת שבב:
    1. לגעת [הבא] על המסך, פתח את המכסה.
    2. פרקו את השבב רצף של שבב מתאם עם ידיים בכפפות.
    3. מקם את השבב לתוך המיכל שבב, ראפ עם מצלמות-מיקרוסקופים וחנות ב 4 ° C עד התגובה רצף.
    4. להסיר את מחסנית העשרה PCR צלחת, PCR מסגרת חותם, שחזור שפופרת, פתרון מחסנית, ריאגנט מחסנית המיקום המתאים של המכשיר אוטומטית עם ידיים בכפפות.
    5. העברת מחסנית ריקה-טיפ למיקום עצה פסולת של המכשיר אוטומטית עם ידיים בכפפות.
    6. לגעת [הבא], סגור את המכסה.
    7. גע [התחל] ולאחר לנקות את המכשיר אוטומטית על ידי קרני אולטרה סגול במשך 4 דקות.
  6. להמיס לוח הכלוריט נתרן ב- 1,000 מיליליטר מים הנדסה גנטית ופתרון הסינון עם יחידת מסנן מסנן 0.22-מיקרומטר זרימה.
    1. כוח על הכלי רצף.
    2. לגעת [נקיים] [הבא] על המסך של המכשיר רצף.
    3. לנקות את המכשיר רצף עם 250 מ של פתרון הכלוריט נתרן מחוטא-מסנן, לאחר מכן 250 מ של מים הנדסה גנטית.
  7. לגעת [Initialize] ובחר ערכת רצף המתאים על המסך.
    1. התקנת מחסנית אפור במיקום המתאים עם ידיים בכפפות.
    2. אתחל את המכשיר רצף עם הפתרון לשטוף (המסופק בערכה), הפתרון התאמת חומציות (מכיל 350 µL של 100 מ מ נתרן הידרוקסידי) הפתרון הסטנדרטי pH (המסופק בערכה).
  8. הוסף 20 µL של dATP, dGTP, dCTP ו- dTTP נוקלאוטידים (המסופק בערכה) 50-mL צינורות (שסופק בערכה) עם פיפטה 100-µL.
    1. התקנת מחסנית אפור במיקום המתאים עם ידיים בכפפות.
    2. לטעון את שפופרת 50-mL ואת בורג על גבי המכשיר רצף.
    3. לגעת [הבא] על המסך כדי להתחיל את השלב האתחול, אשר לוקח כ 25 דקות.
  9. לאחר השלמת השלב אתחול:
    1. לגעת [הפעלה] על המסך, בחר הכלי הכנה הספריה המתאימה.
    2. סרוק את הברקוד דו-ממדית של השבב.
    3. הכנס את השבב רצף על המיקום המתאים.
    4. סגור את הדלת קלאמפ ולכלי הנגינה של צ'יפ.
    5. לגעת [שבב הסימון], [הבא], ותקינות [] על המסך כדי להתחיל בהפעלה רצף.
  10. לאחר התגובה רצף, להעביר את הנתונים ולבצע צינור-ניתוח נתונים על רצף שרת13,17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג את כל התהליך החל משלב הכנת טיק דגימות DNA החילוץ. ראוי לציין, התהליך לוקח רק יומיים להשיג DNA גנומי דגימות טיק. הערכנו כל תופעות של הגידול אחסון לפני עיבוד שקופיות. מצאנו כי תאים סרטניים שהיו מחוברים אל השקופית זכוכית כאשר דגימות רקמה הושפעו מיד על גבי השקופית, וכאשר רקמות הוחזקו ב- saline בטעימת-גזה סטרילית לשעה (איור 2). עם זאת, כאשר רקמות נשמרו בטמפרטורת החדר, לתאי הגידול לא טוב צורפו לשקופית. יכול לאחסן שקופיות שה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, הצגנו שיטה חלופית להשגת גידול הדנ א של דגימות פתולוגיים קליניים באמצעות טיק. טיק ההכנה היא פשוטה מאוד וזקוק בפחות זמן לעומת שיטות FFPE, ללא הדרישה מכשירים מיוחדים10. כל ההליכים משלב הכנת טיק כדי מיצוי הדנ א יכולה להסתיים בתוך יומיים (איור 1). שיטה זו ובכך מקצר את משך העבודה על ביצוע בדיקה גנטית. ראוי לציין, זה מספק יתרון משמעותי קיצור מספר הימים הנדרשים לבדיקה מולקולרית. זמן אספקה קצר זה מאפשר לנו להציע טיפול המתאים באופן מיידי לחולי סרטן מתקדם הזקוקים סמים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים כל הצוות הרפואי ואת נלווים של החולים ושל המטופלים על מסכים להשתתף. אנו מודים גבריאל לבן וולף, PhD, מקבוצת Edanz (www.edanzediting.com/ac) עבור עריכת טיוטה של דו ח זה. מחקר זה נתמך על ידי מענק הסיוע פרויקט מחקר הגנום של פריפקטורה של יאמאנאשי (י. ח, שיטת הפעולה), מענק מ של יאסאדה רפואי קרן (י. ח).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
FINE FROST לבן20 מיקרו שקופיות זכוכיתMatsunami זכוכית ind, LtdSFF-011
Arcturus PEN ממברנה זכוכית שקופיותתרמו פישר מדעיLCM0522
Cyto מהיר פתרוןמוטו טהור כימיקלים20571
Cyto Quick B פתרוןמוטו טהור כימיקלים20581
מאי-גרונוולד פתרוןמוטו כימיקלים טהורים15053
תמיסת Giemsaמוטו כימיקלים טהורים15002
ערכת רקמות QIAamp DNA FFPEQiagen56404
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557
TaqMan RNase P זיהוי ריאגנטים ערכתThermo Fisher Scientific4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay V2Thermo Fisher Scientific4324034
MicroAmp צלחת תגובה אופטית מהירה 96 בארות תרמו פישר מדעי4346907
מיקרו אמפר סרט דבק אופטיתרמו פישר 4311971
מיקרומיקסר E36TITEC0027765-000
ViiA 7 מערכת PCR בזמן אמתתרמו פישר מדעיVIIA7-03
Himac CF16RXIIהיטאצ'י-קוקיCF16RII
ספריית יונים ערכת כימות TaqManThermo Fisher Scientific4468802
Ion AmpliSeq פאנל נקודה חמה סרטן v2Thermo Fisher Scientific4475346
Ion AmpliSeq ספריית ערכת 2.0Thermo Fisher Scientific4480442
Ion Xpress מתאמי ברקוד 1-16 ערכהThermo Fisher Scientific4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 בסיס)Thermo Fisher ScientificA30044
Ion Chef SystemThermo Fisher Scientific4484177
Veriti 96-well תרמי CyclerThermo Fisher ScientificVeriti200
Ion 318 ערכת שבבים v2 BCThermo Fisher Scientific4488150
Ion PGM SystemThermo Fisher ScientificPGM11-001
Ion PGM לשטוף 2 בקבוקים ערכתThermo פישר סיינטיפיקA25591
Agencourt™ AMPure™ XP KitBeckman CoulterA63881
מעמד מגנטי 16 מצביםThermo Fisher Scientific4457858
נון-סטיק, צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"ל (צינור כריכה נמוך)Thermo Fisher ScientificAM12450
מים ללא נוקלאזThermo Fisher ScientificAM9938
MicroAmp™ צלחות תגובה אופטיות 96 בארותThermo Fisher Scientific4306737
MicroAmp™ סרט דבק שקוףThermo Fisher Scientific4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kitבקמן קולטרA63881
אתנול(99.5)Nacalai Tesque08948-25
נתרן הידרוקסיד (10M)Sigma72068
DTU-NeoTAITEC0063286-000
E-36TAITEC0027765-000
ECLIPSE Ci-LNikon704354
Pipet-Lite LTS פיפטה L-2XLS+METTLER TOLEDO17014393
Pipet-Lite LTS פיפטה L-10XLS+METTLER TOLEDO17014388
Pipet-Lite LTS פיפטה L-20XLS+METTLER TOLEDO17014392
Pipet-Lite LTS פיפטה L-100XLS+METTLER TOLEDO17014384
פיפטת LTS פיפטה L-200XLS+METTLER TOLEDO17014391
Pipet-Lite LTS פיפט L-1000XLS+METTLER TOLEDO17014382
להחלפה קטנהWAKENMODEL8864מיני צנטריפוגה
חממתWAKENWKN-2290חממת אוויר
SensiCare כפפות לבחינת ניטריל ללא אבקהMEDLINESEM486802
גזה סטריליתמקרר Osaki11138
MediCoolSANYOMPR-312DCN-PJ
להב חיתוךנוצותנוצה מס' 130
להב חיתוך נוצותנוצהמס' 260
נוצה SנוצהFA-10
מערבולת גאונות 3IKA41-0458מערבל מערבולת
PincetteNATSUMEA-5
1.5 מ"ל מיקרו-צינורביוביקRC-0150

מקורות

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3(2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493(2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הפקת DNA מגידולהשוואת DNA מ-FFPEשקופית עם ממברנת PENהערכת איכות DNAריצוף דור הבאPCR דיגיטליPCR כמותי בזמן אמתזיהוי מוטציות סומטיותריצוף אוטומטי
שיטה פשוטה ומהירה להשיג גידול איכותיים הדנ א של דגימות קליני-פתולוגיים באמצעות מגע ההטבעה ציטולוגיה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.