מאמר שיטה

Microprobe נימי אלקטרופורזה ספקטרומטריית עבור מטבולומיקס תא בודד ב- Live צפרדע (צפרדע רפואית זריזה) העוברים

20.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56956

⸱

22 בדצמבר 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, George Washington University, 2Department of Anatomy & Regenerative Biology, George Washington University, 3Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, College Park

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים צעדים המאפשרים דיגום מהיר בתוך באתרו של חלק קטן של תא יחיד עם דיוק גבוהה, הפלישה מינימלי באמצעות נימי מיקרו-דגימה, כדי להקל על אפיון כימי של תמונת מצב של פעילות מטבולית חיים העוברים באמצעות אלקטרופורזה נימי תא בודד לפי הזמנה ספקטרומטר מסה פלטפורמה.

תקציר

כימות של מולקולות קטנות של תאים בודדים מעלה סיכויי החדשה טובה יותר להבנת התהליכים basic העומדים בבסיס התפתחות. אפשר תא בודד לחקירות העוברים ישירות ב בשידור חי, גישות אנליטיות חדשות נדרשים, במיוחד אלה הן רגישות סלקטיבית, כמותיים, חזקים, מדרגי הגדלים תא שונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר הניתוח ב באתרו של חילוף החומרים בתאים בודדים בפיתוח בחופשיות העוברים על הצפרדע שנחטף ייזרק דרום אפריקאי (זריזה צפרדע רפואית), במודל רב עוצמה התא וביולוגיה התפתחותית. גישה זו משתמשת microprobe נימי לרוקן חלק מוגדר מתאי מזוהה יחיד בתוך העובר, עוזב את התאים הסמוכים שלם לניתוח עוקבות. תוכן שנאספו ניתוח מאת microscale אלקטרופורזה נימי ספקטרומטריית electrospray יינון (CE-ESI) ממשק מצמידים בספקטרומטר טנדם ברזולוציה גבוהה. גישה זו היא להרחבה כדי במגוון גדלים תא ותואמת מבנה תלת-ממדי מורכב של העובר המתפתח. לדוגמה, נדגים את microprobe שתא בודד CE-ESI-MS מאפשרת הבהרה של הטרוגניות תא מטבולית זה מתגלה תאים ובתאים מעורר צאצאים במהלך התפתחות העובר. מלבד התא, ביולוגיה התפתחותית, הפרוטוקולים ניתוח מתא בודד המתוארים כאן נתונות אחרים הגדלים תא, סוגי תאים או בבעלי חיים.

מבוא

הבנה מקיפה של התפתחות דורש אפיון של כל השינויים המולקולריים להתגלות בכל תא של האורגניזם המתפתח. בעוד הדור הבא רצף עם הגברה מולקולרית מאפשרת מדידה עמוק של תא בודד transcriptomes1 פיתוח מערכות2,3, הרבה פחות ידוע על הסוויטה של מולקולות קטנות מיוצר ע י תאים עובריים בודדים, כולל חלבונים, במיוחד, מטבוליטים (מסה מולקולרית < Da ~ 1500). עם תגובה מהירה ודינמית לאירועים פנימי, חיצוני, משמש metabolome מתאר רבי עוצמה של המדינה מולקולרית של התא. Metabolome תא בודד, ולכן מעלה את הפוטנציאל כדי לעקוב אחר התפתחות יכולות תא הטרוגניות של העובר מוקדם וכדי לזהות מולקולות חדשות ללימודי פונקציונלי. עם זאת, ללא זמין עבור מולקולות אלה מולקולרית הגברה, זיהוי של metabolome דורשת רגישות יוצאת דופן באמצעות ספקטרומטר מסה (MS), אשר היא הטכנולוגיה של בחירה עבור ניתוח מטבוליט.

תא בודד MS הוא אוסף של טכנולוגיות עם רגישות מספיק למדוד מטבוליטים של תאים בודדים (ראה הדעת 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). לשחזור דגימה של תאים, חילוץ יעיל מטבוליטים חיוניים גילוי מוצלחת של מטבוליטים של תאים בודדים. כל תא דיסקציה של מזוהה תאים מעוברים צפרדע רפואית איפשר האפיון של מולקולות קטנות, פפטידים16. גישות אחרות להעסיק micropipettes לטעום תאים חיים בודדים ואחריו זיהוי באמצעות ספקטרומטריית electrospray יינון (ESI) MS. לדוגמה, מטבוליטים נמדדו צמח או תאים בתרבית של תא בודד וידאו MS17, הלחץ בדיקה18, בדיקה אחת19ועל כוח fluidic מיקרוסקופ20, בין שאר טכניקות21, 22,23,24. בנוסף, התאגדות של הפרדה כימית לפני יינון לתוך תא בודד MS זרימת העבודה ביעילות מפשט את metabolome, וכך להפחית הפרעות אפשריות במהלך יון דור לפני זיהוי. חשוב, ההפרדה מספק גם מידע ספציפי המתחם כדי לסייע בהמשך המולקולרי ופיזיקליים. צינור קפילר אלקטרופורזה (CE) שימש לזהות מטבוליטים ביתור בודד25,microsampled וא26 27הנוירונים, לכידת מולקולה קטנה הבדלים בין תא עצב פנוטיפים. אנחנו לאחרונה המותאמים CE ESI טנדם MS כדי לאפשר זיהוי עקבות ברמת מאות מטבוליטים בתאים בודדים היו גזור מן העוברים מוקדם של צפרדע רפואית זריזה16,28. מחקרים אלה חשפו הבדלים מטבוליים מפתיע בין תאים עובריים בשלב מוקדם של התפתחות והוביל לגילוי של מטבוליטים בעבר לא ידוע השפעות התפתחותיות16.

כאן אנו מספקים פרוטוקול איפשרה הגילוי של מטבוליטים של תאים בודדים ישירות ב- העובר חוליות בשידור חי באמצעות microprobe תא בודד CE-ESI-MS29,30. האורגניזם דגם שבחרת הוא 8-ל-32-התא עובר X. laevis , למרות הגישה חל גם בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות וסוגים אחרים של אורגניזמים מודל. פרוטוקול זה משתמש נימים מחודדים עם שליטה translational ורב ציר תחת הדרכתו על-ידי מערכת הדמיה ברזולוציה גבוהה מחוק לגמרי ~ 10 nL חלק מזוהה תאים ב באתרו של העובר המתפתח מורפולוגית מורכבים. Microprobe זו היא מדרגית לתאים קטנים יותר ופועל תוך שניות, וזה מספיק מהר כדי לעקוב אחר שושלות תאים של העובר. לאחר חילוץ קוטבי או מולקולות קטנות apolar, כגון מטבוליטים, פפטידים, מדגם שנאספו ב ~ 4-5 µL חילוץ הפתרון, 10 ~ nL של התמצית המתקבלת ניתוח ב פלטפורמה CE לפי הזמנה במקף כדי ספקטרומטר מסה ESI. הקמה ותפעול של פלטפורמת CE-ESI-MS בונה על פרוטוקולים אחרים. 31 , 32 הממשק CE-ESI co-צירית נבנה כמתואר. 31 פלטפורמה זו נשמרת המשטר הריסוס קונוס-jet להשיג מעקב ברמת רגישות עם יכולת על כימות מעל 4-5 יומן-הזמנה טווח דינמי (יחסית28,29,30 או מוחלטת16). פלטפורמת CE-ESI-MS מציע מגבלה נמוכה יותר 60-ניסים מונטקיו של זיהוי עם סטיית תקן יחסית (RSD) 8% בכימות על מגוון שנבדקו 10 nM 1 מיקרומטר עבור מולקולות קטנות16, אשר מספיקים לאפיין אנדוגני מטבוליטים ב X. זריזה תאים. Microprobed התאים ממשיכים לחלק ככל מתקדם העובר דרך פיתוח30, מתן אפשרות לניתוח נפתרה חנותם והמרגשים של חילוף החומרים הסלולר. אכן, תא בודד CE-ESI-MS יכול לשמש כדי למצוא הבדלים מטבוליים בין התאים לכבוש את הגבי הגחוני /16,29, בעלי חיים-צמחי16, צירים התפתחותית משמאל28 וכן תאים זה טופס השושלת נגזר רקמה עצבית הגבי מתא קדמון משותף X. laevis30. מלבד הפעלת שאילתות מטבולית ההבדלים בין תאים עובריים בודדים בשלבים התפתחותיים שונים של העובר X. laevis 30, אנו צופים כי הפרוטוקולים המתוארים כאן הם חלים על מגוון רחב של מולקולות, microsampled תאים בודדים של שלבים שונים של התפתחות, כמו גם סוגים אחרים של תאים ואורגניזמים מודל. בנוסף, microprobe יכול לשמש microsampling בזמן פלטפורמה שונה תואם עם דגימות זעיר יכול לשמש עבור הפרדה ו/או אפיון של מולקולות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים הקשורים התחזוקה, טיפול של צפרדע רפואית זריזה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה באוניברסיטה. ג'ורג ' וושינגטון (IACUC אין. A311).

1. הכנת דגימה מכשירים, מדיה, ממיסים, המנות

  1. להכין 1 x הפתרון של שטיינברג (הה) על ידי המסת המלחים הבאים במים הנדסה גנטית (~18.2 MΩ.cm ב- 25 ° C) לפי הסדר הבא, בריכוזים המצוין בעקבות תקן פרוטוקול33: נתרן כלורי (58.2 מ מ), אשלגן כלורי ( 0.67 מ מ), סידן חנקתי (0.34 ממ), מגנזיום גופרתי (0.83 מ מ), טריס-הידרוכלוריד (4.19 מ מ), טריס בסיס (0.66 מ מ). 0.5 x SS מאת כפולה, ואם הוא 0.1 x SS על ידי דילול ten-fold, 1 x SS באמצעות הנדסה גנטית מים.
  2. להכין מאכלים הדגימה על ידי הראשון-מכינה 2% agarose 1 x השליחים הקדושים אוטוקלב ב 120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להמיס. אמנם עדיין נוזלי, מעיל התחתון של 60 מ מ צלחות פטרי עם הפתרון. ברגע הג'ל agarose מקורר, פני השטח למוצק, להבה סוף פיפטה פסטר שישה אינץ ' עד שהיא יוצרת כדור, נוגעים בעדינות הסוף מחוממת להטביע בה 5-10 וולס, ~ 1 מ מ עמוק, אל תוך agarose.
    הערה: הבארות הללו משמשים כדי לשתק את העוברים במהלך הדגימה.
  3. להכין מטבוליט החילוץ הממס. להתאים את המאפיינים physicochemical של הממס (למשל, קוטביות ו pH) בשיעורי של מולקולות המעניינים במחקר.
    הערה: לדוגמה, אנו משתמשים מתנול 40% ו- 40% acetonitrile במים LC-MS-ציונים כמו בגישה גילוי כדי להתמקד בעיקר קוטבי מטבוליטים, ו כמה apolar מטבוליטים של פפטידים28.
  4. להפוך שיער לולאות באמצעות השיער הנקי של פיפטה פסטר כמתואר33 להעברת העוברים בעדינות, צלחות פטרי עם ההפרעות מינימלי.
  5. לפברק צמצום-טיפ micropipettes כפי שמוצג באיור 1a.
    1. ראשית, להכניס בורוסיליקט נימים (1000/500 מיקרומטר קוטר חיצוני/פנימי) פולר נימי בוער-בראון-type עם ההגדרות הבאות: חום = 355; משיכה = 65, מהירות = 80; זמן = 150.
    2. בשלב הבא, מעבר-מקצה micropipette משך באמצעות זוג מלקחיים חדה בסדר כדי להשיג טיפ נימי הקוטר החיצוני של ~ 20 מיקרומטר. לבצע שלב זה תחת stereomicroscope כדי לסייע דיוק ואת הפארמצבטית.
      הערה: נימים עם טיפ קטן נוטים סתימת במהלך השאיפה של הציטופלסמה צמיגה. בעוד נימים עם טיפ גדול בהחלט לעזור למנוע סתימת ואת האחות יותר של תוכן סלולרי, גדול נשא נימים עשויים להוות אתגרים במהלך הדגימה של תאים קטנים יותר, יכול לגרום נזק התא עבור הדגימה הבאים. זהירות על ההתאמה של הלחץ והזמן של השאיפה עשויה חלקית להקל על האתגרים הללו. אנו מוצאים micropipettes עם ~ 20 מיקרומטר הקוטר החיצוני אידיאלי עבור העבודה המוצגת כאן.

2. Microsampling חד תאים, מטבוליט חילוץ

  1. להשיג את העוברים (הביצים) דרך גונדוטרופין-induced לטבעי להזדווגות של מבוגרים זריזה צפרדע רפואית או דרך במבחנה הפריה כפי שמתואר פרוטוקולים במקום33,34.
    הערה: לטבעי להזדווגות מבטיחה כי העובריים התפתחותית הם התנודדה בזמן עוברי מתקבל על ידי הפריה במבחנה אמינים יותר באספקת. עם זאת, הפריה במבחנה מחייבת להקריב את הצפרדע זכרים בוגרים.
  2. טרי להכין 2% ציסטאין dejellying פתרון על ידי המסת 4 g של ציסטאין לתוך 200 מיליליטר מים הנדסה גנטית, dropwise להתאים את פתרון ה-pH 8 באמצעות תמיסת נתרן הידרוקסידי N 10.
  3. הסר את המעילים ג'לי המקיפים את העוברים כשהם מתחילים לדבוק לשלב 2-תא כדלקמן: תן עוברי לנוח על הפתרון dejellying למשך 2 דקות, ואז בעדינות מערבולת אותם למשך 2 דקות נוספות למנוע עוברי הקפדה על פני השטח של האוסף תבשיל.
  4. בעדינות שופכים תוכן המנה לתוך גביע נקי, במהירות decant הפתרון dejellying מ הספל. מיד לכסות את הביצים עם 0.1 x SS כדי לשטוף הנותרים dejellying פתרון, בעדינות מערבולת ולאחר מכן decant את הפתרון. חזור על שלב זה ארבע פעמים לשטוף ביסודיות את העוברים.
    הערה: להגביל את החשיפה של העוברים פתרון dejellying 4 דקות כדי להבטיח יכולת הקיום. פרוטוקולים מקיפה כדי להסיר את המעילים ג'לי זמינים במקום33.
  5. העברת העוברים dejellied 1 x SS בצלחת פטרי. כדי למזער את הצפיפות בתוך הלוחות, במקום ~ 100 עוברי לכל מנה 100 מ מ33.
    הערה: ניתן לאחסן הכלים המכיל העוברים בין 14-18 ° C כדי להאט את התפתחות ולקבל עוברי-מעד שלבים התפתחותיים אותם ההורים. הנחיות נוספות על התלות בטמפרטורה של צמיחה והתפתחות מתפרסמים על Xenbase ובמקומות33,35,36,37.
  6. מיון ביקוע העוברים בשלב 2 תאים לתוך תבשיל נפרדים באילו פיגמנטציה סטריאוטיפי בביטחון מסמן את הציר הגבי הגחוני /, התייחסות תא הוקמה גורל מפות38,39,40.
    1. לזהות כראוי שהפריד העוברים על-ידי הבטחת שחוצה פארו המחשוף הראשון, אשר demarks את המטוס midsagittal, האפלה (הגחון) בקלילות (הגבי) פיגמנט מוט חיה כך שני החצאים הם תמונות מראה41.
  7. הר של micropipette מפוברק על micromanipulator ורב ציר (ידני או מבוקר מרחוק). לחבר את micropipette microinjector.
  8. השתמש פיפטה העברה פלסטיק תשאף ~ 5 של העוברים שמונה תאים ולהעביר אותם לתוך המנה דגימה המכילה 0.5 x SS.
באמצעות לולאה שיער, מקם את העובר ניתן לטעום לבאר הפרט, ולוודא כי התא כראוי המזוהים של עניין הוא בפני את microprobe בזווית של ° ~ 90.
הערה: לזהות את התאים המבוסס על פיגמנטציה, מיקום העובר, התייחסות תא גורל מפות38,39,40.
  • תוך כדי עבודה תחת stereomicroscope (בהגדלה X 20-30), מדריך את קצה micropipette לתוך התא הבודד שזוהו בתוך העובר לחיות כפי שמוצג באיור 1 (ראה דגימה נקודות על תאים בחלונית B ואת המנגנון בחלונית C).
  • למשוך חלק תוכנו של התא הרצוי על-ידי החלת לחץ שלילי פולסים microcapillary באמצעות את microinjector ('מצב מילוי').
    הערה: לדוגמה, אנחנו באופן שגרתי תשאף ~ 10-15 nL נפח מהתא על-ידי החלת ~ 3 פולסים של-30 psi נימי. זה כל שלב נמשך ~ 5 s השאיפה30.
  • בעדינות. משכי את microprobe מהתא, להעביר את קצהו לתוך µL 4 של המטבוליט החילוץ הממס מקורר (4 ° C) בבקבוקון בגודל micro. לאחר מכן, החל נחשול הלחץ של psi +80 1 s נימי באמצעות את microinjector ('מצב ברור') כדי לגרש את וביופסיה לתוך הממס.
    1. סגור בחוזקה את הצנצנת כדי למנוע אידוי ומניחים את המבחנה בחזרה לתוך דלי קרח 4 ° C עד דגימה תושלם. למחוק את micropipette בשימוש לתוך מיכל שרפ כדי למנוע סיכון needlestick.
      הערה: כדי לקבוע את עוצמת הקול של תוכן התא aspirated, להזריק את וביופסיה לתוך שמן מינרלי, שבו הוא מקבל צורה כדורית. ניתן למדוד את קוטר בנחישות באמצעות מיקרוסקופ. לחשב את עוצמת הקול aspirated: V = 4/3 π r3, כאשר V הוא אמצעי האחסון ו- r הוא הרדיוס של הספרה.
  • כדי לבצע דגימה שוב באותו התא או תאים אחרים של העובר, חזור על שלבים 2.7-2.11 (איור 1 c). כדי להימנע נושאים פוטנציאליים מעל בין samplings רצופים, השתמש micropipette טריים לניתוח של כל תא אחר.
  • עם סיום דגימה, מערבולת-מיקס הבקבוקונים microcentrifuge לדוגמה, המכיל ~ 1 דקות לזרז את החילוץ של מטבוליטים ולאחר מכן צנטריפוגה ב × 8000 g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה פסולת סלולרית וחלקיקים אחרים.
  • אחסן את תמציות תא יחד עם שאריות תאים וחומרים זירז ב-20 ° C ליום או ב- 80 ° C עד 1 חודש עד המדידה על-ידי CE-ESI-MS.

    • 3. CE-ESI-MS מדידה

    1. הכנה של סטנדרטים ופתרונות CE-ESI-MS
      1. להכין האלקטרוליט רקע (BGE) בהיקף של 1% חומצה פורמית במים כיתה LC-MS.
      2. להכין את הפתרון נדן להכיל 50% מתנול ב LC-MS כיתה מים ו- 0.1% חומצה פורמית.
      3. היכונו 50 ננומטר אצטילכולין פתרון בפתרון נדן יומי הערכת הביצועים של המערכת CE-ESI-MS.
      4. להכין פתרון נתרן כלוריד 150 מ מ כיול מסה סטנדרטי עבור הטווח נמוך מ/z במצב יון חיובי. הדיוק מסה (מ/z) של < מומלץ 10 עמודים לדקה. ההוראות של הספק ספקטרומטר מסה לבצע שלב זה.
        הערה: לחלופין, תקנים נוספים עם ערכים ידועים מ/z ניתן לכייל מסה ספקטרומטר מסה.
    2. בנייה של פלטפורמת CE-ESI
      1. לבנות פלטפורמה הזרקת CE מסוגל תרגום אנכי מהיר של שלב מחזיק את המבחנה BGE ולדגום את טעינת microvial. עבור הקמה ותפעול של הפלטפורמה, מתייחסים לפרטים ב הפניה31.
      2. להרכיב את הממשק CE-ESI (איור 1 c) כדלקמן. בעיא ספקטרומטריית electrospray מתכת פולט (130/260 µm פנימי/חיצוני בקוטר ו ~ 35 מ מ אורך) T-איחוד 3 יציאות. להאכיל את נימי ההפרדה לסה נ (40/105 µm פנימי/חיצוני בקוטר ו ~ 100 ס מ אורך) דרך פולט ספקטרומטריית electrospray השירי לבלוט ~ 40-100 מיקרומטר מעבר לקצה פולט. עבודה תחת stereomicroscope כדי לסייע לדיוק.
        1. חבר את נימי פתרון נדן (75/360 µm פנימי/חיצוני בקוטר ו ~ 100 ס מ אורך) ליציאת הנותרים כדי לספק את הפתרון ספקטרומטריית electrospray. השתמש שרוולים המתאים והדק אצבע-חיבורים לפעולה ללא דליפה של הממשק CE-ESI. עיין הקודם31,פרוטוקולים32 לפרטים על מכלול, וגישה לפתרון בעיות של ממשק זה.
          הערה: מידות נימי משפיע על יחס אות לרעש (S/N) וכן את משך הזמן של הפרדה. לדוגמה, נימים נשא צר וקצר להקל הפרדות מהיר באמצעות הפרדה גבוהה יותר מתחים42,43. בנוסף, בהתאם לסוג מולקולות המעניינים במחקר, ייתכן מצופה ההפרדה נימים למזער/למנוע קיר מולקולה-נים לא רצויים אינטראקציות44.
      3. משתמש בעל לוחית, הר הממשק CE-ESI אל שלב התרגום שלושה צירים ומקם את הטיפ פולט ספקטרומטריית electrospray ~ 2 מ מ כגדולים ספקטרומטר מסה (איור 1 c).
      4. מרכיבי הממשק נקי, לשטוף הרציונאלית, הפתרון נדן ספקטרומטריית electrospray דרך פולט ספקטרומטריית electrospray ב µL 1/דקה את BGE דרך נימי ההפרדה לסה נ. השתמש משאבות מזרק להאכיל את ממיסים בקצב קבוע.
      5. לרוקן את נימי ההפרדה לסה נ לפני כל מדידה על-ידי חיבור מזרק סופו הנימים מפרץ צר. השתמש מזרקים גדול מספיק כדי למזער את מילוי ואת הטרמה של קווי האספקה הממס.
        הערה: ניסויים בדרך כלל להשתמש 1 מ"ל גז חזק מזרקים לספק הממס נדן ספקטרומטריית electrospray ומזרק 500 µL לרוקן את נימי ההפרדה.
    3. אימות של CE-ESI-MS פלטפורמה ומדידה של מטבוליטים
      הערה: המטרה של שלב זה היא כדי לאשר את הרגישות אנליטית של המכשיר CE-ESI-MS מדי יום לפני ניתוח תמציות תא בודד.
    באמצעות פלטפורמת ה-CE-ESI המתוארת כאן, נוכל להשיג מגבלה נמוכה יותר של זיהוי-60 (קרית אתא) באמצעות ספקטרומטר מסה של זמן-של-טיסה אורתוגונלית תאוצה פאול16.
    1. לאחר שטיפה ההפרדה נימי עבור ~ 5 דקות, להעביר את כניסת שלה לתוך הפתרון BGE ממוקם בקבוקון מפלדת.
    2. מקם את הטיפ פולט ספקטרומטריית electrospray ~ 2 מ מ כגדולים ספקטרומטר מסה ו פיין-להתאים את המרחק באמצעות שלב התרגום לייצר ספקטרומטריית electrospray המשטר קונוס-סילון יציב בעודו מנטר את הספריי באמצעות stereomicroscope (ראו הפניות 31,45). תנטר את היציבות הכולל יונים הנוכחי (טיק) ~ 30-45 דקות כדי להבטיח פעולה יציבה.
    3. החלת ~ 20 kV למבחנה BGE באמצעות הגדלת בהדרגה הפוטנציאל מעל 15 ~ s, בדרך כלל יוצר ~7.5 µA הנוכחי על פני נים ההפרדה באמצעות חומצה פורמית 1% כמו BGE. לפני כל מדידה, להבטיח את יציבות המערכת על-ידי ניטור לפרופיל טיק ~ 5-10 דקות ולאחר מכן step-wise להוריד את הפוטנציאל ההפרדה (CE) ל- 0 V (הקרקע).
      הערה: להפיכת חצי תהליך זה, אנו משתמשים תוכנה מותאמת אישית-נכתב כדי לשלוט מרחוק אספקת31חשמל מתח גבוה לסה נ. אם הפלטפורמה CE-ESI-MS לא יציב, בזהירות להעריך את המקור של אי יציבות על ידי בדיקות פלטפורמת CE-ESI-MS הראשונה במצב ESI בלבד, במצב תפעולי CE-ESI כמו מומלץ אז במקום31. בקצרה, כדי לבדוק את הפלטפורמה במצב ESI בלבד, כבה את מתח גבוה לסה נ ונטר את הטיק ~ 30 דקות המשטר הריסוס קונוס-סילון. במידת הצורך, כדלקמן להמשיך עם שגיאות כתובת: (i) בדוק חיבורי דליפות; (ii) לנקות את פולט ספקטרומטריית electrospray עם מים, אלכוהול איזופרופיל, מים, מתנול; (iii) דה-גז ממיסים; (iv) לרוקן פולט ~ 25 דקות לפני בדיקה שוב. אם הפלטפורמה CE-ESI נמצא יציב במצב ESI בלבד, אך הופך לבלתי יציב במהלך ההפרדה לסה נ, לבחון את המערכת ג'אול חימום ו/או אלקטרוליזה: (i) לשטוף את נימי ההפרדה עם BGE ~ 25 דקות וחזור על הניסוי; (ii) להשתמש את פוטנציאל ההפרדה נמוכה כדי לשמור על תגובה Ohmic ליניארית (קרי, הנוכחי לעומת ההפרדה מתח עקומה ליניארית לסה נ); (iii) לבחון את נימי לסה נ בגין נזקים פוטנציאליים, כגון סדקים, ולהחליף את נימי במידת הצורך.
    4. לנתח ~ 6 nL המדגם כדלקמן:
      1. פיפטה µL 1 של הפתרון הסטנדרטי אצטילכולין לתוך המבחנה הזרקה.
      2. להעביר את נימי ההפרדה מ המבחנה BGE לתוך המבחנה הזרקה.
      3. הרם את הבמה הזרקת לסה נ 15 ס מ ב- 1s.
      4. להחזיק את הבמה עם הרשאות מלאות עבור 60 s hydrodynamically להזריק ~ 6 nL המדגם לתוך נימי ההפרדה.
      5. לאחר מכן, לתרגם את השלב לחזור החל רמות (בקו אחד עם השקע נימי).
      6. בעדינות להעביר סופו הנימים כניסת BGE.
      7. מיד לאחר מכן, הגדלת המתח CE להתחיל ההפרדה electrophoretic.
      8. התחל MS קירור והקפאה.
        הערה: ביצועי המערכת עשוי להיות מאופיין באמצעות הליך כימי. מספק CE-ESI-MS החד-תאיים להוריד את הגבולות של זיהוי ~ 10 ננומטר (ניסים מונטקיו ~ 60) עבור אצטילכולין, מתיונין, היסטידין16. אמצעי האחסון מוזרק (Vהפצוע למרכז הר), לתוך נימי ב nL, תלוי ההבדל הגובה (H, ס מ) במהלך זריקה, צפיפות (ρ, g ס מ-3), צמיגות (η, s ז-1ק ג-1) של BGE, אורך (L, m), רדיוס (r, מיקרומטר) לסה נ נימי, ומשך ההזרקה (tהפצוע למרכז הר, s). קשר זה מבוטא על ידי הנוסחה הבאה, איפה תאוצת הכובד g (m s-2):
        figure-protocol-1
    5. ברגע התקן זוהה, תעצור קירור והקפאה, להפחית מתח ההפרדה stepwise ל- 0 V (הקרקע) ולאחר מכן לאחזר פולט אל 2 ס מ כגדולים. מיושרות לחלץ ההפרדה נימי עבור 5 דקות לפני ניתוח התא.
    6. מידה 10 nL יחיד-התא לחלץ באמצעות חזרה צעדים 3.3.1-3.3.5 באמצעות 90 s hydrodynamically להחדיר את הדגימה.
  • עיבוד נתונים
    הערה: המטרה של עיבוד נתונים היא כדי לזהות ולכמת תרכובות בין תאים בודדים. פרוטוקול CE-ESI-MS תא בודד יוצר פסגות electropherographic צר עם רוחב בסיס טיפוסי של כמה שניות. על ידי ביצוע ניתוח נתונים באופן ידני למחצה, זה אפשרי למצוא תכונות מולקולרית (ערכים ייחודיים מ/z עם ההעברה ייחודיים פעמים) באמצעות השלבים הבאים. ההפרדה נציג מוצג עבור בחירה מטבוליטים המזוהים באיור2 א.
    1. כיול מסה קבצי נתונים גולמיים פוסט קירור והקפאה.
      הערה: אנו משתמשים אותות נתרן formate אשכולות שנוצרו במהלך ההפרדה של נתרן בשפע מן המדגם, אשר קיים בתאים באופן מקורי או שחולצו מן התקשורת תרבות העובר. המטרה של שלב זה היא כדי לשפר זיהוי מטבוליט בשלבים מאוחר יותר על-ידי הקפדה על דיוק גבוהה בנפח גדול (מ/z), רצוי < מד א 5, או < 10 עמודים לדקה, בין מ/z 50-1, 000. כאן, פוסט נתוני הרכישה כיול מאפשר להשיג באופן שגרתי המוני accuracies < מד א 1, או < 2 ppm עבור מ/z 50-500.
    2. שימוש בקובץ script, עיבוד, חיפוש עבור תכונות מולקולרית על-פני הטווח ההמוני שזוהו. ממוצע ספקטרה המונית על פני כל הפסגה, כדי לקבוע את המסה מדויק, ושים לב למטה זמני ההעברה המתאימים שלהם. לצורך זיהוי נמוך-המונית מטבוליטים בטווח מ/z 50-500, להשתמש חלון שלב מד א 500 כדי לפקח תכונות מולקולרית עם S/N > 3.
    3. לשלב את שיא באזור-תחת--עקומת עבור כל תכונה מולקולרית באופן ידני או אוטומטי. הערכים האזור וכתוצאה מכך משמשים כאמצעי של המטבוליט שפע.
    4. לזהות תכונות מולקולרית של עניין עם ביטחון עצמי גבוה כדלקמן (ראה איור
    • 2b).
    1. ראשית, להשוות בין המסה מדויק של התכונות מולקולרית נגד מטבוליט מסד נתונים (למשל, Metlin46 ולא HMDB47) עם דיוק 10 עמודים לדקה כדי לקבל רשימה של התאמות המוני בשם.
    2. הבא, להעריך הלוחיות מסה על ידי השוואת ספקטרום המונית שלהם טנדם המתקבל התא תמציות עם נתונים זמינים מטבוליט מסדי הנתונים או הקשת המוני טנדם יימדדו סטנדרט כימי המתאים.
    3. בפעם האחרונה, אמת הקצאות אלה על-ידי השוואת את זמן ההעברה של תכונות מולקולרית טלקוה תמציות תא עם סטנדרטים כימיים קשורים נותחו על ידי אותו כלי CE-ESI-MS.
      הערה: כדי לשפר תפוקה ניסיוני, אנו בדרך כלל לזהות רק תכונות מולקולריים שונים באופן משמעותי סטטיסטית בין תנאים ניסויית או סוגי תאים. נציג ההזדהויות מוצגים באיור2. כדי לזהות מטבוליטים עם דיוק מסה גבוהה, אנו ממליצים מבחוץ כיול של ספקטרומטר מסה מדי יום, ביצוע למשובטים בזמן אמת במהלך כל מדידה באמצעות תקן פנימי או חיצוני בנפח גדול-כיול כל אחת מהמידות קובץ נתונים שלאחר הרכישה (למשל, עבור נתרן formate אשכולות כאן) מומלצים.
  • כדי להשוות בין מולקולה קטנה ייצור בין תאים בודדים, להשתמש שיא באזור-תחת--עקומת electropherograms יון שנבחר (מתוך שלב 3.4.3) כמידות היחסי של מתחם שפע.
    הערה: בניסויים שלנו, פלטפורמות תוכנה באינטרנט47 שימשו כדי לבצע את כל השלבים של ניתוח נתונים עוקבות, כולל את השלבים הבאים: אני) סינון של תכונות מולקולרית עם מופע לפחות 50% של כל דגימה-ערכה (למשל, תא סוג); ii) נורמליזציה של הנתונים; iii) סטטיסטי (לדוגמה, t-מבחן), ניתוח נתונים רב משתנית, כגון ניתוח גורמים ראשיים (PCA) וניתוח אשכול היררכי (HCA). אנו משתמשים p < 0.05 (הסטודנט t-מבחן) לסמן מובהקות סטטיסטית, קיפול-שינוי ≥ 1.5 לציין משמעות ביולוגית.
  • כדי לקבוע ריכוז מוחלט של מולקולה קטנה בתא בודד, ליישם שיטות קלאסיות של כיול (למשל, כיול חיצוני או הוספה סטנדרטית) באמצעות שיא באזור-תחת--עיקול של המתחם של ריבית16.

    • הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    אנחנו לאחרונה המועסקים תא בודד microprobe CE-ESI-MS כדי לאפיין מטבוליטים בתאים מזוהה בודדים בפיתוח בחופשיות צפרדע רפואית זריזה עוברי29,30. Microprobe מאפשר מהר (שניה ~ 5/נייד), השאיפה בחיי עיר של ~ 10 nL של תא בודד, השאיפות מרובים באותו התא, או מספר תאים שונים בתוך אותו ואילך שלבי התפתחות העובר חי (איור 1b). תוכן סלולרי aspirated מופק באמצעות ממיס מתאים ואת מטבוליטים ואז מופרדים, מיו...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    Microprobe CE-ESI-MS מאפשרת אפיון ישיר מטבוליטים של תאים בודדים בפיתוח חי, בחופשיות עוברי. בלב ליבה של הגישה הם שני רכיבי משנה טכני, כלומר בחיי עיר נימי microsampling ו רגישות גבוהה CE-ESI-גב' לעומת תאים כל ניתוח, נימי microsampling יש את היתרון של פעולה מהירה (כמה שניות לעומת 5 דקות / תא על-ידי ניתוח), תאימות עם המורפולוגיה תלת מימדי מורכב של עוברי ומדרגיות לתאים קטנים בצורת בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות. בניגוד לנתיחה, הדגימה microprobe עלים אחרים בתאי העובר שלם לניתוח עוקבות. מסקרן, microsampled תאים באפשרות...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    המחברים אין לחשוף.

    תודות

    עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים GM114854 (כדי P.N.) ו CA211635 (כדי P.N.), ארנולד, מייבל בקמן קרן בקמן יאנג החוקר להעניק (P.N.), בפרס פרופסור צעיר דופונט (כדי P.N.), האגודה האמריקנית למיסה ספקטרומטר מחקר פרס (P.N.), מלגות קרן המועדון קוסמוס (כדי R.M.O. ו- E.P.P.). הדעות והמסקנות לידי ביטוי בפרסום זה הן אך ורק לאלה של המחברים, אינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של מקורות מימון.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    <חזק>ריאגנטים למצע תרבית עוברים
    אשלטון כלורידפישר סיינטיפיקBP 366-1
    מגנזיום גופרתיפישר סיינטיפיקM 65-3
    סידן חנקתיסיגמא אולדריץ'C1396
    ציסטאיןMP ביומדיקל101444
    טריזמה הידרוכלורידסיגמא אולדריץ'T3253
    בסיס טריזמהסיגמא אולדריץ'T1503
    נתרן כלוריפישר סיינטיפיק5641-212
    <חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>תגובות
    ><חזק>מטבוליט ממיסי מיצוי
    אצטוניטריל (דרגת LC-MS)פישר סיינטיפיקA955
    מתנול (דרגת LC-MS)פישר סיינטיפיקA456
    מים (דרגת LC-MS)פישר סיינטיפיקW6
    <חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
    <חזק>ממיסים ותקנים עבור CE-ESI-MS חזקה>
    פורמית (דרגת LC-MS)פישר סיינטיפיקA11710X1-AMP
    מתנול (דרגת LC-MS)פישר סיינטיפיקA456-4
    מים (דרגת LC-MS)פישר סיינטיפיקW6
    נתרן כלוריפישר סיינטיפיק5641-212
    אצטילכולין כלורידאקרוס אורגני159170050
    <חזק>שם><חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
    <חזק>הגדרת ייצור מיקרו-בדיקה
    חולץ מיקרופיפטSutter Instrument Co.P-1000
    נימי בורוסיליקטSutter Instrument Co.B100-50-10
    מלקחיים חדים עדינים: Dumont #5, Biologie/DumoxelFine Science Tools (ארה"ב) Inc11252-30עמיד בפני קורוזיה וניתן לחיטוי.
    שםחברהמספר קטלוגי>הערות
    Microprobe הגדרת דגימה
    מיקרומניפולטורEppendorf, Hauppauge, NYTransferMan 4r
    סטריאומיקרוסקופNikonSMZ18צריך להיות מבודד רטט.
    תאורה למשל צווארי אווזNikonC-FLED2
    מיקרו-מזרקוורנר מכשיר, Handem, CTPLI-100A
    פיפטות העברה (פלסטיק, חד פעמי)פישר סיינטיפיק13-711-7M
    צלחת פטרי 60 מ"מ ו-80 מ"מפישר סיינטיפיקS08184
    פיפטות פסטר מזכוכית (בורוסיליקט, חד פעמי)פישר סיינטיפיק13-678-20A
    צנטריפוגהתרמו מדעיSorvall Legend X1R
    <חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי><חזק>הערות
    <חזק>CE-ESI-MS הגדרה
    ספק כוח מתח גבוהספלמןCZE1000Rניתן לשלוט ב-HVPS מרחוק באמצעות תוכנית מתח נמוך שנוצרה על ידי מחשב אישי. זהירות: כרך גבוהtage מהווה סכנת התחשמלות; כל חלקי החיבור חייבים להיות מוארקים או מסוככים בזהירות כדי למנוע חשיפה מקרית של המשתמשים.
    משאבות מזרק (2)מכשיר הרווארד704506
    סטריאומיקרוסקופאמסקופSM-3BZZסטריאומיקרוסקופ המסוגל להגדלה פי 4.5, מצויד בתאורה לניטור מצב הריסוס של ממשק CE-ESI.
    שלב תרגום XYZThorlabsPT3
    XYZבנויפלטפורמה זו מסוגלת לטעון כמויות ננו-ליטר של דגימה לתוך נימי ההפרדה באמצעות הזרקה הידרודינמית ואספקת ה-BGE ל-CE. שני הממשקים המתוארים בעבודה זו הצליחו להזריק 6– 10 nL של מדגם תוך דקה אחת לתוך נימי הפרדה של 1 מ'
    בקבוקוני דגימה מנירוסטהנירוסטה שנבנה
    בהתאמה
    (40 ומיקרו; m/105 ומיקרו; m ID/OD; 100 ס"מ)טכנולוגיות פולימיקרוTSP040105
    נימי סיליקה התמזגו (75 ומיקרו; m/360 ומיקרו; m ID/OD; 100 ס"מ)טכנולוגיות פולימיקרוTSP075375
    פולט נירוסטה עם קצוות קהים (130/260 ומיקרו; m ID/OD)המילטון ושות'.21031Aלביצועים טובים יותר, יש לבקע בלייזר וללטש עדין את קצה הפולט.
    מזרקים (אטומים לגז): 500 - 1000 ומיקרו; Lהמילטון ושות'1750TTL
    מולטימטר דיגיטליFlukeFluke 117
    ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוההBruker DaltonicsMaxis Impact HDספקטרומטר מסה טנדם ברזולוציה גבוהה מצויד בממשק לחץ אטמוספרי המוגדר לתערובת
    כוונון ESI לכיול ספקטרומטר מסהטכנולוגיות זריזותESI-L G1969-85000
    ניתוח נתונים גרסה 4.3 תוכנהBruker Daltonics
    NameCompanyCatalog NumberComments
    ציוד נלווה
    רכז ואקום מסוגל לפעול ב-4– 10° CLabconco7310022
    מיקרו-איזון אנליטי (XSE105DU)מקפיא Fisher Scientific01911005
    (-20 ° ג)מקפיא פישר סיינטיפיק97-926-1
    (-80 & deg; ג)פישר סיינטיפיק88300ASP
    חממה מקוררתפישר סיינטיפיק11475126
    מערבולת BenchmarkBS-VM-1000
    שלב התרגום בהתאמה אישית בקבוקון BGE בהתאמה אישית נימי סיליקה התמזגו אישית

    מקורות

    1. Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
    2. Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
    3. Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
    4. Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics'. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
    5. Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
    6. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
    7. Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
    8. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
    9. Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
    10. Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259(2013).
    11. Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003(2012).
    12. Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
    13. Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012(2017).
    14. Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
    15. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
    16. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
    17. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
    18. Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
    19. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
    20. Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
    21. Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
    22. Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
    23. Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
    24. Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
    25. Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
    26. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
    27. Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
    28. Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
    29. Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
    30. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
    31. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
    32. Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. , 119-139 (2013).
    33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
    34. Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
    35. Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
    36. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
    37. James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
    38. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
    39. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
    40. Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
    41. Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
    42. Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
    43. Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
    44. Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
    45. Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
    46. Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
    47. Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
    48. Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
    49. Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Pub. Co. (1967).
    50. Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
    51. Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    In Situ

    מאמרים קשורים