מאמר שיטה

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

16.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56960

⸱

18 בדצמבר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Infectious Disease, University of Michigan

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מחסום האפיתל חדירות בטיפול תרופתי בזמן אמת הבאים בהאדם organoids מעיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות התא מיקרוסקופ.

תקציר

ההתקדמות בתרבות תלת-ממד של רקמות מעיים מושגת באמצעות ביופסיה או שנוצר מתאי גזע pluripotent באמצעות בידול מכוונת, גרמו מודלים מתוחכמים במבחנה של רירית המעי. מינוף מערכות אלה-דגם המתעוררים ידרוש עיבוד של כלים וטכניקות שפותחו עבור מערכות התרבות 2D של בעלי חיים. כאן, אנו מתארים שיטה למדידת מחסום האפיתל חדירות ב organoids מעיים אנושיים בזמן אמת. זו מושגת על-ידי microinjection של fluorescently-ידי לתוספי, הדמיה-מיקרוסקופ הפוכה מצויד מסננים פלורסנטי. מדידת בזמן אמת החדירות מכשול ב organoids מעיים מקלה על הדור של נתונים זמני ברזולוציה גבוהה ברקמת האפיתל במעי האדם, למרות טכניקה זו ניתן גם ליישם קבוע timepoint הדמיה גישות. פרוטוקול זה ניתנת להתאמה בקלות לשקילת חדירות מחסום האפיתל בעקבות חשיפה סוכנים תרופתי, מוצרים חיידקי או רעלנים או אורגניזמים חיים. עם שינויים מזעריים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם פריימר כללי על microinjection של organoids מעיים, משתמשים עשויים לבחור תוספת פרוטוקול זה עם יישומי הזרם נוספים או חלופיים בעקבות microinjection.

מבוא

האפיתל במעי יוצרת מחסום סלקטיבי המעביר התעבורה כיוונית של חומרים מזינים,2O H, יונים, ו הפסולת תוך מזעור ספציפי exchange בתיווך דיפוזיה של חלקיקים אחרים בין לומן ו mesenchymal רקמות או דם אספקה1,2. החדירות לא ספציפית של המכשול אפיתל המעי מזמן נחשב פרמטר פונקציונלי מפתח מחלה ובריאות3,4,5,6, המשקפת שיעור פעפוע של מולקולות קטנות על פני האפיתל דרך החלל paracellular. מדידה של חדירות מחסום האפיתל יכול להתבצע בחיה מודלים7 , בני אדם חולים8 באמצעות הבליעה של לקטולוז, אשר יש אין טרנספורטר ספציפי של מערכת העיכול, ואת האוסף עוקבות מדידת ריכוזים לקטולוז בדם ההיקפי. סמנים בלע חלופי של פונקציית מכשול כגון פחמימות fluorescently שכותרתו הינם גם זמינים9,10. גישה זו היה מותאם תרביות תאים אפיתל המעי גדל תומך Transwell11, בגישה פשוטה מאפשר בקרה ניסויית גדול יותר, אך גם ביקורת כמו מנבא המסכן של vivo חדירות בשל היעדר תת אפיתל הבדיל ו- מבנה רקמות12. באמצעות לשכות מייצג גישה אחרת ובכל זאת ולאפשר לשקילת מחסום האפיתל פונקציה mucosa מעיים כל לשעבר vivo13. היישום של טכניקה זו לעתים קרובות מוגבל על ידי רקמת זמינות ותנאי13,14. לכן שיטות חדשות אשר לאזן הפארמצבטית ותפוקת עם רלוונטיות הפיזיולוגיות נחוצים.

התפתחויות במבחנה organogenesis הובילו האימוץ של תרביות רקמה 3D דגם מערכות כפלטפורמה מתוחכמים recapitulating את הדינמיקה של רקמות מורכבות15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. בפרט, אנושי pluripotent תאי גזע (hPSC) נגזר organoids מעיים אנושיים (HIOs)19,24 הופיעו כמערכת מודל השפעול צייתן הדירים לצורך המחקר של אינטראקציות מיקרוביאליים המארח ו מחסום האפיתל dynamics25,26,27,28. באופן דומה, organoids נגזר רקמה אנושית (הידוע גם בשם enteroids) הנגזרות הליך הביופסיה פשוטה והוא יכול לשמש כמערכת צייתן ללמוד פיזיולוגיה אנושית ו מחלת15,29,30. Microinjection של organoids מעיים אנושיים מאפשרת למסירה של תרכובות ניסיוני25 או לחיות חיידקים25,31,32,33 הפסגה אפיתל פני השטח של לומן תא צורב. . לסלי ווונג et al. 25 הותאם לאחרונה בטכניקה זו כדי למדוד את מחסום חדירות ב- HIOs microinjected עם fluorescein isothiocyanate (FITC) עם התווית לתוספי בעקבות חשיפה ל: רעלנים חיידקי.

פרוטוקול זה מיועד כמדריך לשקילת מחסום האפיתל חדירות נגזר hPSC HIOs, HIOs, נגזר רקמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם שינויים מזעריים, זה יכול לשמש גם פריימר כללי על microinjection של HIOs עם תרכובות ניסיוני. משתמשים ייתכן שנשלים פרוטוקול זה עם יישומי הזרם נוספים או חלופית לאחר microinjection.

פרוטוקול

רגיל, מזוהה מבטל את הבוגרים מעיים מרקמות הושג מתורמים איברים המנוח לעבור מתנת החיים, מישיגן. ES האדם תא קו H9 (NIH הרישום #0062) הושג ממכון המחקר WiCell. רקמה אנושית כל שימוש בעבודה זו הושג מתורמים שאינם חיים, זוהה בטל, נערך באישור אוניברסיטת מישיגן IRB (פרוטוקול # HUM00093465 ו- HUM00105750).

1. microinjector ההתקנה

  1. להשיג את החומרים המפורטים בטבלה חומרים.
  2. מקם את micromanipulator, את הטווח ויבתר ואת מקור אור אבטחה הקבינט. לנקות את ההתקנה microinjection עם 70% אתנול או אחר שיפגום לפני שימוש ניסיוני. להימנע משהייה ממושכת חיטוי המכיל אקונומיקה, אשר עלולה לאכל את הציוד microinjection.
    הערה: דוגמה של אסיפה microinjector המלא מוצג באיור1.
  3. מקם את הטווח ויבתר כך היצירה העין יכול לשמש דרך היציאה גישה בתוך המגן אבטחה הקבינט.
    1. לחלופין, השתמש ספסל נקי עם מערכת זרימת אוויר חיובית במקום אבטחה ארון עם נקודות גישה מיקרוסקופ.
  4. להרכיב את micromanipulator בצד ימין של המיקרוסקופ על פי הוראות היצרן ולהתאים כך הפקדים יכול להיות בקלות להגיע להתאמה. Micromanipulator צריך להיות מותקן בצלחת ברזל או אחרת התייצב.
    הערה: משתמשים שמאליים רצוי למקם את micromanipulator בצד שמאל של הטווח ויבתר.
  5. הר בעל micropipette את הזרוע micromanipulator וחבר הצנרת אנלוגי על ידי הכנסתו בעל micropipette.
  6. למלא את המזרק זכוכית 10 מ כ 5-7 מ של שמן מינרלי סטרילי.
  7. לחבר את המזרק זכוכית 10 מ ל מלא שמן מינרלי לקצה הפתוח של הצנרת אנלוגית באמצעות מנגנון נעילה סכינים סטריליים. מקם את המזרק זכוכית משמאל היקף ויבתר, מול מ micromanipulator.
  8. בעדינות לדכא את המזרק, דוחפת שמן מינרלי דרך הצנרת. ריקון כ 10 טיפות של שמן מינרלי מהקצה של בעל micropipette ו לאסוף פטרי או כלי דומה וזורקים.
    הערה: שלב זה מסיר כל הצנרת, צריכה להתבצע לפני כל הפעלה microinjection.

2. הכנה microinjection

  1. 24 שעןת לפני microinjection:
    1. להכין FITC לתוספי פתרון על ידי השעיית מחדש FITC לתוספי-ריכוז של 2 מ"ג/מ"ל ב- PBS סטרילי או תמיסת מלח. להכין את הנפח הכולל של > 250 µL.
      הערה: ריכוז גבוה או נמוך של FITC-לתוספי עשוי לשמש, החל כ 0.1 - 10 מ"ג/מ"ל. התאם את הריכוז של FITC-לתוספי שיתאימו במורד הזרם היישום הדמיה.
    2. הגדרת תרבויות תא צורב על 4 או 8-ובכן זכוכית קאמרית שקופיות או כלי אחר תרבות מתאים לחיות מיקרוסקופ, עם עד 4-6 HIOs לכל טוב, המוטבעות 50 µL תא מטריקס פתרון ותרבותית EGF, הראש, R-Spondin (ENR) גורם הגדילה מדיה 19 ,24. לטפל כדי לרווח את organoids באופן שווה (כ 5 מ מ אחד מהשני) כדי להימנע לכידת HIOs מרובים בשדה מיקרוסקופיים יחיד במהלך ניתוח ההדמיה בזמן אמת. לקבלת המדריך השלם HIO תרבות ותחזוקה ראה McCraken. et al. 24.
      הערה: פרוטוקול זה פותחה באמצעות תאי גזע נגזר HIOs, התוצאות נציג (ראו להלן) מדגימים את השימוש מודל זה תרביות רקמה. עם זאת, באותו הפרוטוקול בקלות מותאם רקמות, נגזר organoids אפיתל המעי15,29. HIOs רקמה-derived קטנים בדרך כלל HIOs, נגזר PSC וחוסר תמיכה mesenchymal basolateral תא מבנה15,29,30. Microinjection של רקמות, נגזר HIOs עשויים לדרוש מידה רבה יותר של יכולת טכנית וניסיון. מידת שאליו מחסום האפיתל חדירות נתונים שהושגו באמצעות רקמות, נגזר HIOs עשוי לתאם עם hPSC, נגזר HIOs אינו ידוע.
    3. דגירה HIOs ב חממה תרבות תא סטנדרטי-42 ° C ו- 5% CO2 לפני microinjection.
  2. 30 דקות לפני microinjection, להפעיל אבטחה את הקבינט, הרימו את המגן זכוכית גובה עבודה אופטימלית.
  3. הסר פריטים מיותרים כל אבטחה הקבינט. העומס מגביר את הסיכון של נוזלים או תאונות אחרות כאשר עובד מקומות סגורים.
  4. תרסיס ולנקות ביסודיות את משטח העבודה עם 70% אתנול או חומר חיטוי אחר. מנקים בעזרת מגבת נייר.
  5. בדוק את הרמה של שמן מינרלי במזרק זכוכית המצורפת את microinjector. אם יש פחות מ- 3 מ של שמן מינרלי שנותרו, להתיר את המזרק ולמלא בפנים אבטחה cabinet, נזהר שלא להעלות בועות. אל תמלא יותר מ 7 מ.
  6. הפעל את המנורה להאיר את הטווח ויבתר. להתאים את העינית לנוחות האישית.
  7. מקם את micromanipulator בצד ימין של הטווח ויבתר. אבטח את micromanipulator כדי בצלחת ברזל באמצעות עמדה מגנטי. מעבר לדוכן מגנטי למצב כבוי כדי לכוונן את המיקום של micromanipulator ולאבטח את תעמדי לוח ברזל על-ידי הגדרת העמדה מגנטי למצב ON.
  8. Microcapillary התקנה
    1. אחזר פילמנט זכוכית יחידה 1 מ"מ מהגורם האחסון המסופקים על ידי היצרן.
    2. הכנס את הסיב זכוכית דרך מרכז סליל חימום נחושת של פולר micropipette.
      הערה: ראה איור 2 מדריך הכנת את פולר micropipette.
    3. מקם את הסיב כך סליל חימום נחושת הוא בערך באמצע הסיב זכוכית. פעולה זו תבטיח פולר יוצר שתי מחטים microinjection שמיש של כל פילמנט זכוכית.
    4. אבטח את הזכוכית נימה באמצעות התפסים הידוק העליון באמצעות מלחציים קודם, מוודא כי הסיב זכוכית מאובטח בתוך המטע מחורץ כדי למנוע שבירה.
    5. להרחיב את הזרוע פולר למצבה האנכי המרבי לפני הידוק את המלחציים התחתון.
      הערה: שלב זה חיוני. סירוב מלא להאריך את הזרוע פולר תגרום לא סדיר ההפרדה בין שני המקטעים של חוט הלהט זכוכית.
    6. בדוק את ההגדרות על מנגנון החימום ומושך.
בחר חום #1 עם הקטע דו-מצבי (990) ולהגדיר ברגע האחרון 059 (איור 2).
  • להפעיל את המכשיר באמצעות toggle/כיבוי.
  • לסגור את המגן מגן פלקסיגלס ולחץ על הכפתור למשוך על פני הימני התחתון של פולר. סליל נחושת יתחיל חום, יווצר מצב כתום בהיר. ככל שהטמפרטורה עולה, חוט הלהט זכוכית יתחיל למתוח ולהפריד בסופו של דבר. על הפרדה בין שני הקצוות של חוט הלהט זכוכית, המכשיר לכבותה.
    הערה: סליל נחושת יישאר חם מאוד למשך מספר דקות. חוט הלהט זכוכית משך יכונו בשם 'microcapillary' מרגע זה והלאה בפרוטוקול.
  • נזהר להימנע מלגעת של סליל נחושת, להסיר אחת microcapillaries זכוכית. Microcapillary צריך להיות מאוד מאוד. להתמודד עם microcapillary בזהירות עם לטקס או nitrile כפפות והמשך מיד לארון אבטחה המכיל את ההתקנה microinjector.
    הערה: microcapillary זכוכית היא מושחזות והוא עדין מאוד. . לטפל.
  • שחרר את הכובע קצה הזרוע micromanipulator. להכניס הקצה הפתוח של בעל micropipette הצד הקהה של microcapillary משך, תדחוף את זה פנימה עד שהוא מפסיק.
  • באבטחת הצד הקהה של microcapillary את הזרוע micromanipulator על-ידי הידוק מחדש את הכובע בסוף.
    הערה: בעת התקנת את microcapillary על מערכת microinjection לטפל כדי להימנע מלגעת סוף מחודדים. זה להקטין את הסיכוי לזיהום, לשמר את הצבע בסדר עבור microinjection. שהכשלון כראוי את microcapillary יכול לגרום לחוסר יציבות או שבירה של חוט הלהט זכוכית במהלך microinjection.
  • פתח את קצה microcapillary הזכוכית. במהלך הכנת microcapillary זכוכית משך, הקצה של נקודת יתמוססו סביר בצורה כזאת כדי לאטום את הקצה המחודד של microcapillary. כדי להסיר את החסימה:
    1. מקם את micromanipulator כך microcapillary מכוון למטה השלב זכוכית של הטווח ויבתר בלי לגעת משטח זה.
    2. למצוא משטח פלסטיק סטרילית (החלק התחתון של המכסה צלחת תרבות עובד בצורה מושלמת) ומניחים אותו על הבמה מיקרוסקופ ישירות מתחת המחט microcapillary על הבמה של הטווח ויבתר.
    3. מרכז את קצה microcapillary מתחת לאזור הצפייה ולהבטיח כי היא מוצגת בעת חיפוש דרך העיינית של המצלמה של המיקרוסקופ מתחת לגיל 1.5 X הגדלה.
    4. באמצעות הפקדים micromanipulator, באיטיות, את micromanipulator ואת microcapillary לכיוון סטרילי תרבות הפלסטיק המכסה הטיפ בקושי קשר משטח הפלסטיק עד קצה microcapillary שובר חינם.
      הערה: המטרה עבור ההפסקה האפשרי הקטן ביותר המאפשר זרימת נוזלים מחוט הלהט זכוכית כדי למזער את הנזק HIO במהלך microinjection.
    5. בחזרה את microcapillary מהמשטח סטרילי כדי למזער את הסיכוי של שבירה מקרית לפני שתמשיך.
    6. בדוק את microcapillary זרימה על ידי מדכא את המזרק זכוכית, דוחפת שמן מינרלי דרך הצנרת. אם נפתח בסוף microcapillary תראה droplet קטן של שמן מינרלי מגיחים קצה microcapillary אחרי כמה שניות. אם זה לא התרחשה, חזור על הצעד הקודם וכן בדיקה חוזרת.

    • 3. עקר Microinjection

    הערה: לאחר microcapillary המוכנים, הותקנה, והיתה נבדק, להתחיל microinjecting HIOs. איור 3 מדגים של רקמות-derived HIO זה שהוחדרו בהצלחה עם FITC-לתוספי.

    1. למלא את microcapillary עם הזרקת החומר. להטביע את קצה microcapillary זכוכית ההשעיה הזרקת לתוספי FITC, וישתדלו למנוע שבירת קצה microcapillary נגד הצדדים או התחתון של הצינור. ברגע קצה microcapillary שקוע בפתרון, משוך לאחור המזרק שמן מינרלי למשוך כ 10 µL של ההשעיה לתוספי FITC אל microcapillary.
      הערה: מומלץ לשימוש צינורות 1.5 mL או 0.5 mL הזרקת הפתרונות/התרבויות מאז ניתן יהיה לגשת בקלות הרבה ביותר כדי microcapillary מותקן... לחלופין, הזרקת פתרונות ניתן להסיק על צלחת פטרי סטריליות או סטרילי מצלמות-מיקרוסקופים, אשר עשוי להפחית את הסיכוי לפגיעה שרפ על-ידי הגבלת את הצורך להחזיק צינור סגור קרבתה microcapillary. אם המתלה הוא בעלי צמיגות גבוהה או אם הפתח של microcapillary הוא קטן במיוחד, זה עלול לקחת מספר שנית כדי למלא את microcapillary. אל תצייר את המתלים microinjection לתוך לאורך צינור פלסטיק microinjection, כמו זה עשויים לזהם את המערכת כולה microinjection.
    2. תפסיק למלא את microcapillary כאשר המתלה microinjection ממלא 90% של אורך microcapillary זכוכית. לדכא את המזרק מעט לפני מהאמנה microcapillary את הפתרון microinjection כדי להבטיח כי קצה microcapillary לא יכיל כיסי אוויר.
      הערה: אם הבחינה של microcapillary מגלה כיסי אוויר, לרוקן ולמלא מחדש.
    3. הסר את plate(s) תרבות HIO התרבות התא ואז העברה כדי אבטחה ארון עם microinjector.
    4. הסר את המכסה הצלחת תרבות HIO בתוך ארון אבטחה, מרכז הבאר הראשונה על הבמה מיקרוסקופ, כך שזה נראה בבירור דרך העיינית של המצלמה של הטווח על ההגדלה הנמוכה ביותר.
    5. להפוך את הזרוע micromanipulator כך microcapillary הוא הצביע למטה לתוך התרבות HIO טוב בזווית > 45° ביחס השלב מיקרוסקופ. מטרה זו מושגת בקלות הרבה ביותר על-ידי הפעלת באופן ידני את מכלול הזרוע micromanipulator על צירו האופקי בנקודה שבה micromanipulator אופקי זרוע התמיכה פוגש הדוכן אנכי, מאז הפקדים בסדר (מחייג שחור) יש מגוון מוגבל של תנועה. מקם את קצה microcapillary מעל התרבות הראשונה טוב כ 1 ס מ מעל פני השטח של אמצעי התקשורת (איור 3 א). תמונת הנציגה מפגין microinjection של רקמות, נגזר organoids אפיתל המעי מוצג באיור 3B.
    6. בדוק כי שניהם קצה של חוט הלהט זכוכית, HIO(s) את גלויים דרך העיינית של המצלמה. ולמקם מחדש במידת הצורך.
    7. לקדם את microcapillary לאט על-ידי סיבוב עם כיוון השעון את כפתור בקרת ציר z.
      הערה: אם לשפוט את המיקום של הקצה microcapillary, במיוחד את העומק, דורש תרגול. הטיפ מפרה את פני השטח של התקשורת, שימו לב חזותי סילוף קטן של קצה microcapillary.
    להמשיך עם הטיפול מנקודה זו כדי למנוע לשבור את microcapillary כנגד התחתית לצלחת תרבות או פגיעה של HIOs.
  • חוררי את HIO עם קצה microcapillary. המשטח החיצוני של HIO לדכא מעט כפי microcapillary מתחילה שתלחצי, לסדר לחזור לכושר, כמו הטיפ חודר לומן. זה עשוי להיות קשה לזהות את קצה microcapillary בתוך HIO לומן. התאם את הגדרות תאורה או הגדלה של היקף ויבתר אם קיים קושי לראות את microcapillary.
  • הסר את הידיים הפקדים micromanipulator כאשר microcapillary ימוקם בצורה נכונה עם קצה microcapillary סמוך למרכז HIO.
  • לדכא את המזרק שמן מינרלי מעט כדי לדחוף את הפתרון microinjection מתוך את microcapillary, לתוך לומן HIO. HIO עשוי להרחיב מעט כדי להתאים את עוצמת הזריקה.
    הערה: לטפל כדי למנוע יתר מספקות את HIO זה יגרום את תא צורב להתפוצץ. כלל אצבע, כל הרחבה גלוי של אמצעי האחסון HIO אומר שהגיע הזמן להפסיק. הנפח הממוצע של לומן HIO בוגר הוא כ 1 µL, אך עשוי להשתנות באופן משמעותי. אוטומטי מזרק משאבות עשוי לשמש במקום מזרק ידנית כדי לאפשר שליטה טובה של אמצעי האחסון מוזרק.
  • למשוך את microcapillary HIO באמצעות ציר z בקרת המיקום מעל פני השטח של התקשורת.
  • להזיז היעד HIO הבא עם microcapillary מעל התקשורת כדי למנוע נזק בשוגג HIOs במהלך התמרון ולהזריק באופן דומה (ראה שלבים 3.6-3.11).
    1. למלא את microcapillary באמצעות הגישה המתוארת לעיל.
      הערה: אם העצה נשברת בשלב כלשהו במהלך microinjection, אל תנסו להמשיך זריקות. לשנות את הטיפ על פי ההוראות שלהלן.
  • לשנות את microcapillary בין הטיפולים או במקרה של שבירה. לשחרר את המלחציים בקצה הזרוע micromanipulator ולהסיר את microcapillary בעל micropipette.
    התראה: לא מסתדר עם microcapillary ליד הצד החד. הטעם בסדר microcapillary מושחזות, בקלות לנקב כפפות ועור. משנה זהירות ולהיות מודע כל התנועות, טיפול של microcapillary באמצעות manipulator בלבד ולא הנחת הידיים בין הנקודה של microcapillary התרבויות HIO. פונים לטיפול רפואי באופן מיידי במקרה של מקל המחט מ microcapillary המכילה מדבקים או רעלים.
    הערה: במקרים מסוימים, ייתכן מסובך לאשר באופן חזותי microinjection HIO מוצלחת. הניראות של המתלים ברור microinjection יכול להיות מוגברת על ידי השימוש תוספת של ריכוז גבוה של FITC-לתוספי.

    • 4. טיפול תרופתי של HIOs

    1. כדי לבדוק תרכובות נמסר האפיתל הפסגה, resuspend ב- PBS סטרילי המכיל 2 מ"ג/מ"ל FITC-לתוספי, microinject לתוך לומן HIO כמצוין לעיל (סעיף 3). לניסוי נציג, resuspend Clostridium difficile רעלן TcdA-12.8 ng/µL ב- PBS המכיל FITC-לתוספי.
    2. כדי לבדוק תרכובות נמסר תא basolateral, להחליף התקשורת תרבות חיצוניים מדיה חדשה המכילה 2 מ מ אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic (EGTA)(positive control), PBS רכב לבד (שליטה שלילי ), או מתחם ניסיוני אחרת לאחר microinjection של FITC-לתוספי.
      הערה: מינון ותזמון של היישום של תרכובות תרופתי, רעלנים או סוכנים אחרים עשויים להשתנות בהתאם השאלה ניסיוני.

    5. חיים הדמיה של Microinjected Organoids

    1. מתחילים בשידור חי microinjection הבאות מיד הדמיה. להעביר את הצלחות תרבות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד תא humidified ומתוחזק על 37 ° C ו- 21% O2 ו- 5% CO2 עם תא חי אוטומטי מערכת הדמיה. לסגור את הלשכה הסביבה ולהתחיל את תהליך ההדמיה.
    2. הפעל את תוכנת ניתוח התמונה (למשל, softWoRx) משולחן העבודה. לחץ על "קובץ" ובחר "רכוש (פתור 3D)" לאתחל את ההדמיה והתוכנה שליטה מיקרוסקופ.
    3. הגדר עירור/פליטה FITC (475 nm עירור/523 nm פליטה), הגדר את עוצמת השידור 5%, ואת העדשה 4 X. הגדר את זמן החשיפה 0.025 ms (איור 4A).
      הערה: זמן החשיפה צריך להיות מגוונים כדי להתאים את עוצמת האות פלורסנט. באופן כללי, האות זריחה FITC יקטן בלבד. לכן, כדי להבטיח במרב הרגישות, טיימס החשיפה הראשונית צריך להיות מותאם כך האות פלורסנט מוקלטות שנמצאת מתחת נקודת הרוויה של מצלמה ותוכנת הדמיה.
    4. למצוא את HIOs 4 X הגדלה באמצעות הבקר הדיגיטלי מחובר המיקרוסקופ. מרכז את HIO תוך צפייה שדה (איור 4A).
    5. לחץ על "תצוגה" בסרגל הכלים ובחר "הצבע ברשימת" כדי לחשוף את חלון חדש. לחץ על "לסמן נקודת" כדי לאחסן את המיקום הנוכחי של הבמה ברשימה פוינט (איור 4A).
    6. חזור על שלבים 5.4 ו- 5.5 עד העמדות של כל HIOs תועדו. באמצעות ' פנקס רשימות ' או רישום דיגיטלי, רשום מספר מזהה ייחודי המוקצים לכל תפקיד מיקרוסקופ מתוכנת ותמונות שנתפסו במיקום זה. קובצי התמונה יהיו מתויגות עם מספר מזהה זה, יהיה חשוב לשייך מספרי זיהוי תמונה ספציפית HIOs וטיפולים השלמת איסוף הנתונים.
    7. להגדיר אוסף תמונה אוטומטית, לחץ על "קובץ" ולאחר מכן "ניסוי" בסרגל הכלים. שם הניסוי עם התאריך או שם ייחודי אחר.
    8. להגדיר את הפרמטרים עבור אוסף תמונה על ידי מעבר על כל אחת מהכרטיסיות אפשרות כפי שמוצג באיור 4B.
      1. נטרלו "Z חלוקתה" תחת לשונית "חלוקתה".
      2. תחת לשונית "ערוצים", הזן את הפרמטרים מן החלון העליון השמאלי "לפתור 3D". כדי לחסוך זמן, השורה הראשונה תאכלס באופן אוטומטי כאשר תיבת שמאלה מסומנת.
      3. תחת לשונית ' זמן לשגות ", סמן את התיבה שכותרתו"זמן לשגות", הזן את מרווח הזמן בין התמונות בשורה המסומנת בתווית"זמן לשגות"והמשך הכולל של הניסוי בבשורה המסומנת בתווית"הזמן הכולל". התוכנה יחשב באופן אוטומטי את מספר נקודות זמן.
      4. תחת לשונית "נקודות", סמן את התיבה שכותרתו "ביקור פוינט רשימת".
    אתה עלול גם להזין באופן ידני את המספרים מנקודה מסוימת כדי להיכלל הניסוי על-ידי הקלדת בתיבת הטקסט.
  • אל תשנה את אפשרויות ברירת המחדל מתחת ללשוניות "פאנלים" או "פעולות".
  • לחץ על הכרטיסיה "לרוץ" הזן התאריך של הניסוי בתיבת שכותרתו "שם קובץ התמונה" ולהגדיר את נתוני מיקום תחת "הגדרות" שמירה.
  • לחץ על החץ הירוק כדי להפעיל את המאקרו הניסוי. מונה זמן לשגות יעקבו אחר התקדמות ניסיוני.
  • בסוף הקורס המתוכננת, לייצא ולשמור כל קבצי התמונות כתמונות 24-bit RGB TIFF (איור 4C).
    1. בסרגל הכלים, בחר באפשרות תהליך ולאחריו פעילות בונה.
    2. בתפריט בונה ' פעילות ', להוסיף קבצים על-ידי ניווט אל תיקיית הנתונים שצוין ב- 5.9. לסמן את כל הקבצים המסתיימים ב- ".dv" על-ידי הקלדת "*.dv" שורת הפקודה. בחר כל (Ctl + A) ולחץ על 'הוסף'.
    3. לחץ על + תחת המקטע שכותרתו "משימה". בחר "לייצא כעול" ולחץ על הכרטיסייה 'אפשרויות'.
    4. הגדר "ייצוא תבנית" כדי "תמונות TIFF", סמן את התיבה שלהלן כדי להוסיף "תיקיית פלט מותאמת אישית". . זה המיקום שבו יתבצע ייצוא תמונות TIFF. בחר 24-bit RGB תחת 'סוג פלט TIFF' ולחץ על "לעשות".
    5. לחץ על "הגש כדי תור" כדי להפעיל את המאקרו לייצא.
  • העתק תמונות TIFF לייצא ב- 5.11 אל מנהל התקן חיצוני או שרת אם אתה יבצע את הניתוח שלאחר הדמיה (סעיף 6) במחשב אחר.
    הערה: רקמת HIO ומדיה ניתן לאחסן עבור היסטולוגיה34, PCR35) מערביות, כתם36, או אחרים ניתוח במורד הזרם.

    • 6. הדמיה שלאחר ניתוח

    1. ודא ImageJ37 מותקן ופועל כראוי במחשב כדי לשמש לניתוח.
      הערה: פיג'י37 הוא הפצה חלופית של תוכנית הליבה ImageJ יפעלו באותה מידה טוב לניתוח זה.
    2. להתחיל את הניתוח אצווה על-ידי בחירה "תהליך" ולאחר מכן "אצווה", ולבסוף "מאקרו" מתוך תפריט ImageJ.
    3. הגדר את הקלט לספריה המכילה תמונות TIFF שנאספו במהלך זמן הניסוי. פתח את הקובץ מאקרו ImageJ "thesholdmeasure.ijm" או ישירות העתק/הדבק קוד המאקרו לתוך החלון. לחץ על "תהליך" כדי להתחיל עיבוד הקבצים.
      הערה: הסף המינימלי ערך x (setThreshold(x,255);) ניתן להגדיר כל מספר 0 - 255, צריך להיות מותאם כדי לחסל רקע זריחה. ערכים < 100 מומלצים. מדעית לקבוע את ערך הסף המתאים, הפעל את המאקרו הדמיה על תמונה אחת המייצגת תא צורב בלי קליטה פלורסנט. כלומר עוצמת תמונה זו יכול לשמש כמדריך לקביעת הסף כראוי. עבור הניתוח של נציג שיובאו להלן, הסף היה מוגדר "42".
    4. ImageJ תפיק שולחן גדול המכיל האזור של כל הפיקסלים בטווח עוצמת סף, ממוצע, חציון, מינימום ו בעוצמה מקסימלית (מוגבל) ערך עבור האזור בגבולות עוצמת סף. שמירת זה CSV או XLS.
    5. שינוי בעוצמת לאורך זמן יכול להיות מחושב ב גיליון39 בכך ששינה את טבלת הנתונים כדי לבצע את החישוב שלהלן או יכול להיות אוטומטיות באמצעות מתאים של שפת תכנות. קובץ script לדוגמה ניתוח בכתב R 40 מסופק עם כתב היד הזה.
      הערה: עבור כל HIO, עוצמת קרינה פלואורסצנטית היחסי עשוי להיות לכמת כמו figure-protocol-1 . חיסול זמן 41 (t1/2) של FITC-לתוספי ב HIO לומן חושבה כלהלן:
      1. ראשית, לחשב את "השטח מתחת לעקומה" (חאן אל) מן העקומה המתארת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית יחסית במשך הזמן (t) כמו:
        figure-protocol-2
      2. לאחר מכן, לחשב את "אישור" (figure-protocol-3) קצב עם הנפח של התפלגות (Vd) המוגדר כ- 1 עבור זריחה מנורמל ב t = 0:
        figure-protocol-4
      3. לאחר מכן, הגדר "חיסול קצב קבוע" (figure-protocol-5) כמו:
        figure-protocol-6
      4. לבסוף, לחשב את "זמן חיסול" (t1/2) כמו:
        figure-protocol-7
        המשוואה מופחת ולכן:
        figure-protocol-8

    תוצאות

    HIOs היו הבדיל מתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית בפתרון מטריקס תא כמו בעבר תיאר19,24. לאחר 4 שבועות בתרבות, HIOs היה להרחיב במידה מספקת כדי לאפשר microinjection. HIOs היו microinjected עם 4 kDa FITC מצומדת לתוספי מושעה PBS או PBS המכיל Clostridium difficile רעלן TcdA. ג difficile הוא פתוגן במערכת העיכול הזדמנותית זה מוצגים בתיווך הרעלן רעילות אפיתל HIOs25. כפקד חיובית, EGTA נוספה HIO תרבות המדיה של תת-קבוצה של HIOs מוזרק עם PBS ו FITC-לתוספי. EGTA הוא chelator סידן הגורמת מהירה והתבקשתי פלמור של שלד התא אקטין42. זריחה FITC היה פיקוח בזמן אמת על מיקרוסקופ הדמיה חיה בתוך תא הסביבה מבוקרת, תמונות נלקחו בשבי במרווחים של-10 דקות.

    פוסט-הוק ניתוח של נתונים הדמיה גילה הבדלים ניכרים השמירה של זריחה FITC (איור 5). HIOs מוזרק עם PBS נשמר כמעט את כל האות פלורסנט נוכח t = 0, אולם HIOs זה גם הוזרקו TcdA של מטופלים עם EGTA הציג ירידה משמעותית בעוצמת פלורסנט לפי 8 שעות פוסט-microinjection (איור 5A)-נתוני הדמיה היו לכמת עבור כל HIOs בנקודות זמן כל לייצר dataset ברזולוציה גבוהה המייצג את השינוי היחסי בעוצמתם פלורסנט לאורך זמן במצב כל ניסיוני (איור 5B). הבדלים חדירות אפיתל הוערכו על ידי חישוב חיסול אכזרי הזמן (t1/2 ) של FITC עבור כל קבוצת הטיפול (טבלה 1) השוואת הבדלים t t1/2 בין קבוצות באמצעות הסטודנט t-מבחן. HIOs שטופלו שליטה נשמרים רוב FITC אות ניאון יותר מ 16 שעות (t1/2 = ± 17 0.3 h). טיפול עם EGTA הקטינה באופן משמעותי זמן ביעור FITC-לתוספי יחסי שליטה HIOs (t1/2 = 2.6 ± 0.2 שעות; P = 1.3 x 10-8). בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו בעבר25, microinjection של TcdA גדל באופן משמעותי מחסום האפיתל חדירות יחסי שליטה טיפול (t1/2 = ± 7.6 0.6 h; P = 5.4 x 10-4). לפיכך, חיצוני (EGTA) והן microinjected (TcdA) תרכובות המסוגלים גרימת שינויים משמעותיים במחסום האפיתל חדירות ב- HIOs. תוצאות אלו מראים כי ההשפעות של מגוון רחב של סוכנים תרופתי מטבוליטים, מוצרים חיידקי, ציטוקינים, גורמי גדילה, תרכובות אחרות על מחסום האפיתל פונקציה עשויים להעריך באמצעות גישה זו.

    טיפולHalf-life (h)SEM (h)להוריד את 95% CI (h)העליון 95% CI (h)n
    שליטה17.110.316.4517.7811
    EGTA2.580.191.783.383
    TcdA7.560.63השקיעו 5.939.186

    טבלה 1: זאת אומרת זמן ביעור (t1/2) עבור FITC-לתוספי ב HIOs שטופלו EGTA או TcdA. יחידות הינן microinjection שלאחר שעות.

    figure-results-1
    איור 1: שהעיצוב הבסיסי של microinjector ו- micromanipulator עבור HIO microinjection. תמונה זו מציגה את המשלים מלאה של ציוד המשמש לביצוע microinjection של HIOs. רכיבי מפתח מסומנות, פרטי הזמנה ניתן למצוא בטבלת חומרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    figure-results-2
    איור 2: פולר Micropipette. הנחושת חימום סליל hc, מהדק העליון c1, קלאמפ התחתון (c2), זרוע פולר (הרשות), חום הנבחר דו-מצבי (ht) מזוהים באמצעות החצים. ההגדרה הנכונה של חום 1 ולמשוך מסומנים בטקסט אדום. שיבוץ מראה של פילמנט זכוכית נטענים כהלכה מוכן לחימום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    figure-results-3
    איור 3: להחליפן בתמונות של רקמות-derived HIO הזריק FITC-לתוספי. תמונה (A) הממחיש את מיקום microcapillary זכוכית בדיוק לפני הכניסה לתוך HIO ו microinjection. (B) Brightfield דימוי רקמות-derived האנושי מעיים organoids לאחר microinjection של FITC-לתוספי. שימו לב כי האות זריחה נראית לעין אפילו ללא השימוש של ערכת מסנן ספציפי. הגיוון הזה מסייע דיוק microinjection. 3 X הגדלה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    figure-results-4
    איור 4: חיים זרימת הדמיה- (א) מסך הממחישות את השלבים הנחוצים להפיכת קבע את הפרמטרים מיקרוסקופ, למצוא את HIOs על השקופית ולשמור את המיקום של הבמה עבור כל HIO לדימות. (B) הדמיה מראש הגדרות עבור לכידת בערוץ FITC במרווחי זמן קבועים בכל התנוחות שצוינו א (ג) הדמיה לאחר ייצוא של נתונים בפורמט DV קבצים כתמונות TIFF עם תמונה TIFF אחת לכל HIO לכל נקודת זמן.אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    figure-results-5
    איור 5: תוצאות נציג. תאי גזע (A) נגזר organoids האנושי מעיים (HIO) microinjected עם 2 מ"ג/מ"ל FITC-לתוספי עם תמונה (4 kDa) במשך 20 שעות. HIOs היו microinjected גם עם PBS (בקרה) או Clostridium difficile הרעלן TcdA (12.8 ng/µL) או מטופלים עם 2 מ מ EGTA הוסיף למדיה תרבות חיצוניים. 4 X הגדלה. (B) מגרש בעוצמה אומר מנורמל FITC לאורך זמן, HIOs שטופלו PBS (בקרה), TcdA או EGTA. קווי שגיאה מייצגים S.E.M. ו- n = 11 HIOs (בקרה), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    דיון

    פרוטוקול זה יוצר שיטה כללית של microinjection של HIOs hPSC, נגזר, רקמות, נגזר organoids מעיים, המדד של מחסום האפיתל חדירות בזמן אמת. הראו גם גישת ניתוח ופרשנות של נתונים שנוצר באמצעות שיטות אלה. בהתחשב אימוץ הגוברת של organoids מעיים דגם מערכות16,20,21,28 , האינטרס מכשול מעיים חדירות כרלוונטיים פיזיולוגית פונקציונלי ארוכת שנים תוצאה3,4,5,6, אנו צופים כי אחרים העובדים בתחום זה יוכלו להחיל ולבנות על שיטות אלה.

    ישנם מספר שלבים אשר הם קריטיים ליישום של טכניקה זו. גישה hPSC באיכות גבוהה - או רקמות רקמות HIO נגזר גלובאלים לפני ניסויים נרחבים עם microinjection. HIO למפלגות עשויים להיות heterogenous, עם וריאציה הן בגודל וצורה, למרות רקמות זהות ועל מורפולוגיה הסלולר הוא מאוד לשחזור כאשר ניצול הוקמה מתודולוגיה ליצירת HIOs24. כדורי HIOs המורכב לומן שקופה למחצה יחיד ומדידת כ- 1 מ מ קוטר הינם אידיאליים עבור microinjection ומדידה של זריחה luminal בזמן אמת. במקרים מסוימים, microinjection ייכשל, וכתוצאה מכך התמוטטות HIO או ברור דליפה של חומר מוזרק. ניתן להסיר HIOs שנכשל מתרבות גם שיקול של המשתמש באמצעות micropipette סטנדרטי. שקול את העדשות המטרה זמין על פלטפורמת הדמיה בעת בחירת HIOs עבור microinjection ודימות. באופן כללי, 2-4 X המטרה עדשות הינם אידיאליים עבור לכידת את האות מלאה HIO פלורסנט, למרות מטרה X 10 עשוי לשמש אם עדשות צריכת חשמל נמוכה אינם זמינים או אם HIOs זמין < 1 מ מ קוטר. תוכנות ליצירת תמונות לאפשר עבור לכידת תמונות פלורסנט בנקודות מוגדרות אוטומטית לאורך זמן.

    מספר שינויים של פרוטוקול זה אפשריות על מנת להתאים את הדרישות ניסיוני. לדוגמה, התוצאות של בדיקות תפקוד המחסום עשוי להיות תלוי בגודל מולקולרי של תרכובות של שימוש43 , אפשר יהיה לבחון את ההכנות לתוספי של משקל מולקולרי בדרגות שונות. בנוסף, ניתן לבצע הדמיה brightfield בנוסף זריחה הדמיה כמחוון של שלמות המבנה הכולל של רקמות25. בעת ביצוע microinjection של חיידקים לחיות25,28,31,32,33,44, זה ייתכן שיהיה צורך להוסיף פניצילין, סטרפטומיצין או גנטמיצין HIO תרבות לתקשורת לפני או לאחר microinjection. החלק החיצוני של microcapillary תזדהם במהלך מילוי עם המתלה התרבות חיידקי, זה עשוי להיות מועבר בתקשורת HIO. לחלופין, ניתן לבצע microinjection HIOs מושעה בתוך מטריצה חוץ-תאית (למשל, Matrigel) ללא מדיה, הוספת המדיה לאחר השלמת את microinjection. זה עלול להגביל את זיהום מטריצה חוץ-תאית, הפנים החיצוניים של HIO. בעת תכנון מבחני צמיחת חיידקים, ייתכן צורך להסיר אנטיביוטיקה בתקשורת לאחר 1-2 h כדי למנוע האטה או מניעת התפתחותם של אורגניזמים microinjected.

    לבסוף, מתוך הכרה כי לא כל החוקרים תהיה גישה מיקרוסקופ ציוד מתאים במבחנה הדמיה, זה חשוב לציין כי ניתן להחיל את ההליכים המתוארים פרוטוקול זה לאיסוף נתוני קרינה פלואורסצנטית מתמונות שצולמו ב timepoints קבוע באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי רגיל ללא לכידת התמונה האוטומטי או פקדים איכות הסביבה. דוגמאות של גישה זו ניתן למצוא בדו ' ' חות מאת לסלי ווונג. et al. 25, שבדקו difficile ג פעילות הרעלן organoids מעיים נגזר hPSC,. Karve, Pradan et al. 44, שבדקו מחסום האפיתל חדירות ב דומה נגזר hPSC המעי organoids microinjected עם חיה e. coli. פעולה ידנית של ציוד הדימות עלול לגרום גדול וריאציה ולקשיי נרמול האות פלורסנט. כאשר ביצוע הדמיה ידנית של FITC-לתוספי מזריקים HIOs זה חיוני כדי לשמור על הגדלה קבועה, עירור פלורסנט בעוצמה ושעות חשיפה לאורך כל הניסוי כדי להימנע מעיוות המדידות פלורסנט בעוצמה.

    גילויים

    המחברים יש אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים לחשוף.

    תודות

    המחברים רוצה להודות ד"ר סטפני Spohn, באזל Abuaita לדיונים שימושיים רבים על microinjection תא צורב. JRS נתמך על ידי ה מעיים תאי גזע Consortium (U01DK103141), פרויקט מחקר שיתופי שמומנו על ידי המכון הלאומי של הסוכרת העיכול, מחלות כליה (NIDDK), המכון הלאומי לאלרגיה ואת ומחלות זיהומיות (NIAID). JRS VBY נתמכים על ידי הרומן NIAID, מערכות מודל אלטרנטיבי קונסורציום המעית מחלות (NAMSED) (U19AI116482). DRH נתמכת מנגנוני פתוגנזה מיקרוביאלי הכשרה המענק של המכון הלאומי של אלרגיה ומחלה זיהומית (NIAID, T32AI007528) את פרס קלינית ומדעי Translational למכון מישיגן קלינית ובריאות מחקר (UL1TR000433).

    קבצי נתונים וקוד ניתוח נתונים המשמשים כתב יד זה הינם זמינים https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    EGTA 0.5 M סטרילי (pH 8.0)Bioworld405200081
    תמיסת מטריצת תאים (Matrigel)קורנינג354230
    Deltavision RT מערכת הדמיית תאים חייםGE Life Sciences29065728http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
    מצלמהGE Life Sciences29065728כלול במערכת Deltavision
    תוכנת הדמיה softWoRxLife Sciences29065728כלול במערכת Deltavision
    ארון בטיחות ביולוגיתLabconcoCell Logic+http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
    1X PBSLife Technologies10010-023
    Advanced DMEM-F12Life טכנולוגיות12634-010רכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24
    B27 supplement (50X)Life Technologies17504044רכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24
    L-glutamine (100X)Life Technologies25030-081רכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24מאגר
    HEPESLife Technologies15630080רכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24
    מניפולטורNarshgeUM-3C
    MicromanipulatorNarshgeUM-1PF
    מחזיק פיפטהNarshgeUP-1חלופי למחזיק פיפטה Xenoworks
    מעמד מגנטיהיקף ניתוח NarshgeGJ-1
    OlympusSX61היקף מומלץ, אם כי סביר להניח שדגמים אחרים תואמים
    מיקרוסקופ פלואורסצנטי Olympus IX71 OlympusIX71כלול במערכת Deltavision
    CoolSNAP HQ2Photometrics29065728כלול במערכת Deltavision
    רקומביננטית C. difficile רעלן A/TcdA חלבוןR& D Systems8619-GT-020
    EGFR& D Systems236-EGרכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24
    R-spondin 1R& D Systems4645-RSרכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24
    NogginR& D Systems6057-NGרכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24
    שמן מינרליSigma-AldrichM8410
    FITC-dextran (4 kDa)Sigma-Aldrich46944
    חולץ מיקרופיפטותSutter InstrumentsP-30
    Nunc Lab-Tek II Chamber SlidesThermoFisher Scientific154526PK
    חוטי זכוכיתWPITW100F-4
    מחזיק מיקרופיפטהXenoworksBR-MH2מכשיר מועדף
    ערכת צינורות אנלוגיתXenoworksBR-AT
    1/16 בטבעת שקופהXenoworksV001104
    1-1.2 מ"מ טבעתO XenoworksV300450
    GE

    מקורות

    1. Standring, S., Borley, N. Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).
    2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).
    3. Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest. 84, 282-291 (2004).
    4. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
    5. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterol. 14, 189(2014).
    6. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target? Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).
    7. Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat. Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).
    8. Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. Intestinal permeability tests in coeliac disease. Clin Lab. 47, 143-150 (2001).
    9. Salles Teixeira, T. F., et al. Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls. Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).
    10. Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).
    11. Donato, R. P., et al. Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells. Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).
    12. Balimane, P. V., Chong, S. Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique. Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).
    13. Vidyasagar, S., MacGregor, G. Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability. Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).
    14. Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).
    15. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
    16. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
    17. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).
    18. Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids. Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).
    19. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
    20. Aurora, M., Spence, J. R. HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue. Dev Biol. 420, 230-238 (2016).
    21. Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).
    22. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
    23. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).
    24. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).
    25. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
    26. Leslie, J. L., Young, V. B. A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions. Anaerobe. 37, 25-28 (2016).
    27. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).
    28. Hill, D. R., Spence, J. R. Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).
    29. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).
    30. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
    31. Engevik, M. A., et al. Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).
    32. Forbester, J. L., et al. Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells. Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).
    33. Engevik, M. A., et al. Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).
    34. Bancroft, J., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , Churchill Livingstone. (2008).
    35. Kennedy, S., Oswald, N. PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
    36. Kurien, B., Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
    37. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
    38. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
    39. Winston, W. Microsoft excel data analysis and business modeling. , Pearson Education. (2016).
    40. R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2017).
    41. Rosenbaum, S. Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , Wiley. (2016).
    42. Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).
    43. Vojdani, A. For the assessment of intestinal permeability, size matters. Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).
    44. Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli. PLoS One. 12, e0178966(2017).

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    FITC Dextran

    מאמרים קשורים