הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

8.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56973

⸱

8 במאי 2018

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים מתודולוגיה לניתוח המשובטים של תא גזע hematopoietic מבשרי במהלך התפתחות עובריים מאתר. אנו משלבים אינדקס מיון של תאים בודדים מאזור העורקים-בלוטת המין-mesonephros עובריים עם תרבות משותפת תא אנדותל והשתלות לאפיין את המאפיינים פנוטיפי ואת הפוטנציאל engraftment של מבשרי hematopoietic יחיד.

תקציר

היכולת ללמוד תאי גזע hematopoietic (HSC) בראשית במהלך התפתחות עובריים יש היה מוגבל על-ידי בנגישות של מועדון הכדורגל מונפלייה מבשרי ב העובר מוקדם והיעדר מבחני שמזהים את הפוטנציאל multilineage engraftment לטווח ארוך של פונקציונלית בודדים בשם HSC סימנים מקדימים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה המאפשרת את בידוד ואפיון של מבשרי HSC מאומתים באופן פונקציונלי ברמת תא בודד. ראשית, אנו מנצלים אינדקס מיון לקטלוג הפרמטר פנוטיפי מדויק של כל תא בנפרד ממוינים, באמצעות שילוב של סמנים פנוטיפי להעשיר עבור מועדון הכדורגל מונפלייה סימנים מקדימים עם סמנים נוספים עבור ניתוח ניסיוני. שנית, כל תא ממוין אינדקס הוא תרבותי משותף עם נישה וסקולרית משתית מאזור (AGM) אבי העורקים-בלוטת המין-mesonephros, אשר תומכת ההבשלה של הלא-engrafting מועדון הכדורגל מונפלייה המבשרות על HSC פונקציונלי עם פוטנציאל multilineage, לטווח ארוך engraftment מבחני השתלת. מתודולוגיה זו מאפשרת המתאם המאפיינים פנוטיפי של סימנים מקדימים hemogenic המשובטים עם הפוטנציאל שלהם engraftment תפקודית או מאפיינים אחרים כגון פרופיל תעתיק, מתן אמצעים לניתוח מפורט של מועדון הכדורגל מונפלייה קודמן פיתוח ברמה תא בודד.

מבוא

המשובטים מחקרים גילו הטרוגניות במאפיינים engraftment לטווח ארוך של HSCs למבוגרים, לספק תובנה חדשה HSC יחוברו ושינויים בהתנהגות HSC במהלך ההזדקנות1. עם זאת, מחקרים דומים של HSCs עובריים ו מבשרי שלהם כבר יותר מאתגר. במהלך התפתחות עוברית מוקדמת, HSCs נובעים אוכלוסיה של סימנים מקדימים המכונה hemogenic אנדותל בתהליך ארעי התייחס כאל אנדותל המעבר hematopoietic2. הראשונה מועדון הכדורגל מונפלייה, שהוגדרו על-ידי היכולת שלהם לספק engraftment multilineage חזקות, לטווח ארוך בעקבות השתלת לתוך נמענים למבוגרים ממוזגים, לא מזוהים עד לאחר יום עובריים 10.5 (E10.5) בהעובר מאתר, תדירות נמוכה מאוד3 . במהלך התפתחותם, המבשרות על מועדון הכדורגל מונפלייה (pre-HSC) הנובעות hemogenic אנדותל חייב לעבור התבגרות לפני רכישת מאפייני HSC למבוגרים המאפשרים engraftment יעיל השתלת מבחני4,5 , 6. פגיעה ביעילות המחקר ממוצא HSC נדירים, שפע של אבות hematopoietic עם erythroid, פוטנציאל מיאלואידית, ו הלימפה כבר זוהו לפני ייסודה של מועדון הכדורגל מונפלייה טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה7,8. לפיכך, שיסייעו לך לייחד טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה אבות hematopoietic אחרים דורש שיטות clonally בידוד תאי, לספק להם האותות מספיק עבור ההבשלה שלהם כדי HSC, לזהות את המאפיינים engraftment שלהם מבחני השתלת.

מספר גישות תוארו המאפשרות איתור קדם-מועדון הכדורגל מונפלייה על ידי התבגרות או ex-vivo או vivo כדי HSC. שיטות שמחוץ היו תלויים תרבות של רקמות עובריים, כגון האזור AGM, איפה מועדון הכדורגל מונפלייה הראשון מזוהים פיתוח9. על שיטות אלה, פרוטוקולים אשר משלבות את הדיסוציאציה, מיון של צבירת מחדש של רקמות AGM התירו אפיון אוכלוסיות ממוינים המכיל HSC מבשרי במהלך הפיתוח מ E9.5 ל E11.5 ב פארא-ותיני splanchnopleura (P-Sp) / AGM אזורים4,5,10; עם זאת, גישות אלה אינם לבצע ניתוח תפוקה גבוהה של סימנים מקדימים ברמת תא בודד נדרש לניתוח המשובטים. באופן דומה, אין ויוו ההבשלה על ידי השתלת לתוך עכברים היילוד, איפה microenvironment המשוער יהיה מתאים יותר התמיכה של שלבים מוקדמים של מועדון הכדורגל מונפלייה מבשרי, איפשר גם מחקרים על אוכלוסיות ממוינים מן החלמון AGM / P-Sp (P-Sp הוא האזור קודמן כדי ומזכיר האסיפה) עם מאפיינים של טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה, אבל השיטות האלה גם להיכשל כדי לספק פלטפורמה חזקה ליחיד תא ניתוח11,12.

לימודי Rafii. et al. הפגינו שאת משתית תא אנדותל לפעיל על-Akt (EC) מספקים מצע נישה עבור התמיכה של מבוגרים HSC התחדשות עצמית במבחנה13,14,15. אנחנו נקבע לאחרונה כי מופעל Akt EC נגזר מן האזור AGM (AGM-EC) מספק משרה מתאימה במבחנה ההבשלה של מבשרי hemogenic, מבודד מוקדם ככל E9 בפיתוח, כדי engrafting למבוגרים מועדון הכדורגל מונפלייה, כמו גם עוקבות התחדשות עצמית של מועדון הכדורגל מונפלייה שנוצר16. נתון כי מערכת זו מעסיקה תרבות משותפת 2-ממדי פשוטה, זה בקלות להתאמה לניתוח המשובטים של הפוטנציאל HSC של סימנים מקדימים hemogenic מבודדים בנפרד.

לאחרונה דיווחנו גישה assay הפוטנציאל HSC של סימנים מקדימים hemogenic המשובטים על-ידי שילוב מדד מיון של סימנים מקדימים hemogenic בודדים מעוברים מאתר עם תרבות משותפת AGM-EC, אנליזה פונקציונלית הבאים בהשתלת מבחני17. אינדקס מיון הוא תא מצב של לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) את הרשומות (אינדקסים) כל הפרמטרים פנוטיפי (קרי, פיזור קדמי (FSC-A), לצד פיזור (האס-A), קרינה פלואורסצנטית פרמטרים) של כל תא בנפרד ממוינים כזה אלו תכונות ישויך retrospectively כדי שלאחר מכן אנליזה פונקציונלית בעקבות מיון. תוכנה FACS רשומות הן מידע פנוטיפי עבור כל תא, הבאר/המיקום של צלחת 96-ובכן בו היא מוצבת. טכניקה זו בעבר שימש באלגנטיות כדי לזהות הטרוגניות במועדון הכדורגל מונפלייה למבוגרים, לקבוע פרמטרים פנוטיפי נוספת להעשיר עבור המשנה engrafting לטווח ארוך של מועדון הכדורגל מונפלייה, לתאם את הפרמטרים פנוטיפי של מועדון הכדורגל מונפלייה עם תעתיק מאפיינים-הסינגל תא רמה18,19. כאן, אנו מספקים נתונים היסטוריים מתודולוגיה של גישה זו, אשר מאפשרת זיהוי של פרמטרים ייחודיים פנוטיפי ו שושלת היוחסין תרומות של טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה בשלבים המוקדמים של התפתחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן.

1. הכנת AGM-EC Monolayers לתרבות משותפת

  1. 24 שעןת לפני ניתוח AGM ומיון, להפוך AGM-EC תרבות המדיה מסנן לחטא.
  2. להוסיף ג'לטין 0.1% במים (100 µL טוב) כל טוב של צלחת 96-ובכן דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לשאוב הג'לטין, להשאיר את הצלחת בשכונה תרביות רקמה עם מכסה הסיר עד הבארות יבשים.
  3. לבטל את monolayers AGM-EC וצלחת ללוחות 96-ובכן.
    הערה: לשמור על AGM-EC, מוכנים כמו שתואר לעיל16, AGM-EC תרבות בתקשורת. עקביות, שורות תאים AGM-EC עליו להיות קפוא ברגע מספיקים מתקבלים (בדרך כלל מעבר 1-3), נעשה שימוש במספר המעבר מוגדרת (בדרך כלל מעבר 5-12) לניסויים תרבות משותפת. שורות תאים AGM-EC נגזרות C57BL/6J (CD45.2) AGM. ראה את הטבלה של חומרים עבור כל מדיה קומפוזיציות.
    1. האחות המדיה מן התרבות AGM-EC בבקבוקון2 75 ס מ ומוסיפים 5 מ"ל PBS. האחות PBS, ולהוסיף 3 מ"ל טריפסין פתרון (ראה טבלה של חומרים).
    2. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2-4 דקות עד רוב התאים ממריאים לצלחת. להוסיף 7 מ ל AGM-EC תרבות ומדיה pipet 8 - 10 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל להכין תאים בודדים ההשעיה, ולהעביר ל צינור 15 מ"ל.
    3. ספין ב g x 300 במשך 5 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, להשעות מחדש בתקשורת תרבות של 10 מ ל AGM-EC, מעריכים את מספר תאים עם hemocytometer. לדלל לתאים ריכוז עונה 1 פרק 105 תאים למ"ל AGM-EC תרבות בתקשורת.
  4. להוסיף 100 µL AGM-EC תא ההשעיה (1 x 104 תאים) כל טוב של צלחת 96-ובכן gelatinized. מקומו 37 ° C, 5% CO2 תרביות רקמה חממה הלילה נעשה כדי לאפשר ל- AGM-EC לצרף טופס של טפט confluent.
    הערה: פזר באופן שווה את AGM-EC סטרומה תאים כך שאין overgrowth מוגבלת או תא clumping לתרבות שיתוף אופטימלית.
  5. להכין את טפט AGM-EC AGM תרבות משותפת.
    1. למחרת בבוקר, הכנת כלי התקשורת ללא סרום AGM.
    2. באמצעות פיפטה של 12-ובכן רב-ערוצי, להסיר את המדיה תרבות AGM-EC AGM-EC ולהוסיף µL 200/טוב של מדיה ללא סרום AGM ללא ציטוקינים לשטוף כל התקשורת סרום המכיל שיורית.
    3. מסיר את המדיה ולהוסיף µL 200/טוב של מדיה ללא סרום AGM עם ציטוקינים. לעבוד מהר בעת הסרת והוספת המדיה כך שכבת אנדותל לא נפגעת; למשללהסיר ולהוסיף אותו מחדש מדיה שורה אחת בכל פעם. מקום הלוחות 96-ובכן חממה תרביות רקמה ב 37 ° C עד התאים מתחלקים מוכן לצורך מיון.

2. הכנה של תא בודד השעיה רקמות עובריים מאתר

  1. לנתח את AGM מ matings מתוזמן.
    1. להגדיר את matings מתוזמן ליצירת רקמות עובריים של הגיל הרצויה.
    2. קציר העוברים מן הנקבות בהריון-9.5 ל 11.5 ימי פוסט coitum (dpc), תלוי בשלב של טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה כדי להיות מנותח.
      הערה: רקמות עובריים נקצרים מן העכברים C57BL/6J (CD45.2) כפי שתואר לעיל, בדיוק בשלבים somite על בסיס ספירה16. אנו מתמקדות על ניתוח של אוכלוסיות מאזור AGM עובריים, מבשר שלה, P-Sp, בין E9.5 ל E11.5, המבוסס על somite הזמני.
    3. לנתח ומזכיר האסיפה העוברים20.
      הערה: פרוטוקולים מפורט עבור ניתוח AGM מעוברים מאתר כבר פורסם על-ידי אחרים20. לחלופין, שק חלמון או רקמות אחרות התיימר להיות פעילות טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה יכול גם להיות מנותח בשיטה זו.
  2. מביצועם הרקמות עובריים גזור.
    1. לאסוף את הרקמות ביתור 15 מ"ל צינור חרוטי המכיל 10 מ"ל PBS עם 10% FBS על קרח. כוח המשיכה ליישב את רקמות, וארוקן את PBS/FBS, ולאחר מכן להוסיף מיד 1 מ"ל collagenase 0.25% ומקום באמבט מים 37 º C למשך 25 דקות.
    2. להוסיף 1 מ"ל של PBS/10% FBS, pipet כ 20 - 30 פעמים עם טיפ פיפטה 1 מ"ל לקבל השעיה תא בודד. להוסיף אוטם 8 נוספים של PBS/10% FBS וזורקים צנטריפוגה תאים על 300 גרם x עבור 5 דק את תגובת שיקוע.

3. נוגדן מכתים של תאים עובריים מאתר

  1. להכין מאגר חסימה נוגדן מכתים.
    1. להוסיף 1 µg/mL דאפי (מניות 1 מ"ג/מ"ל ב H2O) של µg/mL 10 אנטי עכבר CD16/CD32 (Fc קולטן (ה-FcR) בלוק) 1 מ"ל PBS עם 10% FBS.
    2. לצייר מזרק 3 מ"ל, עוברים דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22 לחטא. מחדש להשעות בגדר תאים מרקמות dissociated מאתר עובריים (מתוך שלב 2.2.2) בחסימה µL 500 מאגר, דגירה על קרח למשך 5 דקות.
  2. להכין תערובת נוגדן17.
    1. להוסיף 10 µg/mL ה-FcR בלוק 1 מ"ל PBS עם 10% FBS ו 10 µL של כל נוגדן anti-VE-קדהרין מצומדת fluorochrome (CD144, לראות את הטבלה של חומרים), נוגדן anti-EPCR מצומדת fluorochrome (CD201, לראות את הטבלה של חומרים). השתמש מטריים לדילול הסופי של נוגדנים אלא אם צוין אחרת מבוסס על ההמלצות של היצרן או על פי titrations.
      הערה: שילוב נוגדן זה משמש להגדרת השערים למיון, כמפורט להלן (שלב 4.2). מיון המבוסס על הביטוי שיתוף של VE-קדהרין ומאפשר EPCR העשרה משמעותית של חלק AGM-derived תאים המכילים HSC קודמן פעילות, כפי שתואר לעיל17.
    2. הוסף נוספים נוגדנים fluorochrome מצומדת לניתוח נוסף פנוטיפי של מבשרי האינדקס ממוין בודדים.
      הערה: נוגדנים אלה לא בהכרח משמשים להגדרת השערים למיון. ב פרוטוקול מדגם זה, כללנו נוגדן anti-CD41 מצומדת PE ונוגדן anti-CD45 מצומדת FITC כדי לנתח את הביטוי היחסי של סמנים אלה hematopoietic, המתפתחים במהלך הופעתה של טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה של אנדותל hemogenic4 ,5,16,17. סמנים אחרים עניין יכול להיכלל כרצונכם. דוגמאות צבעונית עם פקדים נוגדן isotype מצומדת fluorochrome משמשות כדי להגדיר השערים ואתאיזם לניתוח.
    3. לצייר את המיקס נוגדן, מזרק 3 מ"ל, עוברים דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22 לחטא. להוסיף 500 µL של המיקס נוגדן התליה תא במאגר חסימה, פיפטה כדי לערבב, דגירה על קרח למשך לפחות 15-20 דקות.
  3. לשטוף את התאים מוכתם.
    1. הוסף FBS PBS/10% 8 מ. Centrifuge התאים ב 300 x g במשך 5 דקות, לשאוב ו מחדש להשעות התא גלולה עם 1 מ"ל PBS/10% FBS.
    2. להסיר גושים תא על-ידי pipetting התליה תא באמצעות כובע מסננת תא μm 35 על שפופרת 5 מ. לשטוף את מסננת תא עם אוטם 3 נוספים PBS/10% FBS. Centrifuge התאים ב g x 300 במשך 5 דקות, מחוק לגמרי, להשעות מחדש ב- 500 µL PBS/10% FBS, ומניחים על הקרח עד FACS.

4. אינדקס מיון של סימנים מקדימים Hemogenic יחיד ל 96-ולס עם AGM-EC משתית לתרבות משותפת

  1. הכן את המכונה FACS עבור מצב צלחת ויישר למיון ללוחות 96-ובכן לפי הוראות היצרן. בחר תא בודד במצב ואינדקס מיון מצב בהתוכנה עבור הגדרות מסכת טוהר מקסימלי, ולאפשר רכישת אינדקס פרמטרים עבור כל תא הממוין.
  2. רוכשים דגימה של תאים מן הנוגדן צבעונית דגימות לקביעת שערי למיון.
    1. לטעון את הדגימה תא מוכתם על המכונה FACS ולרכוש תאים על קצב הזרימה הנמוך. מגרש פסוקים FSC-A האס-A ובחירת שער הכולל תאים בגדלים (איור 1B) (אשר מבוסס על התצפית כי פעילות טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה מזוהה בתאי גודל שונה פרופילי ה-AGM17). מגרש FSC-A פסוקים FSC-W ו פסוקים א-האס האס-W, ובחר שערים כדי לא לכלול doublets. אז מגרש FSC-A פסוקים דאפי לשער תאים חיים (שלילי עבור דאפי) (איור 1B).
    2. מגרש PECy7 (או את fluorochrome הרלוונטי על הכתם VE-קדהרין) לעומת PerCP (או את fluorochrome הרלוונטי על הכתם EPCR). שער תאים זה חיובי עבור VE-קדהרין (הכוללת אוכלוסייה מעורבת של תאי אנדותל וכן אבות hematopoietic, טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה מ ומזכיר האסיפה), זה יש ביטוי EPCR גבוהה (אשר מעשיר עבור קדם-מועדון הכדורגל מונפלייה מ P-Sp/AGM17). . זה השער האחרון זה ישמש כדי ליצור אינדקס מיין תאים בודדים בשלב 4.3 (איור 1B).
    3. מגרש fluorochromes נוספים שימשו מכתים.
      הערה: בהתאם subpopulation כדי להיות מנותח, שערים נוספים ניתן להגדיר מבוסס על זיהוי סמנים אחרים כלולים עבור צביעת תאים. עם זאת, מיון אינדקס מאפשר את ההקלטה של הפרמטרים פלורסנט עבור כל תא ממוינים כזה יכול להיות מנותח retrospectively פרמטרים אלה. לפיכך, אין gating נוספים הכרחי בשלב זה. עבור כל הכיוונונים FACS, דגימות צבעונית עם נוגדנים יחיד אמור לשמש להתאמת הפיצוי, להביא בחשבון והתאמת ב הפליטה fluorochromes חופפים, ועם isotype שליטה נוגדנים, חשבון עבור צביעת הרקע ולקבוע שערים שלילי/חיובי.
  3. אינדקס למיין את התאים AGM.
    1. מניחים צלחת 96-ובכן המוכנים stroma AGM-EC בתקשורת ללא סרום AGM עם ציטוקינים (מתוך שלב 1.5.3) בבלוק צלחת של מכונת מיון FACs. לטעון את הדגימה ולהתחיל דוגמת רכישה. בחר אינדקס התא מיון/יחיד במצב ולהתחיל sortingsingle לתאים בודדים 96-ולס. השתמש קצב הזרימה הנמוך כדי למזער גזירה על תאים עובריים.
    2. ודא כי כל האירועים נרשמות במהלך המיון אינדקס. זה יאפשר ספירה של המספר הכולל של תאים ניתח בשער המיון היחסי בפועל מספר ממוינים יחידים 96-לבארות, כמו שלא כל אירועים שנרשמו ימוינו על בארות.
    3. ברגע התאים מוינו על צלחת שלמה של 96-ובכן, מקם את הצלחת חממה תרביות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס להגדיר ב- 5% CO2. חזור על לוחות נוספים הנדרשים לכל ניסוי.
    4. תרבות משותפת בנפרד מיון תאי בבארות-96 המכיל AGM-EC (מתוך שלב 4.3) עד 7 ימים (5 ימים עבור תאים ממוינים מעוברים E11-11.5, 6 ימים מעוברים E10-10.5, 7 ימים מעוברים E9-9.5). דמיינו hematopoietic מושבות מורפולוגיות שונים עם מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה X 100 (איור 2B) לאחר תקופת תרבות משותפת.
      הערה: התקשורת לא צריך להשתנות במהלך תקופת תרבות משותפת. מיון hemogenic מבשרי בתחילה עשויים להשתלב השכבה AGM-EC עם מורפולוגיה EC דמוי ולא ניתן בתחילה הנבדל מן AGM-EC משתית (איור 2 א). אולם, h 24-48 הבאים בתרבות שיתוף, קטנים, מעוגלים תאים hematopoietic או אשכולות של תאים עשויים להתגלות. בקצה של תרבות משותפת (5-7 ימים), ניתן לאבחן מושבות בודדות של תאים hematopoietic במערכת המשנה של 96-בארות אשר התקבל תא ממוינים עם פוטנציאל hematopoietic המשובטים. אם מבחינה ויזואלית בארות שנבדק מכילים המושבה ברורים יותר מפעם אחת, אז דגימה זו אינו נכלל מניתוח במורד הזרם כדי לא לכלול והמדגמים שקיבלת יותר מתא אחד ממוינות לפי טוב.

5. ניתוח צאצאי Hematopoietic המשובטים בעקבות תרבות משותפת

  1. קציר שיבוטים של כל אחד 96-ובכן לניתוח FACS.
    1. Pipet נמרצות מביצועם hematopoietic תאי אנדותל השכבות בעזרת פיפטה רב-ערוצי 200 µL פיפטה טיפים. נסה לא לנתק את שכבת אנדותל. הסר 100 µL (~ 50% המדגם) לניתוח פנוטיפי צאצאי hematopoietic על ידי FACS.
    2. להעביר את צלחת V-התחתון 96-ובכן, צנטריפוגה ב g 300 x למשך 2 דקות הצניפה התאים. להסיר את התקשורת על ידי מצליף מדיה לצלחת עם תנועה מהירה יחיד ואילו הצלחת היא הפוכה (קפיצי צלחת).
    3. מניחים את התאים µL 100 שנותרו בצלחת 96-ובכן המקורי בשימוש incubatorfor 37 ° C ב וזמינותו engraftment עוקבות (שלב 6).
  2. דגירה התאים עם נוגדנים המתאימים לניתוח hematopoietic.
    1. מחדש להשעות את כדורי תא כל טוב של 96-ובכן V-תחתון עם 50 µL של PBS/2% FBS המכילה בלוק ה-FcR µg/מ"ל, 1 µg/mL דאפי. דגירה את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    2. להוסיף 50 µL של PBS/2% FBS המכילה 10 בלוק ה-FcR של µg/mL, שילוב נוגדן לניתוח HSC המכיל PE-Cyanine7-מצומדת אנטי-VE-קדהרין, PerCP מצומדת אנטי-CD45, אנטי-EPCR מצומדת PE, anti-Sca1 מצומדת APC ו anti-Gr1 FITC מצומדת ו אנטי-F4/80 (כל נוגדן-מטריים דילול הסופי אלא אם צוין אחרת מבוסס על ההמלצות של היצרן או לפי titrations). דגירה את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות.
  3. הסר נוגדן לא מאוגד עם רציפים דילולים ולנתח את התאים.
    1. להוסיף 200 µL/טוב PBS/2% FBS, צנטריפוגה 300 גרם x למשך 2 דקות הצניפה התאים. לאחר מכן, קפיצי הצלחת למחוק את תגובת שיקוע, להוסיף 200 µL PBS/2% FBS כל גלולה תא, צנטריפוגה ב g x 300 למשך 2 דקות הצניפה תאים.
    2. קפיצי צלחת כדי למחוק את תגובת שיקוע והוסף 50 µL/טוב PBS/2% FBS לניתוח. להמשיך לנתח את התאים על ידי FACS באמצעות cytometer של זרימה מצויד בקורא צלחת.
      הערה: לרכוש נפח קבוע של תאים (למשל, µL 35 של µL 50 הכולל המשמש re-השעיה) למנות תת-קבוצות צאצאי hematopoietic.
  4. לנתח את הנתונים FACS עבור כל טוב המכיל שהצאצא hematopoietic מסך עבור המושבות המכילות HSC פוטנציאליים (איור 3).
    1. שער ראשון עבור האוכלוסייה חיובי CD45 שלילי עבור סמני מיאלואידית Gr1 ו- F480. שער לא לצאת תאים המבטאים עדיין רמות נמוכות של VE-קדהרין. התאים מהשכבה AGM-EC הם שיבשו במשך הקציר של המושבות hematopoietic הן VE-קדהרין חיובי CD45 שלילי.
    2. שער CD45+VE-Cad- / נמוךGr1 תאים F4/80– –בהמשך המשנה המבטאים רמות גבוהות של EPCR ו- Sca1 (איור 3 א -C).
      הערה: במחקרים קודמים, מושבות חסר תאים עם CD45+VE-Cad- / נמוךGr1–F4/80–Sca1שלוםEPCRשלום פנוטיפ (איור 3D) reproducibly לא הצליח להעניק לזיהוי multilineage דם היקפיים engraftment עכברים הנמען לקרינה17 (נתונים לא מוצג); לפיכך, מושבות אלו צריכים להיכלל לא בניתוח השתלת עוקבות בשלב 6.

6. ניתוח של המאפיינים Engraftment של שיבוטים בודדים, קורלציה עם מאפיינים פנוטיפי הובהר על-ידי מיון אינדקס

  1. ביום (אם הדבר אפשרי) או בבוקר שלאחר הניתוח פנוטיפי בשלב 5, הושעו מחדש את התאים µL 100 שנותרו מן כל 96-ובכן המכיל hematopoietic מושבות בעקבות תרבות משותפת (מתוך שלב 5.1) נמרצת pipetting באמצעות טיפ פיפטה 200 µL.
  2. להכין ולהוסיף הצלה תאים ממח העצם שלם של זן congenic B6. SJL-PtprcPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) עכברים בוגרים16,17.
    1. לספור תאים במח העצם nucleated בתמיסה הטורקים תחת hemocytometer. לדלל ריכוז של 5 x 105 nucleated תאים למ"ל ב- PBS עם 2% FBS.
    2. להוסיף 100 µL של תאים במח העצם הצלה (5 x 104) כל טוב המכיל רומא hematopoietic לניתוח השתלת ומערבבים על ידי pipetting.
  3. השתלות צאצא. של שיבוטים בודדים לתוך זן יחיד congenic הנמען לקרינה אולם B6. SJL-PtprcPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) למבוגרים בעכבר.
    1. אולם להאיר את אותו מספר של עכברים B6 CD45.1 מספר שיבוטים בנפרד להזריק צאצא. של שיבוט יחיד (באמצעות 1,000 cGy ממקור צסיום)...
    2. צייר 200 ההשעיה בתא סכום של µL, (כולל תאים שיבוט, כמו גם 5 x 104 B6 CD45.1 הצלה תאים במח העצם) לתוך מזרק אינסולין ½ mL עם מחט ½ אינץ ' 29 גרם.
    3. אולם להאיר B6 CD45.1 נמענים למבוגרים 2-24 שעות לפני הזרקת...
    4. באמצעות restrainer של העכבר פלסטיק המאפשרת גישה הזנב, להזריק דרך וריד הזנב 200 µL האחסון המכיל תאים כל המשובטים והן 5 x 104 B6 CD45.1 תאים במח העצם למבוגרים הצלה כדי לסייע לנמען הישרדות.
    5. אוזניים תג ו שוקל העכברים הנמען, ותראה את בריאותם/המשקל במרווחי זמן קבועים (למשל, 3 - 4 פעמים / שבוע להציב הקרנה/השתלת, או לפי בודדים מוסדיים נהלי) כדי להבטיח בריאות טובה.
  4. בצע ניתוח של דם היקפיים engraftment במרווחי זמן קבועים (למשל, 2, 16, 24 שבועות) בעקבות השתלת.
    1. הסר 50-100 µL של דם דרך רטרו-מסלולית הבליד או שיטה אחרת של לתת דם אתית שאושרו.
    2. להוסיף 3 מ"ל פירוק מאגר (16.6 גר' NH4קלרנית, דור 2 NaHCO3 ו- 74.4 mg EDTA 2 L H2O) לדם, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צנטריפוגה 300 x g עבור 5 דק וביופסיה מחדש להשעות גלולה עם 2 מ"ל PBS/2% FBS. צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות.
    3. מחדש להשעות את גלולה עם 150 µL PBS/2% FBS המכילה 10 µg/mL ה-FcR בלוק, µg 1/mL דאפי, לוותר על 1/3 של אמצעי האחסון טוב המכיל 50 µL isotype פקדים עבור התורם ואת שושלת היוחסין, 1/3 נוגדן 50 µL טוב המכיל פקדים התורם ואת isotype על שושלת היוחסין , ו- 1/3 לבאר, המכיל נוגדנים µL 50 לזהות התורם והן השושלת.
      הערה: נוגדנים לצורך זיהוי של multilineage engraftment: APCeFluor780 מצומדת anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-מצומדת anti-CD45.1, FITC מצומדת אנטי CD3, מצומדת PE אנטי-F4/80, PerCP מצומדת אנטי-Gr1, ו- anti מצומדת APC-CD19, או פקדים isotype רלוונטיים.
    4. לזהות שיבוטים עם engraftment לטווח ארוך על-ידי הערכת תרומת דם היקפיים מאת FACS לאורך זמן של CD45.2 (תורם)-נגזר hematopoietic תאים כדי מיאלואידית (Gr1 ו/או F4/80 חיובי), B-cell (CD19 חיובי), ו- T-cell (CD3 חיובי) (איור 4A -B).
      הערה: Hematopoietic engraftment יכול גם להיות מנותח על ידי CD45.2 (תורם)-נגזר התרומה לאוכלוסיות hematopoietic רקמות שנקטפו מח העצם, הטחול, בלוטת התימוס, הצפק, או בעקבות השתלת משני תאי מח עצם לתוך עכברים B6 CD45.1 לנתח מאפיינים טורי engraftment17.
  5. לצורך תיאום מאפייני של שיבוט כל פנוטיפי כפי שנקבע על-ידי אינדקס תא בודד הראשונית במיון עם תכונותיו engraftment. באמצעות תוכנת ניתוח תזרים, להעלות פרמטרים מיון עבור כל תא האינדקס ממוין (בקורלציה 96-ובכן שאליו זה מוינה). מפת הנתונים פונקציונלי על חלקות זרימה כדי להעריך את המאפיינים פנוטיפי של תאים בודדים בזיקה תפוקתן פונקציונלי (לדוגמה, לטווח ארוך, multilineage engraftment) (איור 4C).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1A מראה סכימטי של הנבחנים. פעם אחת P-Sp/AGM רקמות הם גזור, איחדו ולאחר הפומבית של collagenase, הם מוכתמים נוגדנים VE-קדהרין, EPCR למיון אינדקס. Pre-מועדון הכדורגל מונפלייה מועשרים בתאים ממוינים VE-קדהרין+EPCRגבוהה (איור 1B). נוגדנים fluorochrome מצומדת אחרים יכולים להיכלל לנתח retrospectively פרמטרים פנוטיפי נוספים, אשר נרשמות עבור כל תא במהלך מיון אינדקס. בניסוי זה נציג מ E11 AGM, התאים מוכתמים גם אנטי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקר של מועדון הכדורגל מונפלייה בראשית במהלך התפתחות עובריים מחייבת אמצעי לגילוי HSC פוטנציאל מבשרי hemogenic עדיין חסר את היכולת לספק הכינון hematopoietic multilineage לטווח ארוך ב המושתלים נמענים למבוגרים. פרוטוקול זה, אנו מציגים וזמינותו המשובטים של סימנים מקדימים hemogenic עובריים מאת סטרומה תרבות משותפת על כלי הדם נישה ECs מ ומזכיר האסיפה, התומכת ההבשלה של המבשרות על מועדון הכדורגל מונפלייה, עם אנליזה פונקציונלית הבאים במבחני השתלת. התאגדות של אינדקס מיון היתרים ניתוח רטרוספקטיבי של פרמטרים פנוטיפי לאפיין את המאפיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות אנדרו ברגר, סטייסי Dozono, בריאן Raden פרד האצ'ינסון Flow Cytometry הליבה לקבלת סיוע עם FACS. עבודה זו נתמכה על ידי המענק נבחרת מוסדות של בריאות NHLBI UO1 #HL100395, נלווים-שיתופי גרנט #HL099997, NIDDK הענק #RC2DK114777. ברנדון Hadland נתמך על ידי אלכס של לימונדה לעמוד קרן ותקווה יונדאי על בסיס גלגלים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>AGM-EC אמצעי תרבית
<חזק>חומרים לתרבית תאי אנדותל
TrypLE ExpressGibco12605-028השתמש כדי להפריד את ג'לטין חד-שכבתי AGM-EC
0.1% במיםStemCell Technologies7903השתמש כדי להדביק שכבות חד-שכבתיות AGM-EC לפלסטיק
צלחות תרבית רקמות 96 בארותקורנינג3599השתמש לתרבית משותפת של שכבות חד-שכבתיות AGM-EC ושיבוטים ממויינים באינדקס
Sulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco14190-144השתמש לדיסקציה וצביעה של FACS
500 מ"ל בקבוקי סינוןפישר סיינטיפיק9741202השתמש לסינון סטרילי מדיה אנדותלית
<חזקה>AGM-EC (500 מ"ל)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco12440-053400 מ"ל
Hyclone Fetal Bovine SerumFisher ScientificSH30088.03100 מ"ל
פניצילין סטרפטומיציןGibco15140-1225 מ"ל
הפריןסיגמאH314950 מ"ג מומס ב-10 מ"ל מדיה
L-גלוטמין (200 מ"מ)StemCell Technologies71005 מ"ל
אנדותל מיטוגן (ECGS)Alfa AesarJ64516 (BT-203)הוסף 10 מ"ל מדיה להמסה והוסיף
<חזק>חומרים לאינדקס AGM מיון
קולגנאז (0.25%)StemCell Technologies7902שימוש לדיסוציאציה של רקמות עובריות
מזרק 3 מ"לBD Biosciences309657השתמש בתמיסות נוגדנים לסינון סטרילי עבור FACS
0.22 ומיקרו; מסנן מונע מזרקM MilliporeSLGP033RSהשתמש לתמיסות נוגדנים מסננות סטריליות עבור
צינור פוליסטירן FACS 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאיםקורנינג352235השתמש להסרת גושי תאים לפני FACS
DAPI (מוכן כמלאי של 1 מ"ג/מ"ל ב-H2O)Millipore268298השתמש כדי לא לכלול תאים מתים ממיון
נגד עכבר CD16/CD32 (בלוק FCR)BD Biosciences553141השתמש כדי לחסום צביעה לא ספציפית לקולטני Fc
<חזק>נוגדנים לאינדקס AGM מיון
אנטי עכבר CD144 PE-Cyanine7eBioscience25-1441-82חולדה מכתים
IgG1 kappa בקרת איזוטיפ, PE-Cyanine7eBioscience25-4301-81בקרת איזוטיפ עבור CD144 PE-Cyanine7
נגד עכבר CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710eBioscience46-2012-80מכתים
חולדה IgG2b kappa בקרת איזוטיפ, PerCP-eFlour710eBioscience46-4031-80בקרת איזוטיפ עבור CD201 PerCP-eFluor710
נגד עכבר CD41 PEBD Biosciences558040חולדה מכתים
IgG1 kappa בקרת איזוטיפ, PEBD Biosciences553925בקרת איזוטיפ עבור CD41 PE
נגד עכבר CD45 FITCeBioscience11-0451-85Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITCeBioscience11-4031-81בקרת איזוטיפ עבור CD45 FITC
AGM-serum ללא מדיה (10mls)
X-Vivo 20Lonza04-448Q10 מ"ל
גורם תאי גזע רקומביננטי של עכברים (SCF)Peprotech250-0310 מ"ל (100 מ"ג/מ"ל ציר) ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל
רקומביננטי FLT3 ליגנד אנושי (FLT3L)פפרוטק300-1910 מ"ל (100 מ"ג/מ"ל ציר) ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל
תרומבופויטין אנושי רקומביננטי (TPO)פרוטק300-182 מ"ל (100 מ"ג/מ"ל ציר) ריכוז סופי 20 ננוגרם/מ"ל
אינטרלוקין עכברי רקומביננטי-3 (IL3)פפרוטק213-132 מ"ל (מלאי 100 מ"ג/מ"ל) ריכוז סופי 20 ננוגרם/מ"ל
<חזק>חומרים לצביעה של תאים בתרבית משותפת
96 צלחת באר, V-bottomCorning3894שימוש לניתוח FACS
<חזק>נוגדנים לניתוח שיבוטים ממויינים באינדקס בתרבית משותפת עם תאי אנדותל
אנטי עכבר CD45 PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-0451-82מכתים
חולדה IgG2b kappa בקרת איזוטיפ, PE-Cyanine5.5eBioscience35-4031-80בקרת איזוטיפ עבור CD45 PerCP-Cyanine5.5
נגד עכבר CD201 (EPCR) PEeBioscience12-2012-82מכתים
חולדה IgG2b kappa בקרת איזוטיפ, PEeBioscience12-4031-81בקרת איזוטיפ עבור CD201 PE
נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1) APCeBioscience17-5981-83
צביעת חולדה IgG2a kappa בקרת איזוטיפ, APCeBioscience17-4321-81בקרת איזוטיפ עבור Ly-6A/E APC
ANTI-MOUSE F4/80 FITCeBioscience11-4801-81צביעת
חולדה IgG2a kappa בקרת איזוטיפ, FITCeBioscience11-4321-41בקרת איזוטיפ עבור F4/80 FITC
נגד עכבר Ly-6G/C (Gr1) FITCBD Biosciences553127Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITCBD Biosciences556923בקרת איזוטיפ עבור Ly-6G/C ו-CD3 FITC
חומרים להזרקת וריד זנב להשתלה
1/2 מ"ל מזרקי אינסולין עם מחטים 29G 1/2 אינץ'Biosciences309306 שימוש להזרקת וריד זנב להשתלה
<חזק>נוגדנים לניתוח דם היקפי בעקבות טרנסלנט
אנטי עכבר Ly-6G/C (Gr1) PerCPBiolegend108426צביעת
חולדה IgG2b kappa בקרת איזוטיפ, PerCPBiolegend400629בקרת איזוטיפ עבור Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PEeBioscience12-4801-82צביעה
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PEeBioscience12-4321-80בקרת איזוטיפ עבור F4/80 PE
נגד עכבר CD3 FITCBD Biosciences555274מכתים
נגד עכבר CD19 APCBD Biosciences550992מכתים
חולדה IgG2a kappa בקרת איזוטיפ, APCBD Biosciences553932בקרת איזוטיפ עבור CD19 APC
נגד עכבר CD45.1 (A20) PE-Cyanine7eBioscience25-0453-82חולדה מכתים
IgG2a kappa בקרת איזוטיפ, PE-Cyanine7eBioscience25-4321-81בקרת איזוטיפ עבור CD45.1 PE-Cyanine7
נגד עכבר CD45.2 (104) APC-eFluor780eBioscience47-0454-82מכתים
חולדה IgG2a kappa בקרת איזוטיפ, APC-eFluor780eBioscience47-4321-80בקרת איזוטיפ עבור CD45.2 APC-eFluor780
<חזק>ציוד
BD FACSAria II עם תוכנת DIVABD Biosciences
BD FACSCanto II עם קורא צלחותBD Biosciences
HaemocytometerFisher ScientificS17040לספירת תאים
פיפטה רב ערוציתפישר סיינטיפיק14-559-417עבור תאי חלוקה
תוכנת ניתוח FACSFlowJo / BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
BD

מקורות

  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  3. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
  4. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  5. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
  6. Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
  7. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  8. Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
  9. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  10. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  11. Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
  12. Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
  13. Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
  14. Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
  15. Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
  16. Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
  17. Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
  18. Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  19. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
  20. Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
  22. Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
  23. Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156(2009).
  24. Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
  25. Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
  26. Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
  27. Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
  28. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

AGMC
ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.