אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לזהות ביטוי בו זמנית של סמנים תאי לוקמיה בתאי לוקמיה מיאלואידית חריפה הראשי על-ידי cytometry זרימה. אנו מראים כיצד ניתן לכמת שלוש אוכלוסיות קדמון, אוכלוסיה ה-LSC בשם עם הגדלת מידת ההבשלה. אנחנו אישרו הנוכחות של אוכלוסיות אלה ב המתאים לחולה-נגזר-xenografts.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.
במאמר זה
סיכום
תקציר
לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) היא הטרוגנית, ואם אינו מטופל, מחלה קטלנית. . זה הגורם הנפוץ ביותר של סרטן הדם-הקשורים לתמותה אצל מבוגרים. בתחילה, AML היא מחלה של תאי גזע hematopoietic (HSC) המאופיינת מעצרו של בידול, עוקבות הצטברות תאים לוקמיה הפיצוץ, מופחתת ייצור של אלמנטים hematopoietic תפקודית. הטרוגניות משתרע על נוכחות של תאי גזע לוקמיה (ה-LSC), עם תא דינמי זה תא מתפתח כדי להתגבר על לחצים שונים לבחירה שהוטלו על במהלך התקדמות לוקמיה וטיפול. לשם הגדרה נוספת של האוכלוסייה ה-LSC, התוספת של CD90 ו- CD45RA מאפשר את האפליה של HSCs נורמלי, אבות multipotent בתוך תא תאי CD34 + CD38. כאן, אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול כדי לזהות ביטוי בו זמנית של מספר סמני ה-LSC בשם (CD34, CD38, CD45RA, CD90) בתאי הפיצוץ העיקרי של AML האנושית על ידי cytometry זרימה multiparametric. יתר על כן, אנו מראים כיצד ניתן לכמת שלוש אוכלוסיות קדמון, אוכלוסיה ה-LSC בשם עם הגדלת מידת ההבשלה. אנחנו אישרו הנוכחות של אוכלוסיות אלה ב המתאים לחולה-נגזר-xenografts. שיטה זו של זיהוי, כימות של ה-LSC בשם עשוי לשמש לצורך מעקב קליני של כימותרפיה תגובה (כלומר., מחלה שיורית מינימלית), כמו ה-LSC שיורית עלול לגרום AML relapse.
מבוא
לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) הוא הגורם הנפוץ ביותר של לוקמיה-הקשורים לתמותה. בתחילה, AML היא מחלה המשובטים של תאי גזע hematopoietic (HSC) המאופיינת מעצרו של בידול, עוקבות הצטברות תאים הפיצוץ, מופחתת ייצור של אלמנטים hematopoietic תפקודית. לאחרונה, הטרוגניות המשובטים של האוכלוסייה תא הפיצוץ הוקם בעיקרו באמצעות אסטרטגיות רצפי (הגדרות) ' הדור הבא ' ו מציג את קיומו של אינטרה-המשובטים התפתחות גידול תאים1.
הטרוגניות משתרע על הנוכחות של תאי גזע לוקמיה (ה-LSC). זה המשוערות זה את התא תא דינאמית מתפתחת כדי להתגבר על לחצים בחירה שונות שנכפו במהלך התקדמות לוקמיה וטיפול. לכן ה-LSC אמורים להיות עמידים בפני משטרי כימותרפיות הנוכחי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אנו עוקבים אחר תקנים אירופיים עבור השימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות. מחקר זה אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית (#3097-2015120414583482v3).
1. הכנת הדוגמא
- לאסוף מח עצם (2 מ"ל) דה נובו AML צינורות המכיל חומצה ethylenediaminetetraacetic קרישה (EDTA)-ריכוז של 1.8 מ ג מ של מח העצם.
- לבצע הפרדה Ficoll, פרידה הדרגתי צפיפות בידוד תאי תאי תאי דם אדומים, גרנולוציטים, כדלהלן. לדלל מח 3 כרכים של פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS: NaCl 137 מ מ, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, נה2HPO4 10 מ מ, ח'2PO4 מ מ 1.8). בזהירות כשכבת-על נפח 1 של Ficoll עם נפח 1 של מח העצם מדולל. ספין 30 דקות ב g x 300 ללא בלם. העבר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן אנו מציגים שיטה לקביעת קדמון אוכלוסיות דגימות מח העצם נורמלי וממאירים אנושי. אנחנו שנאסף של מח העצם, הטחול, ממ"ח מוצלחת וביצע cytometry זרימה multiparametric כמתואר לעיל. אנחנו לעומת מספר subpopulations של תאים הפיצוץ בין המדגם המטופל אבחון לבין את PDX המתאימים במיוחד, תא CD34 + CD38-קדמון, ובייחוד מועשר בשם ה-LSC. מצאנו כי השבר CD34 + CD38-הפיצוץ היה גבוה ב PDX לעומת הדגימה המטופל אבחון (3.48% לעומת 0.53%, איור 2C, יח). מעניין, נמצא אחוז גבוה יותר של ה-LSC בשם (הצגה של .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הערכה מדויקת, לשחזור של הממברנה או סמני cytoplasmic מאת cytometry זרימה דורש כי כלי הגדרות אימות כל יום עבור יישור אופטי, ראוי תפקוד של מערכת fluidic, רגישות אופטי, סטנדרטיזציה באמצעות כיול חרוזים.
זיהוי של אוכלוסיות תאים הפיצוץ ב- AML באמצעות CD90 ו- CD45RA על-ידי ניתוח cytometry זרימה רב פרמטרית היא שיטה יחסית פשוטה ואמינה. שלב קריטי ניתוח זה הוא הערכה מדויקת של הביטוי CD38 על הפיצוץ תאים, על מנת לבצע gating הנכון של האוכלוסייה CD34 + CD38. עוצמת CD38 מוגדרת באמצעות תאים במח העצם נורמלי במיו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הצרפתי האגודה לורט Fugain, סרטן le LigueContre (צפון מרכז), Fondation דה פראנס (ועדת לוקמיה), SIRIC Oncolille, מכון הסרטן הלאומי הצרפתי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis Solution A: 8.29 גרם NH4Cl + 0.037 גרם Na2EDTA ב-100 מ"ל של תמיסת H2O סטרילית ותמיסת RBC Lysis B: 1 גרם של KHCO3 ב-100 מ"ל של H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγ קנול (NSG) עכברים | מעבדת ג'קסון | מס' מלאי: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS מאגר ריצה – מאגר הפרדה MACS | מאגר MACS Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (שיבוט FA6-152, Iotest) | בקמן קולטר | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (שיבוט D3HL60.251, Iotest) | בקמן קולטר | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (שיבוט 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (שיבוט J3-119, Iotest) | בקמן קולטר | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (שיבוט 581, Iotest) | בקמן קולטר | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (שיבוט HI100) | בקטון דיקינסון | 560674 | |
| אנטי-CD38-פסיפיק כחול (שיבוט LSI98-4-3, Iotest) | בקמן קולטר | B92396 | |
| אנטי-CD45-KO (שיבוט J.33, Iotest) | בקמן קולטר | B36294 | |
| אנטי-CD3-PE | בקמן קולטר | IM1451 | |
| אנטי-CD20-PE | בקמן קולטר | A07747 | |
| אנטי-CD123-PC7 | בקמן קולטר | B13647 | |
| סט זרימה | בקמן קולטר | A63492 | |
| בדיקת זרימה | בקמן קולטר | A63493 | |
| נאוויוס | בקמן קולטר | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| ערכת בחירת PE אנושי EasySep טכנולוגיות | תאי גזע | 18000 | |
| EasySep מגנט | טכנולוגיות תאי גזע | 18551 |
מקורות
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
