מאמר שיטה

הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש

DOI:

10.3791/57040

⸱

10 במאי 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Natural Sciences, School of Arts & Sciences, Lebanese American University, 3Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים הוראות צעד אחר צעד ל: 1) ביעילות מהנדס מעיים אורגנואידים באמצעות ננו חלקיקים מגנטיים עבור התמרה-או כפוף, ו, 2) ליצור קטעים קפואים מן הנדסה ארגונית. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לשנות ביעילות ביטוי גנים באורגנואידים לחקירת השפעות במורד הזרם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבויות מעיים מספק הזדמנות ייחודית לחקור את תא גזע המעיים וביולוגיה קריפטה בתחום החוץ, למרות שגישות יעילות לתמרן ביטוי גנים באורגנואידים עשו התקדמות מוגבלת בזירה זו. בעוד CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מאפשרת עריכת הגנום מדויק של תאים לדור אורגנואיד, אסטרטגיה זו דורשת בחירה נרחבת והקרנה על ידי ניתוח רצף, אשר הוא גם זמן רב ויקר. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לצורך התמרה ויראלית יעילה של אורגנואידים מעיים. גישה זו מהירה ויעילה מאוד, ובכך מפחית את הזמן ואת ההוצאות הטמונות בטכנולוגיית CRISPR/Cas9. אנו מציגים גם פרוטוקול כדי ליצור קטעים קפואים מן התרבויות אורגנואיד שלמים לניתוח נוסף עם אימונוהיסטוכימיה או אימונוofluorggogtgggg, אשר יכול לשמש כדי לאשר ביטוי גנים או השתקה. לאחר התמרה מוצלחת של וקטורים ויראליות עבור ביטוי גנים או השתקה מושגת, תא גזע המעיים פונקציה קריפטה ניתן להעריך במהירות. למרות מחקרים אורגנואיד ביותר להעסיק בחוץ מבחנה, אורגנואידים יכול גם להיות מועברת עכברים עבור ניתוחים פונקציונליים vivo. יתר על כן, הגישות שלנו הם יתרון לניבוי תגובות טיפוליות לתרופות, כי כיום הטיפולים הזמינים בדרך כלל פונקציה על ידי ביטוי גנים מודולים או פונקציה חלבון ולא שינוי הגנום.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת לעכבר התרבות או האדם קריפטים תאים כתלת מימדי (3D) אורגנואידים מן המעיים או המעי הגס על פני תקופות זמן ממושך סיפק פריצת דרך גדולה כי תרבויות אלה להציג תכונות הגדרת אפיתל המעי ב vivo מיכל בן , מיכל השני , 3. אורגנואידים נגזר הקריפטטים הראשוניים מסוגלים לחידוש עצמי וארגון עצמי, המציגות פונקציות סלולריות דומה לרקמות המקור שלהם. אכן, אורגנואידים לאחר מכן לא רק את הארגון המבני של קריפטים בvivo, אלא גם תכונות מולקולריות רבות, ובכך לספק כלים שימושיים כדי ללמוד ביולוגיה נורמלית מדינות המחלה. כדי להמחיש, מחקרים אורגנואיד חשפו מסלולים מולקולריים מעורבים התחדשות רקמות1,2,3,4,5 כמו גם תרופות שיכולות לשפר את הפונקציה בהגדרות הפתולוגיים6,7.

המחקר של תאי גזע מעיים הוא עניין מיוחד, כי רירית המעיים היא בין רקמות המרגליות הגבוהה ביותר, חידוש עצמו כל 3-5 ימים כדי להגן על האורגניזם מפני חיידקים, רעלים, ופתוגנים אחרים בתוך ה מעיים לומן. תאי גזע מעיים (iscs) אחראים ליכולת הרגנרציה המדהימה הזאת ובכך לספק פרדיגמה ייחודית ללימוד הפונקציה של תא גזע מבוגרים1,2. השושלת-מעקב ניסויים בעכברים הפגינו כי מבודדים Lgr5-חיוביים בתאי גזע יכול להיות מתורבת כדי ליצור אורגנואידים 3D או ' מיני מעיים ' בתוך מבחנה אשר הם מקרוב מראה שלהם ב vivo עמיתיהם. תרבויות אורגנואיד יכול גם להיות נגזר של תא מעיים קריפטה מבודד מורכב של ושלתי, ISCs, ו Paneth תאים, האחרון אשר מהווים את התאים נישה אפיתל ב vivo. למעשה, תרבות אורגאידית מתאי המעי הראשי בקריפטה התפתחה לתוך טכניקה שגרתית יחסית קל ליישם ברוב המעבדות באמצעות ריאגנטים זמין נרחב. מודל זה הוא גם מקלה לניתוח כמותי של ביטוי גנים על ידי rna-רצף (rna-Seq) וחלבונים על ידי ספקטרומטר המסה, אימונוהיסטוכימיה, או אימונולואוורסטילהכתמים2,4,8. בנוסף, גנטיקה פונקציונלית ניתן ללמוד באמצעות רווח (ביטוי או הבעה גנים של הפעלת גן מוטציה) או אובדן של פונקציה (גנים השתקה או ביטוי של מוטציה אובדן פונקציה) גישות2.

חשוב מכך, יעילות נמוכה ורעילות גבוהה של דנ א סטנדרטי או פרוטוקולים של התמרה ויראלית עם polybrene להישאר משוכה גדולה בתחום. למרות CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מאפשרת עריכת הגנום מדויק, גישה זו דורשת בחירה גוזלת זמן ואחריו אימות רצף9. כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגיפי התמרה עבור אורגנואידים המעי הראשי הממוטב מסירה של חלקיקים ויראלי על ידי הקונקטוחלקיקים מגנטיים ויישום של שדה מגנטי. שינויי מפתח לפרוטוקולים קודמים4,5,10, 11,12,13 והמלצות כדי לשפר את היעילות מסופקים. אנו מתארים גם גישה ליצור קטעים קפואים מן האורגנואידים שלמים תרבותי ב-3D מטריצות (המכונה מעתה מטריקס קרום המרתף מטריצה או מטריצה) לניתוח נוסף עם אימונוהיסטוכימיה או אימונוofor, כתמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה אושר על ידי המוסדות הרפואיים של ג'ונס הופקינס בעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC). פרוטוקול זה משתנה משיטות שפורסמו בעבר10,11,12,13.

1. הכנת ריאגנטים

  1. הכינו 293T מדיום טרי מספר שעות מראש וחמים 37 ° c באמבט מים לפחות 10 דקות לפני השימוש (שולחן 1).
  2. הכינו את הדנ א הפלסטי2,13,14 לאריזה נגיפית. (שולחן 2).
  3. לרכוש את כל החומריםהנדרשים האחרים (טבלת חומרים).

2. הפקת וירוס או בייצור חלקיקים רטרו

  1. כליה העובר האנושי (HEK) 293T שזריעת תאים (יום 1)
    1. הכנת 1 150 מ"מ צלחת תרבות על ידי ציפוי עם 50 μg/mL פולי-ליזין מומס פוספט מתכלה באגירה (PBS; 10 מ ל/מנה) עבור 1 h בטמפרטורת החדר (RT).
    2. הסר את תמיסת המלח באגירה (PBS)/Polyt-d-יזין ושטוף את הצלחת מצופה פעמיים עם 5 מ"ל PBS.
    3. 293T תאים הזרע (8 \ u201210 x 106) ב 293t בינונית (טבלה 1) לנפח כולל של 15 מ ל.
    4. 293T התרבות תאים לילה בחממה רגילה תרבות רקמה (37 ° c, 5% CO2).
  2. ה293t תאים של HEK (היום השני)
    1. ביצוע החצייה פעם תאים הגיעו 70-80% המפגש (בדרך כלל כ 24 שעות לאחר זריעה 8 \ u201210 x 106 תאים).
    2. הכנת תערובת הזיהום באמצעות גישה יעילה כגון ליפופי מסחרי הניסוח (שולחנות 1 \ u20122, לוח חומרים)2.
      1. לדלל את מבנה ה-DNA בונה וירוס12 (סך הכל ~ 24 μg בינוני dna, שולחן 2) ב 1.2 ml של מדיום החוצה ו דגירה עבור 5 דקות ב RT ב 1.5 Ml צינורות (לוח חומרים).
      2. לדלל את העוצר מעצר (36 μL) ב 1.2 מ ל של בינונית (טבלת חומרים) ו-דגירה של 5-ml צינורות עבור 5 דקות על פי הוראות היצרן.
      3. להוסיף את מגיב הנגיף (שלב 2.2.2.1) כדי מגיב החצייה (שלב 2.2.2.2) ולערבב בעדינות על ידי ליטוף איטי למעלה ולמטה באמצעות 5 מ"ל pipetting.
      4. מודקון את התערובת עבור 20 דקות ב RT.
    3. לשטוף בעדינות את התאים 293T עם 5 מ ל של מדיום החצייה ולהחליף עם 10 מ ל של מדיום החצייה.
    4. הוסף את ה-DNA-ליפיד מתחמי (משלב 2.2.2.3) dropwise למדיום של תאים 293T ובזהירות לערבב את המדיה במנות התרבות על ידי הזזת כיוונים אופקיים ואנכיים כדי להבטיח הפצה שווה של DNA-השומנים מתחמי בכל מנה.
    5. דגירה של 6 h בחממה סטנדרטית לתרבות רקמות (37 ° c, 5% CO2).
    6. לאחר דגירה, להחליף את המדיה עם 20 מ"ל וירוסים טריים איסוף בינוני (שולחן 1).
  3. אוסף וירוסים (ימים 3 \ u20125)
    1. איסוף מדיה וירוס בצינורות 50 mL, ולאחסן במקרר 4 ° c לריכוז נוסף.
    2. החלף 20 מ ל של וירוס טרי איסוף בינונית כל 24 h ותרבות לילה (~ 24 h). חזור על אוסף המדיה ביומיים הבאים (ימים 4 \ u20125).
    3. ודא כי הנפח הכולל של בינוני שנאסף לאחר יום 5 הוא ~ 60 mL (20 מ"ל/day x 3 ימים).
  4. ריכוז וירוס (יום 5)
    1. צנטריפוגה את המדיה שנאספו (60 mL) עבור 5 דקות ב 400 x g. ואז, להעביר את supernatant דרך מסנן (0.45 יקרומטר נקבוביות) כדי להסיר את כל הפסולת התאית.
  5. רכז את הוירוס על-ידי הוספת 15 מ ל של מדיית וירוסים מסוננת ביחידת סינון צנטריפוגלי (רשימת חומרים). צנטריפוגה ב 2,500 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. מכיוון שהוירוס אינו יכול לעבור דרך מסנן זה, הוא יהיה מרוכז בחדר העליון של המסנן.
    1. משפל את הזרימה-דרך מן הצינור (החדר התחתון) ולהוסיף עוד 15 מ ל של מדיה הנותרים ויראלי אוסף המדיה לאותו יחידת הסינון צנטריפוגלי. צנטריפוגה לעיל (2,500 x g עבור 15 דקות ב -4 ° c) כדי לרכז וירוס נוסף מתוך הסופרנטאנט.
    2. חזור על התהליך באמצעות אותו מסנן עבור 60 mL מלוחית התמרה אחת עד לקבלת הריכוז הרצוי (~ 100-קיפול).
      הערה: אנחנו בדרך כלל להתרכז ~ 60 mL של מדיה אוסף וירוסים כדי ~ 600 μL.
    3. הסר את הווירוס מרוכז מהתא העליון של המסנן באמצעות 1 mL pipet, ולאחר מכן סדרת מחלקים ו לאחסן בצינורות 1.5 mL (50 \ u201260 μl/tube) ב-80 ° צ' לשימוש מאוחר יותר. אחסן חלקיקים מרוכזים עבור עד 6 \ u201212 חודשים.

3. בידוד קריפטטים

  1. המתת חסד של עכברים באמצעות CO2 על פי הנחיות IACUC מקומיות.
  2. מניחים את החיה המרדמים על גבו ורוחצים את הבטן על ידי ריסוס עם 70% אתנול.
  3. לבצע חתך באמצע קו האורך מעצם החזה אל המפשעה, לצמצם את העור הראשון, ולאחר מכן את הרקמה התת עורית.
  4. להסיר את המעי הדק מהבטן אל cecum.
  5. זיהוי אזורי עניין במעי הדק; הקריפטטים יכולים להיות מבודדים מן התריסריון, מעי ו ileum.
  6. באמצעות מזרק 10 מ ל, ריקון המעי הדק מבודד עם מאגר דיסוציאציה קריפטה (מקורר לפני הערוץ המכיל 1 מילימטר dithio, (DTT), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (לא Ca2 + ו-Mg2 +)) במנה 10 ס מ רקמות רקמה (שולחן 1משנה לשעה
  7. הסר את רקמת השומן ההיקפית, ופתח או "פילה" את רקמת המעי longitudinally על צלחת זכוכית סטרילית (15 ס"מ x 15 ס מ).
  8. מגרדים בעדינות את המעי האפיתל מעיים באמצעות מגרד התא.
  9. חותכים את המעי הדק לתוך 2 \ u20123 ס מ חלקים מחוכמת אורך.
  10. העבר את הרקמה לצינור 15 מ"ל המכיל PBS מקורר באמצעות מלקחיים שטוחים (116 מ"מ). לשטוף את שברי הרקמה על ידי טלטול נמרצות ביד עבור ~ 30 s (הזזת הצינור בכיוונים מנוגדים ~ 60 פעמים).
  11. תרענן את הערוץ הPBS ותחזור. עד שערוץ ההתרמה יתבהר
    הערה: אנחנו בדרך כלל לשטוף את השברים 2 \ u20123 פעמים.
  12. מודטת את הרקמה בתוך 15 מ"ל שפופרת חרוטי המכיל 10 מ ל של מאגר דיסוציאציה קריפטה (טבלה 1) עבור 10 דקות ב 4 ° c על שייקר מסלולית במהירות בינונית פעם ה-PBS ברורה.
  13. במרץ לנער את הצינור ביד עבור ~ 30 s (הכיוונים הפוכים ≈ 60 פעמים) ולהעביר את הרקמה באמצעות מלקחיים שטוח למשנהו 15 מ ל שפופרת חרוט מכיל 10 מ ל של מאגר דיסוציאציה קריפטה. . מחלק את השבר על הקרח אין להשתמש בשבר הראשון עבור תרבות ארגונית מאחר שהוא מכיל בעיקר villi.
  14. חזור על שלבים 3.11 \ u 20123.13 עבור 3 \ u20124 פעמים, איסוף כל שבריר והצבת אותם על קרח.
  15. בחר את השבר המועשיר עם האחוז הגבוה ביותר של הקריפטטים מעיים על-ידי סריקת הדגימות של 200 μL מכל שבריר תחת מיקרוסקופ הפוך (4x). זיהוי הקריפטטים לפי מורפולוגיה טיפוסית כפי שמתואר בעבר (איור 1A)10.
    הערה: הם יופיעו כעגולים או אובליים בצורה ויכילו תאי Paneth מגורען. לעומת זאת, villi הם מבנים כמו אצבע חסר תאים Paneth הגרגירים (איור 1B).
  16. להעביר את השבר שנבחר באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר כדי לקבל קריפטטים בגודל דומה אם נדרש. לחילופין, בודד Lgr5 + בתאי גזע מבוסס על הזרימה cy try עבור חלבון פלורסנט ירוק (GFP) אם עכברים מצטלבים על הרקע EGFP-Lgr5 + או מודל אחר מתאים המאפשר זיהוי של Lgr5 + תאים2.
  17. ספור את המספר הכולל של הקריפטטים בשבר שנבחר כדלקמן.
    1. פיפטה 50 μL של השבר הנבחר לתוך היפוך ולספור את מספר הקריפטטים באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך (4x). מקום ~ 100 מקריפטטים גם כאשר משתמשים בצלחת 48-באר כדי לאפשר את הניסויים התמרה שבהם 3 \ u20126 בארות יהיו ממותמרים לכל מצב ניסיוני עבור גנים השתקה או הבעות יתר.
    2. בהתבסס על מספר הקריפטטים ל50 μL, חשב את נפח מאגר הדיסוציאציה הקריפטה הדרוש והעבר את אמצעי האחסון לתוך שפופרת 1.5 mL.
      הערה: לדוגמה, 10 הקריפטטים לכל 50 μL נספרים, 6 x 50 μL או 300 μL דרושים עבור 300 הקריפטטים.
  18. צנטריפוגה את הקריפטטים בצינורות 1.5-mL ב 300 x g עבור 5 דקות.
  19. בזהירות להיפטר supernatant על ידי ליטוף בעדינות את שכבת הנוזל העליון ולהשעות מחדש את הגלולה ב 100 μL של גורם גדילה מופחתת מטריקס קרום המרתף על הקרח (לוח חומרים).
  20. הזרע המכיל מטריקס המכילים הקריפטטים לתוך 37 ° c מראש מחומם 48-באר צלחת (30 μL/ובכן, ~ 100 קריפטטים/ובכן). מודטת הצלחת בחממה סטנדרטית לתרבות רקמות עבור 5 \ u201215 min כדי לאפשר gelation מטריצה (37 ° c, 5% CO2).
  21. כיסוי כל ג'ל עם 250 μL תרבות ארגונית (ENR) בינונית (שולחן 1) ומניחים את הצלחות 48-היטב בחזרה לתוך חממה רגילה תרבות רקמה (37 ° c, 5% CO2). בדוק את התרבויות עבור ארגון קריפטה לתוך צורות קטנות, עגולות, פיברוזיס לאחר 24 שעות; ניצנים יהיה ליצור לאחר 2 \ u20125 ימים.
  22. החלף בעדינות את מדיית ENR כל 3 ימים. הסר מדיית ENR ישנה עם יניקה עדינה, טיפול לא לגעת במטריצה בעת החלפת מדיה.
  23. המעבר תרבויות אורגאיד כל 4 \ u20127 ימים כפי שתוארו בעבר11.

4. הכנה לקטע אורגאיד

  1. העבר אורגנואידים ברגע שהם מטפסים (בתוך 1 \ u20122 שבועות) או לאחר היותו מיושן. עבור ניסוי בודד התמרה, להכין 2 \ u20123 בארות של אורגנואידים תרבותית בצלחת 48-באר לכל תנאי עם ~ 100 \ u2012200 אורגנואידים/טוב או ~ 200 \ u2012600 אורגנואידים לכל מצב ניסיוני.
  2. Exchange ENR עם 250 μL התמרה מדיה (טבלה 1) ותרבות בתקשורת התמרה עבור 3 ימים או יותר או עד האורגנואידים לאמץ מורפולוגיה פיברוזיס. כלול הן Wnt3a והן מעכבי סלע (Y27632) במדיום התמרה כדי להגדיל את מספר התאים גבעול ו Paneth; ניטינאמיד (Nic) משפר את יעילות התרבות (ראה התמרה בינונית בטבלה 1).
  3. שבר מכני את הכיפה כמו מטריצת ממברנה מבנה המרתף עם מדיה טיפ מלטף באמצעות 1 mL pipet.
  4. העבר את האורגנואידים והמדיה לצינור 1.5 mL סטרילי.
  5. מכנית לשבש את המטריצה עוד יותר על ידי ליטוף עם 200 μL pipetting ~ 10 \ u201215 פעמים.
  6. צנטריפוגה את שברי אורגנואיד ב-RT ב 500 x g עבור 5 דקות.
  7. השמט את הסופרנטנט בזהירות באמצעות פיפטה והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל/F12 בינונית (שולחן 1).
  8. הוסף Dispase I (6 μL ב 10 מ"ג/mL) ו DNase I (2.5 μL ב 10 מ"ג/mL). מערבבים היטב על ידי ליטוף בעדינות באמצעות 1 mL pipetting.
  9. מארגני הדגירה ב 37 ° c עבור 20 דקות בצינור 1.5 mL.
  10. הוסף 500 μL של מדיית ENR כדי לסיים את תגובת הדיסוציאציה; הנסיוב באולם מסיים את התגובה.
  11. להעביר את התאים אורגאיד דרך מסננת תא 20 יקרומטר ו צנטריפוגה את שברי אורגאיד ב 400 x g עבור 5 דקות.
  12. השהה מחדש קטעים של אורגנואיד באמצעות התמרה בינונית-150 μL (טבלה 1).

5. הנדסה גנטית של אורגנואידים או תאים קריפטה על ידי התמרה ויראלית

הערה: ראה איור 2.

  1. אשכולות תא זרע אורגנואיד עם 200 μL התמרה בינונית/טוב בצלחת 48-באר ו דגירה בחממה רגילה תרבות רקמה (37 ° c, 5% CO2). לחילופין, המקום תאי קריפטה מבודדים טריים (~ 1,000 הקריפטטים) ב 200 μL התמרה בינונית/ובכן ב 48-באר צלחת ו דגירה בחממה רגילה תרבות רקמה (37 ° c, 5% CO2).
  2. הפשרת מבחנות של וירוסים עבור התמרה מאפשר ~ 50 μL של וירוס מרוכז עבור התמרה של כל באר ב 48-טוב צלחות או ~ 100 μL של וירוס מרוכז לכל טוב בצלחות 24-טוב.
  3. וירוס דגירה עם 12 μL של פתרון ננו-חלקיק מגנטי עבור 15 דקות ב-RT בצינור 1.5 mL (שולחן 3).
  4. הוסף את התמיסה ננו-חלקיק מגנטית/וירוס תערובת לתאים להיות התמרה.
  5. מניחים את לוח התרבות התא על צלחת מגנטית, מודקת לפחות 2 h (עד ~ 6 h) בחממה סטנדרטית לתרבות רקמות (37 ° c, 5% CO2).

6. זריעה של קטעים מזוהמים באורגאיד

  1. העבר את אשכולות התאים הנגועים והתמרה מדיה מכל באר לתוך צינור 1.5 mL.
  2. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות.
  3. השמט את הסופרנטאנט עם יניקה עדינה וצנן את הצינורית המכילה את הגלולה על הקרח במשך 5 דקות.
  4. הוסף 120 μL של מטריקס קרום המרתף והשהה מחדש את הגלולה על ידי ליטוף לאט למעלה ולמטה.
  5. זרעים 30 μL של תערובת תא מטריצה לצלחת חדשה 48-טוב.
  6. מודקת את הצלחת ב 37 ° צ' עבור 5 \ u201215 min עד המטריצה מתקשה.
  7. הוסף התמרה בינונית לכל טוב ו מודטת בחממה רגילה תרבות רקמה עבור 3 \ u20124 ימים (37 ° צ', 5% CO2).
  8. לאחר 3 \ u20124 ימים, לבחון תרבויות תחת מיקרוסקופ אור (10x) כדי להבטיח ארגון אשכולות תאים למבנים אורגאיד. לאחר מכן, החלף בעדינות את מדיית התמרה באמצעות מדיום 250 μL ENR.
  9. החלף את המדיה כל 3 \ u20124 ימים.

7. בחירה (אם רלוונטי)

  1. לאחר 2 \ u20123 ימים, להוסיף אנטיביוטיקה רלוונטיים או הורמונים לבחירה למדיום התמרה במידת הצורך.
    הערה: השתמשנו puromycin (2 μg/mL) עבור בחירה של התמרה המאשיון מפני פלמידים הרעמג גן התנגדות puromycin2,14.

8. אישור התמרה מוצלחת וביטוי גנטי או השתקה

  1. אם באמצעות fugw וירוס2,14, הערכת התמרה יעילות על ידי מדידת אותות gfp באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט או הזרימה cy, לנסות.
  2. אימות הבעות יתר של גנים או השתקה באמצעות היפוך כמותי הטרנסקריפטאז תגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR) עבור השוואה כמותית של mRNA בשליטה ותרביות אורגאיד ניסיוני.
  3. אשר רמות חלבונים לביטוי גנים בקידוד חלבונים או להשתקה על-ידי אבן החשופה המערבית או כתמי החיסוני2.

9. אורגנואיד קריודור במרתף ממברנה מטריצות

הערה: ראה איור 3.

  1. להסיר בינונית ENR על ידי יניקה עדינה, להיזהר לא לperturb את מטריקס קרום המרתף בעדינות לשטוף פעם אחת עם 500 μL של PBS.
  2. תקן אורגנואידים עם 1.0 mL של 4% פאראפורמלדהיד (טבלת חומרים) ב RT עבור 30 דקות.
  3. הסירו את הערוץ הראשון בשאיבה ושטפו בעדינות פעמיים עם 1 מ ל PBS.
  4. הסר את ה-PBS על ידי יניקה והוסף 1.0 mL של 30% מאגר סוכרוז לכל מדגם. מודרת אורגנואידים קבוע בסוכרוז עבור 1 h ב 4 ° c בחדר קר, מקרר, או על קרח כדי ליטול דגימות מימה.
  5. להסיר מאגר סוכות על ידי יניקה ולהוסיף רק תרכובת הטבעה מספיק (טבלת חומרים) כדי לכסות את שכבת מטריצה (~ 300 μl/טוב) בכל באר.
  6. דגירה ב RT עבור 5 דקות.
  7. מניחים דגימות במקפיא של 80 ° c במשך 10 דקות, או עד שמתחם ההטבעה הופך למוצק ולבן.
  8. מניחים את הצלחת עם מתחם הטבעה קפואה ב-RT כדי לאפשר התכה מינימלית של התרכובת לאורך הקצוות. השתמש באזמל כדי להפריד את הבלוק מקירות הבאר.
  9. הסר את מטריצה הטבעה בלוק מתחם באמצעות מלקחיים ולמקם אותו בבלוק דגימה (למשל cryomold), עבודה במהירות כדי למנוע התכה.
  10. ממלאים את העובש לחלוטין עם מתחם הטבעה ולהקפיא ב-80 ° c עבור 30 דקות.
  11. השימוש בבלוק הוא עבור החסימה או אחסון ב-80 ° c מקפיא לשימוש נוסף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים טכניקת התמרה מהירה ויעילה מאוד אשר מרתמות חלקיקים מגנטיים חשופים לשדה מגנטי כדי לספק הנגיף לתאי הריבית. עם כלים זמינים, יש לנו להחיל את הגישה הזאת לא רק כדי לשנות את התאים המבודדים מבודדים בלבד (איור 1A), אלא גם עבור אורגנואידים (איור 2) ותאים אחרים, כי הם עקשן כדי התמרה שגרתית יותר גישות. חלקיקים לנטינגיליים יכולים להיות בקלות מעלה באוב חלקיקים מגנטיים ואת הווירוס-ננו-חלקיק מכלולי מועברים ביעילות על ידי החלת שדה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התרבות העיקרית של אפיתל המעי הבוגר כמו אורגנואידים מספק כלי רב עוצמה כדי ללמוד מנגנונים מולקולריים מעורב בתפקוד תא גזע, הומאוסטזיס אפיתל המעי, ו פתולוגיה1,2,3, ד. למרות CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה יכולה לשמש מהנדס גנטית אורגנואידים9, זה מוגבל על ידי הצורך הקרנה נרחבת ובחירה מבוסס על ניתוח רצף עבור שינויים גנטיים הרצוי. המטרה של פרוטוקול זה היא לספק הוראות ברורות ותמציתי עם ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מן המכון הלאומי לבריאות (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), מרילנד תא גזע מחקר קרן (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), האגודה האמריקנית לריאות, רשת הבריאות של אלגני-ג'ונס הופקינס קרן מחקר ומחלות העיכול הופקינס מחקר בסיסי ליבה המחקר מרכז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMThermo Fisher Scientific11965092מדיום בסיס לתאי 293T
DMEM/F12+Thermo Fisher Scientific12634010מדיום בסיס למדיום תרבית אורגנואידים ומאגר עיכול אורגנואיד
OPTI-MEMThermo Fisher Scientific11058021Virus פלסמידים מדיום טרנספקציה
סרום בקר עובריקורנינג35-011-CVרכיב של מדיום איסוף וירוסים ומדיום 293T
עט/סטרפטוקוקוסתרמו פישר 15140122מדעי רכיב של מדיום תרבית אורגנואידים ומאגר דיסוציאציה של קריפטה
PBS (ללא Ca2+, Mg2+)ThermoFisher Scientific10010049מאגר כביסה ורכיב של מאגר דיסוציאציה של קריפטה
Mem-NEAAThermo Fisher Scientific11140050רכיב של מדיום תרבית אורגנואידים
GlutamaxIIThermo Fisher Scientific35050061רכיב של מדיום תרבית אורגנואידים
HEPESThermo Fisher Scientific15630080רכיב של מדיום תרבית אורגנואידים
EGFMillipore SigmaE9644מרכיב של מדיום תרבית אורגנואידים
NogginPeprotech250-38 Bרכיב של מדיום תרבית אורגנואידים
R-spondinR& D7150-RS-025/CFרכיב של מדיום תרבית אורגנואידים
אינסולין רקומביננטי אנושיMillipore SigmaI9278-5mlרכיב של מדיום תרבית אורגנואידים
ניקוטינמידMillipore SigmaN3376-100Gרכיב של מדיום התמרה
Wnt3AR& D5036-WN-010רכיב של מדיום התמרה
Y27632Millipore SigmaY0503-1MGרכיב של מדיום התמרה
0.5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020רכיב של מאגר דיסוציאציה של קריפטות
DTT (dithiothreitol)Thermo Fisher ScientificR0861רכיב של מאגר דיסוציאציה של קריפטות
Dispase IMillipore SigmaD4818-2MGרכיב של מאגר עיכול אורגנואידים
DNase IMillipore Sigma11284932001רכיב של מאגר עיכול אורגנואיד
מטריג'ל (גורם גדילה מופחת)Corning356231משמש כמטריצה להטמעת אורגנואידים
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Medium for transfection in viral
production ViralMag R/LOz BiosiencesRL40200חלקיקים מגנטיים של התמרה ויראלית
צלחת מגנטיתOz BiosiencesMF10000צלחת מגנטית כדי להקל על התמרה ויראלית
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Transfection Agent בייצור ויראלי
Poly-D-LysineMillipore SigmaA-003-Eציפוי לצלחות לפני זריעת תאי 293T
תמיסת פורמלדהיד 4%BosterAR1068פתרון לתיקון אורגנואידים
תרכובת הטמעה O.C.Tתרמו פישר סיינטיפיק4583Sלהטמעת האורגנואידים
5 מ"ל צינורות פוליסטירן פלקוןקורנינג352054
50 מ"ל צינורות פלקוןSarstedt62.547.100
אורביטרון מסובב II שייקר נדנדהBoekel Scientific260250
אולימפוס מיקרוסקופ הפוך CK30אולימפוסCK30לסריקה וספירת קריפטות
Zeiss Axiovert 200 פלואורסצנטי הפוךNikonAxiovert 200לצפייה בפלואורסצנטיות בקריפטה
יחידת מסנן צנטריפוגלי Amicon Ultra-15 עם ממברנה Ultracel-100Milipore SigmaUFC910024לריכוז וירוסים
pluriStrainer 20 ומיקרו; m (מסננת תאים)pluriSelectמק"ט 43-50020להכנת שברי אורגנואידים
מסננת תאי פלקוןפישר סיינטיפיק352340להכנת צירפטים בגודל דומה לאחר בידוד קריפטה
גריינר CELLSTAR  צלחות תרבית מולטיוול 48 בארות (TC מטופל במכסה)Millipore SigmaM8937-100EAForD2:D37+D16:D37g שברי אורגנואידים
זן בעלי חיים: C57BL/6JJackson Lab#000664לתרבית אורגנואידים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
  2. Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
  5. Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
  6. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  7. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
  8. Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
  9. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
  10. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765(2014).
  11. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
  12. Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
  13. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  14. Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
  15. Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
  16. Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים