מאמר שיטה

הערכה של תפקוד שלפוחית חוץ-תאית במהלך מלריה זיהום

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57067

⸱

14 בפברואר 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Fribourg

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקולים לחקור את התפקיד של שלפוחית חוץ-תאית (EVs) שפורסמו על ידי הפלזמודיום falciparum זיהום אריתרוציטים. בפרט, אנו מתמקדים האינטראקציות של EVs עם תאי אנדותל.

תקציר

מלריה היא מחלה מסכנת חיים הנגרמת על ידי טפילים הפלזמודיום , עם falciparum פ להיות הכי נפוצים ביבשת אפריקה, רוב מקרי מוות הקשורים מלריה ברחבי העולם. מספר גורמים, לרבות טפיל פחמיות רקמות בתפקוד כלי הדם, תגובות דלקתיות להשפיע על התפתחות המחלה אצל אנשים נגועים במלריה. פ falciparum-תאי דם אדומים (iRBCs) נגוע לשחרר שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EVs) המכילים סוגים שונים של מולקולות מטען המתווכות פתוגנזה ו סלולר תקשורת בין טפילים של המארח. EVs ביעילות שנלקחה על ידי תאים שבהם הם לווסת את תפקידם. כאן נדון אסטרטגיות כדי לטפל את התפקיד של EVs באינטראקציות טפיל-פונדקאי. ראשית, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור תיוג ומעקב EV הפנמה על-ידי תאי אנדותל, באמצעות צבע מקשר תא ירוק. שנית, מדווחים דרך פשוטה כדי למדוד את חדירות מעבר חד שכבתי תאי אנדותל באמצעות לתוספי שכותרתו fluorescently. לבסוף, אנו מראים כיצד לחקור את התפקיד של לא קידוד RNA מולקולות קטנות בתפקוד תאי אנדותל.

מבוא

על פי ארגון הבריאות העולמי, היו 212 מיליון מקרים חדשים של מלריה ברחבי העולם בשנת 2015, כ 429,000 אנשים מתו, בעיקר ילדים מתחת לגיל חמש שנים של גיל1. המנגנונים למחלות חמורות, אשר מזוהה לעתים קרובות עם חוסר תפקוד כלי הדם, נותר מעורפל2. הפלזמודיום- iRBCs מפרישים כדורים קטנים bi-השומנים קרום המכונה שלפוחית חוץ-תאית (EVs). זה ידוע כי אלה EVs שעשוי להיות רלוונטי לתהליך זיהום וכדי התגובה החיסונית מארח לזיהום; עם זאת, מעט מאוד ידוע על הפונקציה המדויק של אלה שלפוחית קטנה במהלך מלריה זיהום3. זה אפשרי כי הם משחקים שני תפקידים חשובים: מצד אחד, הם עשויים לתרום בפתוגנזה על ידי הפעלת מקרופאגים4,5; מצד שני, הם עשויים לתווך תקשורת סלולרית בין טפילים ובין טפילים מארח6,7. למעשה, טפילים יכולים להעביר חלבונים או חומצות גרעין בין אחד לשני דרך EVs. לדוגמה, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs יכול להעביר התקפה אלימה פקטור Serum Resistance-Associated (ההזמנות) ולאחר ניתן לייעד אריתרוציטים גם אחרים brucei טי וגם מארח8. יתר על כן, falciparum פ- iRBCs תקשורת בין אחד לשני על ידי העברת חומצות גרעין בתוך EVs. דבר זה מאפשר הטפילים למטב ולסנכרן את הצמיחה שלה. למעשה, EVs עשוי להיות הרגולטורים העיקריים של המרה gametocyte, לכן לתרום ברגולציה של שידור שלב7.

לא רק לעשות EVs לווסת הטפילים, הם גם לתווך טפיל-פונדקאי אינטראקציות. לאחרונה גילינו כי EVs מ iRBCs מכילים מארח-derived מיקרו Rna (miRNAs; מינים RNA קטנים בטווח של 21-25 נוקלאוטידים9) שנלקחו על ידי תאי אנדותל אדם. MiRNAs ב- EVs טופס אורווה מורכבים עם Ago2 (חבר של RNA-induced שתיקת מורכבים), אשר ברגע מועברת לתאי הנמען, הוא מסוגל במיוחד ביטוי גנים ואף להשפיע על מכשול מאפייני תאים10. פרוטוקולים סטנדרטיים פותחו כדי לחקור את הפונקציה של EVs. כאן, נתאר תחילה פרוטוקול המאפשר תיוג פלורסנט של EVs לחקור ספיגת שלהם על ידי תאים הנמען. בנוסף, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, אפשרי לעקוב אחר גורלם של EV בתוך התא. מספר צבעי פלורסנט יכול לשמש כדי לעקוב אחר EVs. לצבוע אמין-ריאקטיבי, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl אסתר (CFSE), Calcein-אם הופכים פלורסנט פעם אחת בתוך השלפוחיות המוגלתיות. אנחנו מעדיפים להשתמש בתווית amphiphilic, PKH, כי זה נותן אות אחיד יותר ויותר בהיר. גישה זו מספקת מידע חשוב להבין את האינטראקציות בין EVs ותאים הנמען. אמנם במקרים מסוימים EVs לאגד פני השטח של התאים, יש שלפוחית נלקחים במהירות. על תפיסה, EVs להעביר מטענים שלהם התאים, שבהם הם מפעילים את הפונקציות התקינה שלהם.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי למדוד את הפונקציה מכשול של ה תאי אנדותל במבחנה על ידי לכימות בהעברת לתוספי פלורסנט דרך טפט הסלולר. ניתן להשתמש המשדרים יותר רגישים כגון סמני radiolabeled. עם זאת, הם דורשים זהירות מיוחדת לשימוש. מבחני אחרים קיימים כדי למדוד את הפונקציה מכשול במבחנה כגון transendothelial ההתנגדות החשמלית (TEER), אשר מודד צמוד לצומת שלמות. סוף סוף להמחיש זואי-1, חלבון צמוד לצומת, על-ידי immunofluorescence מאפשרת הערכה של שלמות צומת חזק כמו גם10. מאז EVs הם ישויות הטרוגנית ומורכבת המכיל מספר מטענים עם פוטנציאל מאפיין רגולטוריות, זה שימושי כדי overexpress של RNA ספציפיים כדי לחקור את השפעתו על התא הנמען. לכן, אנחנו גם להגדיר פרוטוקול אשר מטרתה ליצור שורות תאים יציב לבטא את miRNA של ריבית10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

RBCs האנושי התקבלו מהדם של תורמים בריא, בהתאם להנחיות של Swissethics (swissethics.ch).

הערה: תרבויות טפיל falciparum פ (3D 7) ו- EV הייצור היו שתואר קודם לכן ב- Mbagwu, et al. 11 מכיוון falciparum פ פתוגניות, להתייעץ עם התקנות מקומיות לטיפול. התרבויות יש לשמור עקר את כל הזמן.

1. זריחה תיוג של EVs

הערה: ההליך הבא מנצל הטכנולוגיה תיוג stably לשלב צבע ירוק פלואורסצנטי (PKH67) עם זנבות אליפטיות גדול באזור השומנים של קרום EV. התגובה מתבצע ב- µL 200 הסופי מכתימה את אמצעי האחסון המכיל ריכוז סופי של 20 מיקרומטר של PKH67. לבצע את כל הצעדים בטמפרטורת החדר (20-25 ° C)

  1. המקום 100 µg של EVs ב 1 מ"ל של PBS צינור microcentrifuge.
  2. Centrifuge של EVs צינור microcentrifuge במהירות המרבית (20,000 x g) במשך 7 דקות כדי גלולה.
    הערה: מאחר הימוזוין נוכח EVs, גלולה חום אדום-כהה להתייחס. אם תגובת שיקוע אדמדם, ואז EVs יש lysed.
  3. לאחר צנטריפוגה, וארוקן את תגובת שיקוע בקפידה, על מנת למנוע הסרת כל EVs.
    הערה: למזער את כמות מתנה בעבר resuspending EVs בדו diluent על מנת להגדיל הפארמצבטית והיעילות של ההכתמה הנותרים מאגר.
  4. Resuspend בגדר EV ב 100 µL של diluent C (2 X ההשעיה EV), pipet בעדינות כדי להבטיח פיזור מלאה.
  5. הכן צינור microcentrifuge ולהוסיף 4 µL של הפתרון צבע ethanolic PKH67 µL 100 של diluent ג מערבולת טוב לערבב. להכין 2 x צבע פתרון זה (40 מיקרומטר) מייד לפני צביעת.
    הערה: כדי להימנע מכתים הטרוגנית, אל תוסיף הפתרון צבע ethanolic PKH67 ישירות בגדר EV.
  6. במהירות, משלבים את µL 100 של 2 X EV ההשעיה (שלב 1.4) µL 100 של 2 X צבע פתרון (שלב 1.5). לאחר מכן, מערבבים את הדגימה על-ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים.
  7. דגירה ההשעיה EV/צבע מהשלב 1.6 עבור 5 דקות מוגן מפני האור ואת תערובת מאת vortexing 3 - 4 פעמים במהלך 5 דקות.
    הערה: המקננת ההשעיה EV/צבע משכי זמן ארוכים יותר מספק אין יתרון, כי ההכתמה היא כה מהירה.
  8. עוצרים את התגובה צביעת על-ידי הוספת אמצעי שווה (200 µL) של נסיוב, תקופת דגירה של 1 דקות לאפשר קשירה של עודף צבע.
    הערה: לפני העצירה ההכתמה, לרוקן את הסרום של EVs על ידי צנטריפוגה-g x 20,000 עבור 20 דקות.
  9. לשטוף 3 פעמים עם PBS, ספין למטה ב- g 20,000 x עבור 5 דק Resuspend של EVs ב 100 µL ל- PBS להגיע ריכוז הסופי של µg 1/µL.

2. לדמיין את ספיגת של EVs מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית

הערה: פרוטוקול הבאים מתאר את המעקב אחר EV הפנמה על-ידי תאי אנדותל גדל על coverslips זכוכית דקה. תאי אנדותל הם תאי אנדותל מח עצם אדם למחצה immortalized כמתואר ב-12.

  1. עבודה בסביבה סטרילית, מעיל coverslips עם עודף של 0.01% פולי-L-ליזין 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  2. האחות הפתרון פולי-L-ליזין ולאפשר את coverslips להתייבש לגמרי.
  3. לבצע ספירת תאי אנדותל קיימא באמצעות Trypan blue הדרה של hemocytometer.
  4. העברת תאי אנדותל5 עונה 1 פרק 10 ב 1 מ"ל של שלמה אנדותל תא מדיום הגידול המכיל את שילוב תוספת coverslips זכוכית אקרילית-L-ליזין-מצופה ולתת את התאים לגדול טפט.
    הערה: המדיום מכיל חומרים שמאפשרים לתאים כדי ליצור טפט וכדי ליצור צמתי צר.
  5. ברגע התאים יוצרים של טפט, בזהירות תשאף המדיום ולהוסיף 1 מ"ל בינוני טריים לשטוף את התאים. חזור על לשטוף את פעם נוספת. הוסף µg 50 של EVs התווית על-ידי PKH67, דגירה במשך 4 שעות.
    הערה: כדי למצוא את נקודת-הזמן אופטימלי עבור ספיגת, זמן-קורס יכול להתבצע.
  6. לאחר 4 שעות, תשאף המדיום, לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS להסיר EVs עודף והלא מאוגדים. לתקן את התאים עם 3% paraformaldehyde פתרון PBS למשך 15 דקות.
    הערה: מתנול יכול לשבש אקטין במהלך תהליך קיבוע; לכן, עדיף להימנע כל מתנול המכיל כתות ומייצבים או כתות אחרות ממס מבוסס ומייצבים. מומלץ לשימוש ללא מתנול פורמלדהיד מקבע.
  7. לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS. להוסיף בזהירות 250 µL של 0.1% X-100 Triton ב- PBS כדי permeabilize את התאים. דגירה-RT במשך 5 דקות.
  8. לשטוף 3 פעמים עם PBS. להוסיף 400 µL מאגר חסימה (BSA 5% ב- PBS) במשך 30 דקות ב- RT לחסום את הכריכה לא ספציפית.
  9. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. הכן את הפתרון מכתימים על ידי המדללת 5 µL של הפתרון phalloidin מניות ב- BSA PBS/1% µL 200 לכל שובר כל כיסוי. Pipet 200 µL של הפתרון מכתימים על coverslip דגירה במשך 20 דקות ב- RT.
  10. לשטוף 3 פעמים עם PBS. Counterstain ה-DNA ל 30 s עם Hoechst 33342-ריכוז הסופי של µg/mL 2 ב- µL 200 ל- PBS.
  11. לשטוף 2 x coverslip על-ידי הוספת µL 400 ל- PBS. בזהירות לתפוס את coverslip עם מלקחיים, היפוך זה על ירידה של antifade הרכבה מדיה על משטח זכוכית. מסיר בעדינות את המדיה עודף עם רקמה, חותם בכל צד עם לק.
  12. לאחסן את השקופיות מוגן מפני האור ב 4 º C.
  13. דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר excitations 405, 488, 543 nm ו 63 X, המטרה שמן נה 1.3 עם פליטת פלורסנט-450-470 nm (כחול), 505-530 ננומטר (ירוק), 620 ננומטר.
    הערה: תוצאות צביעת F טיפוסי-אקטין מוצגות באיור1.

3. חדירות תא אנדותל

הערה: תא אנדותל חדירות מוערך על ידי מדידת ההעברה של rhodamine B isothiocyanate-לתוספי (70,000 MW הממוצע) מעבר חד שכבתי תאי אנדותל. לתוספי מספק כלי מצוין ללמוד חדירות כלי דם.

  1. ספירת תאי אנדותל קיימא באמצעות הדרה Trypan blue 0.4% ו- hemocytometer.
  2. צלחת תאי אנדותל-צפיפות של 0.6 x5 10, לתאים הנהרות תרביות רקמה 24-ובכן מוסיף (0.4 µm גודל הנקבוביות) ואת השאר ללא הפרעה במשך לפחות 5 ימים ליצור monolayers הבדיל. רענן המדיום בכל יום שני.
  3. ברגע התאים להגיע עם טפט, לטעון את EVs (50 µg ב 1 מ"ל) על התא העליון. הוסף את rhodamine-לתוספי הבאר העליון-ריכוז סופי של 20 מ"ג/מ"ל. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2.
  4. לפקח על העברת לתוספי פלורסנט לתחתית היטב על ידי מדידת פליטת קרינה פלואורסצנטית מ 40 µL aliquots בינונית. להגדיר את הקורא מרובה-תוויות microplate 544 עירור nm ו 590 פליטה nm למדידות.
    הערה: מכמות לתוספי כשמאירים ניתן לכמת באמצעות עקומות כיול נוסדה עם הפתרון מניות. בנוסף, ניסויים קינטי יכולה להתבצע על-ידי הסרת דגימות קטנות של המדיום קאמרית החיצוני במהלך הזמן (איור 2). אפילו ללא כל טיפול, לתוספי מפוזרת באמצעות טפט התא.

4. לקבוע רגישות Puromycin

הערה: לפני transducing את שורות תאים עם lentivirus, חשוב לקבוע העקומה kill של תרופה שנבחרה עבור הקו לתא מסוים זה. כדי לקבוע את הכמות המינימלית של ריכוז התרופה הכרחי להרוג את כל התאים, לבצע ניסוי תגובה מינון באמצעות מינונים מצטברים של הסם הנבחר. כי כל שורה בתרבית של תאים יש רגישות שונה, לפני ניסויים, ריכוז אופטימלי של האנטיביוטיקה צריך להיקבע על ידי פיתוח להרוג עקומת טיטרציה כפי שיפורט להלן.

  1. לספור את התאים באמצעות את hemocytometer. Resuspend תאי אנדותל-ריכוז של עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל מלאה אנדותל תא מדיום הגידול המכיל את התמהיל תוספת.
  2. צלחת עונה 1 פרק 104 תאים לתוך צלחת 96-ובכן באמצעי אחסון הסופי של 100 µL של המדיום צמיחת תאי אנדותל.
  3. להוסיף 100 µL של המדיום המכיל את האנטיביוטיקה בריכוז של 0.1-10 µg/mL (ראה איור 3).
  4. לבחון את הכדאיות תא כל יומיים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות מטרה X 20. התרבות התאים במשך 10-14 ימים ולהחליף שהמדיה המכילה puromycin כל 2-3 ימים בהתאם צמיחת תאים.
  5. להוסיף 10 µL/טוב MTS ריאגנט לבאר כל, מיקס, ולאחר תקופת דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים סטנדרטיים תרבות.
  6. לנער את הצלחת בקצרה על מטרף ולמדוד את ספיגת תאים טיפול ללא טיפול שימוש בקורא צלחת 490 nm (איור 3).

5. התמרה חושית של תאי אנדותל עם וקטור Lentiviral

  1. צלחת עונה 1 פרק 10 תאי אנדותל5 ב 1 מ"ל של מדיום מלאה ביום שלפני התמרה חושית. לבצע התמרה חושית כאשר התאים הגיעו 50-80% confluency.
  2. להפשיר את lentivirus על הקרח, ולעשות aliquots של המניות ויראלי להימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה. ספין למטה החומר ב 200 x g עבור 30 s, צינורות לפני פתיחת להימנע לשפוך מעל.
  3. להוסיף hexadimethrine ברומיד התאים-ריכוז סופי של 8 µg/mL.
    הערה: Hexadimethrine ברומיד מסייע את היעילות התמרה חושית, אולם במקרים מסוימים זה יכול להיות רעיל לתאים. לכן, ריכוז אופטימלי צריך להיקבע על-ידי ביצוע עיקול הרג לפני התמרה חושית.
  4. מערבולת את הצלחת בעדינות כדי לערבב. להוסיף את הכמות המתאימה של נגיפים (בין 0.5-2 x 106 חלקיקים)-ריבוי מתאים לזיהום (MOI) ו מערבולת את הצלחת בעדינות ב-30 s לערבב.
  5. Centrifuge את המיקס חלקיק תא-נגיפים בצנטריפוגה ב RT למשך 45 דקות ב- g 300 x כדי להגביר את היעילות התמרה חושית. דגירה התערובת חלקיק תא-נגיפים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  6. הסר בזהירות המדיום המכיל חלקיקים נגיפיים וזורקים כראוי. להחליף אותו טרי, מראש ומחוממת בינוני תרבות שלמה.
  7. להפעיל את הבחירה עם puromycin ביום השני: להסיר את המדיום ולהחליפו בינוני טריים המכילים את הריכוז הנכון של puromycin כפי שנקבע בעבר בסעיף 4 (איור 3).
  8. קציר תאים לאחר הבחירה puromycin, לבודד RNA באמצעות של RNA לבודד ערכת ההוראות של היצרן.
  9. לבצע סינתזה cDNA עם הנבחר miRNAs באמצעות תיעוד הפוכה קיט (ראה את הטבלה של חומרים).
  10. להגדיר את התגובה qPCR לפי פרוטוקול מצוטט13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים לחקור את האינטראקציות של EVs עם התאים המארחים. ספיגת של EVs fluorescently שכותרתו נמצא בפיקוח מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1). תאי אנדותל תופסים ביעילות EVs, אולם ניתן למטב את זמן הדגירה עם EVs כדי לעקוב אחר תפיסה. עבור לוקליזציה טוב יותר של EVs בתוך התאים, כתם אקטין עם phalloidin. בשלב הבא, אנו משתמשים קרום מסנן ובנוסף צומח טפט של תאי אנדותל. Rhodamine B isothiocyanate-לתוספי מוחל על התא העליון של קרום מסנן, ואז החדירות של טפט א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כמה טפילים, לרבות Toxoplasma, Trypanosoma, לישמניה Trichomonas לעורר על שחרורו של EVs התא המארח נגועים. בהתאם פתוגנים, EVs שפורסמו ניתן לווסת את התגובה החיסונית מארח או לתווך תקשורת סלולרית בין טפילים6. ובכל זאת, יש מעט עדויות רומז כיצד אלה שלפוחית קטנה לתרום מחלת המלריה. . הנה, שתיארנו במספר דרכים כדי לחקור את הפונקציה של EVs במהלך זיהום הפלזמודיום . למשל, תפיסה של EVs על ידי תאים הנמען ויוו ניתן לנטר ביעילות על ידי תיוג אותם עם תיוג הפלורסנט PKH67. מספר פקדים חייב להתבצע כדי לה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה מבחינה כלכלית נתמך בחלקה על ידי קרן נוברטיס רפואי - ואת המחקר הביולוגי (כדי פים), של גוטפריד, יוליה Bangerter-Rhyner-Stiftung (ל MW, פים) של הבריכה מחקר של האוניברסיטה של פריבורג (כדי פים). מענקים נוספים כוללים המלגות מצוינות הממשלה השוויצרית עבור חוקרים זרים (כדי KAB ו- SM). אנו מודים איזבל Fellay, הס Kharoubi סולנג לקבלת תמיכה טכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PKH67 ירוק פלואורסצנטי תא מקשר מיני ערכתסיגמא-אולדריץ'MINI67-1KT
מדלל Cסיגמא-אולדריץ'G8278
פולי-L-ליזיןסיגמא-אולדריץ'P8920
PBSThermoFisher - Gibco10010023
פלואידין CF594ביוטיום#00045
Hoechst 33342ThermoFisherH3570
ProLong זהב אנטיפייד הרכבהThermoFisherP36934
רודמין B isothiocyanate– DextranThermoFisherR9379-250MG
הכנס עם קרום PET בז שקוף  לצלחת 24 בארותפלקון353095
צמיחת תאי אנדותל  בינוני MVPromocellC-22020
Puromycin dihydrochlorideSigma-AldrichP9620-10ML
MTS התפשטות תאים ערכת בדיקה קולורימטריתBiovisionK300-500
hexadimethrine bromideSigma-Aldrich107689-10G
MISSION  Lenti microRNA, Human has-miR-451aSigma-AldrichHLMIR0583
MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, בקרה שלילית 1 חלקיקי התמרהסיגמא-אולדריץ'NCLMIR001
MISSION  Lenti microRNA, HumanSigma-AldrichNCLMIR0001
Leica TCS SP5Leica Microsystems
miRNeasy mini KitQiagen217004
TaqMan MicroRNA ערכת שעתוק הפוך 1000 תגובותThermoFisher4366597
has-mir-451a  RT/750 PCR rxnsThermoFisher001141
U6 snRNAThermoFisher001973
TaqMan Universal Master Mix II, עם UNGThermoFisher4440038
StepOnePlus מערכת PCR בזמן אמתThermoFisher4376600

מקורות

  1. WHO. WHO Malaria Report 2015. , (2015).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
  4. Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744(2010).
  5. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
  6. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
  7. Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
  8. Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
  9. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  10. Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727(2016).
  11. Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
  12. Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
  13. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
  14. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  15. French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
  16. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  17. Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
  18. Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021(2010).
  19. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PKH67RNAPCR

מאמרים קשורים