שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחזור תאי תלת-ממד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח
במאמר זה
סיכום
תקציר
במהלך זיהום פתוגניים של דרוזופילה melanogaster, hemocytes יש תפקיד חשוב בתגובה החיסונית לאורך כל הזיהום. לכן, המטרה של פרוטוקול זה היא לפתח שיטה כדי להמחיש את פלישת פתוגן בתא החיסון הספציפי של זבובים, כלומר hemocytes. באמצעות השיטה המוצגת כאן, עד 3 × 106 hemocytes בשידור חי ניתן להשיג 200 דרוזופילה 3rd לחלל הזחלים 30 דקות לשעבר vivo זיהום. לחלופין, hemocytes יכולים להיות נגועים ויוו באמצעות הזרקה של 3rd לחלל הזחלים ואחריו hemocyte החילוץ עד 24 שעות לאחר הפגיעה. אלו תאים נגועים הראשי היה קבוע, צבעונית, עם תמונה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר מכן, ייצוגים תלת-ממד נוצרו מן התמונות להראות באופן מוחלט לפלישה הפתוגן. בנוסף, ה-RNA באיכות גבוהה עבור לרביעיית-PCR ניתן להשיג איתור של פתוגן mRNA הבאים לזיהום, ולא מספיק חלבון יכול להיות מופק תאים אלה לניתוח תספיג חלבון. יחדיו אנו מציגים שיטה התאמת מובהק של פלישת פתוגן ואישור של זיהום באמצעות סוגי הפתוגן בקטריאליים וויראליים שיטה יעילה לחילוץ hemocyte כדי להשיג מספיק hemocytes בשידור חי של דרוזופילה הזחלים לניסויים זיהום ex-vivo ו ויוו .
מבוא
דרוזופילה melanogaster הוא אורגניזם מודל ומבוססת המחקר של מולדת חסינות1. במהלך התגובה החיסונית מולדת, hemocytes יש תפקיד חשוב בתגובה לאתגר הפתוגן. Hemocytes הם קריטיים עבור לבצע טפילים, כמו גם יש תפקיד חשוב במאבק נגד המחלה דרך פעולה phagocytic במהלך זיהום פטרייתי, ויראלי, חיידקי2,3.
על מנת להבין בצורה הטובה ביותר של המחשב המארח תגובה חיסונית מולדת לזיהום חיידקים פתוגניים, חשוב להמחיש איך הפתוגן חודר התאים המארחים במהלך זיהום. הדמיה זו תורמת להבנת המנגנון של פלישה. יחד עם הפרטים של פתוגן לוקליזציה תאיים ואת התגובה התאית, נתונים אלה יכולים לספק רמזים ע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. זיהום ex-vivo
- בינוני וציוד
- תחת תנאים סטריליים, להכין טרי דרוזופילה Hemocyte בידוד בינוני (DHIM) הכוללת של 75% שניידר דרוזופילה בינוני עם 25% סרום שור עוברית (FBS) ומסנן לחטא זה.
- שכבה 2-3 חתיכות של 10 ס"מ על 10 ס"מ הסרט פרפין תחת stereomicroscope.
- הכינו את נימי זכוכית. הגדר את החימום פולר נימי 55% לכל היותר. משוך את צינור קפילרי כדי ליצור קצה חד של-10 מיקרומטר.
- מילוי נימי עם שמן מינרלי.
- להרכיב צינור קפילרי מלא על גבי nanoinjector (איור 1א') ופתח צינור קפילרי מאוחה עצה על ידי שבירת את קצהו עם מלקחיים (איור 1
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לחיות לאסוף hemocytes vivo לשעבר זיהום, 3 × 106 hemocytes היו מופק 200 דרוזופילה 3rd לחלל הזחלים. כדי לפתח את השיטה שלנו, נעשה ניסיון מספר טכניקות שונות. דיסקציה זחל בודדים ינצל עד 1.5 שעות, ממוצע של ~ 8000 תאים התקבלו באמצעות זו שיטה18, אשר רובם לא היו בחיים עד סוף אוסף. בשלב הבא, ניסינו להוציא hemolymph, אשר הכיל את hemocytes, מ- 20 רימות-זמן באמצעות צינור קפילרי זכוכית19, אך נימי את הפך נסתם לציפורן.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי להבין טוב יותר איך נדבקים התאים המארחים, חשוב להבהיר הלוקליזציה של פתוגן בתאים, במיוחד כאשר ערך ניסויים על הפתוגן נבדק בעבר ותא סוג שילובים4. בעוד לומד את המפל תגובת תאי בעקבות זיהום יכול להצביע על פלישת פתוגן פרודוקטיבי, השילוב של נתוני ההיענות הדמיה וסלולריות חיוני כדי להדגים לפלישה הפתוגן ולדלקת. בעוד דוחות מציג תמונות דו-ממד של פתוגן הפלישה לתוך התאים מארח נוטה להצביע על זיהום פרודוקטיבי, כמה שאלות עשויים להישאר לגבי העיתוי של פלישת פתוגן הראשונית בתוך התאים המארחים. לפיכך, דגמי תלת-ממד של.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
אנחנו אסירי תודה ד ר רוברט Heinzen על מתן מניות של ביטוי mCherry Coxiella burnetii. אנו מודים ד ר לואיס טיישיירה על מתן וירוס ססגוני הגעה 6 מרכז מניות בלומינגטון מתן מניות לעוף. פרויקט זה מומן בחלקו על ידי NIH מענק R00 AI106963 (A.G.G.) ואת אוניברסיטת מדינת וושינגטון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שניידר Drosophila בינוני | תרמו פישר סיינטיפיק (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| סרום בקר עוברי | GE Healthcare Life Sciences (הייקלון) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| מסנן (0.22 ומיקרו; L) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| מסננת (100 ומיקרו; מ) | גריינר ביו-וואן | 542000 | 1.2.1), 2) |
| מיקרוסקופ סטריאו | אמסקופ | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| נימי זכוכית | פישר סיינטיפיק | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| חולץ נימי | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| שמן מינרלי | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| מלקחיים | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery מכשיר Genesee | Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| טריפן כחול | תרמו פישר סיינטיפיק (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| המוציטומטר | האוסר סיינטיפיק | 3100 | 1.3) |
| 24 צלחת | באר גריינר ביו-וואן | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii - mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila צלחות מיץ פירות | פרוטוקולי קולד ספרינג הארבור | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| 2.1.1.2) | |||
| תרכיז קפוא של מיץ ענבים 100% וולש, 340 מ"ל | אמזון | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| צלחות פטרי, 10 x 35 מ"מ | פישר סיינטיפיק | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| זכוכית כיסוי מיקרוסקופ | פישר סיינטיפיק | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| שמרים, אופים מיובשים פעילים | MP ביומדיקל | 0210140001 | 2.1) הוסף 2 חלקי מים ל 1 חלק שמרים (v/v) |
| מחט טונגסטן | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| מלקחיים אחיזה | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| סרום בקר אלבומין | פישר סיינטיפיק | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| מדיום הרכבה נגד דהייה | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| מיקרוסופ קונפוקלי | Leica | TCS SP8-X מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי אור לבן | 3.2) |
| תוכנת שחזור הדמיה תלת מימדית | Leica | LASX עם מודול | הדמיה תלת מימדית3.3) |
| שקופיות מיקרוסקופ | פישר סיינטיפיק | 12-552-3 | 3.1.6) |
| וירוס ססגוני חסר חוליות 6 (IIV6) | ד"ר Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC strain | : 10403S | 4) ליסטריה מונוציטוגנס זן 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) גדל במרק Difco Brain-heart Infusion (BHI) (BD Biosciences) המכיל 50 ומיקרו; גרם/מ"ל סטרפטומיצין ב-30 מעלות צלזיוס. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)18068015 | ערכת סינתזת cDNA פירוק gDNA | |
| Bio-Rad | 1708891 | סינתזת cDNA | |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R | |
| IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd | ||
| SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | ||
| SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | ||
| SYBR מגיב qRT-PCR ירוק | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| מערכת PCR בזמן אמת | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| נוגדן אנטי-ליסטריה מונוציטוגנס | abcam | ab35132 | כתם מערבי |
| נוגדן נגד אקטין המיוצר בארנב | SIGMA-ALDRICH | A2066 | כתם מערבי |
| נגד ארנב IgG (H+L), HRP מצומד | Promega | W4011 | כתם מערבי |
מקורות
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
