הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים

9.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57082

⸱

27 בפברואר 2018

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

במאמר זה

סיכום

שיטה מתוארת עבור fractionation של מינים huntingtin מוטציה לא מסיסים ולא מסיסים מתרבות המוח ותא העכבר. השיטה המתוארת שימושית עבור כימות של huntingtin חלבון השטף ועזרי בניתוח הומאוסטזיס חלבון בפתוגנזה של המחלה, בנוכחות לפליטת ואפיון

תקציר

ההצטברות של חלבונים misfolded הוא מרכזי פתולוגיה של מחלת הנטינגטון (HD), רבים הפרעות ניווניות אחרות. באופן ספציפי, מפתח תכונה פתולוגית של HD הוא הצטברות חריגה של מוטציה בחלבון HTT (mHTT) לתוך מתחמי משקל מולקולרי גבוה, גופים הכללה תאיים המורכב מקטעי וחלבונים אחרים. שיטות קונבנציונליות כדי למדוד ולהבין שהתרומות של צורות שונות של אגרגטים המכילות mHTT כוללים קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, ניתוח תספיג מסנן השמנה מבחני.

עם זאת, רוב השיטות האלה הן קונפורמציה ספציפיים, ולכן לא יכול לפתור המדינה מלאה של mHTT השטף חלבון בשל האופי המורכב של צבירה מסיסות והרזולוציה.

לצורך זיהוי mHTT צבורים שונים צורות ששונה ואת מתחמי, ההפרדה ואת solubilization של אגרגטים הסלולר ואת שברי הוא חובה. כאן אנו מתארים שיטה כדי לבודד והמחש mHTT מסיסים מונומרים, oligomers, שברים, משקל מולקולרי גבוה (HMW) לא מסיסים שנצבר mHTT מינים. HMW mHTT שירים עם התקדמות המחלה, מתכתב עם העכבר התנהגות הקריאות הבאות, יש כבר מווסת לטובה על ידי התערבויות טיפוליות מסוימת1. גישה זו יכולה לשמש עם מוח העכבר רקמות היקפיים, תרבית תאים אבל שעשוי להיות מותאם דגם מערכות או מחלת בהקשרים אחרים.

מבוא

שיבוש רשתות בקרת איכות חלבון להבטיח קיפול נאות והשפלות של החלבונים הוא מרכזי סביר פתולוגיה מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), אחרים "חלבון misfolding" והפרעות2,3. הבנה מפורטת של רכיבי הרשת פרוטוסטאזיס ותרומתם פתולוגיה ולכן הם חיוניים לפיתוח התערבויות טיפוליות משופרת. HD נגרמת על ידי הרחבת חריג שידור חוזר חטיבתי בתוך הגן HD וכתוצאה מכך רצועת המורחב של polyglutamines (polyQ) חלבון huntingtin (HTT)4. תכונה פתולוגית עקבית של פתוגנזה HD היא וכתוצאה מכך misfolding, הצטברות, צבירה של HTT באזורים של המוח, ברקמות היקפיים, אשר הוכח להתערב במספר דרכים עם תאים נורמליים הומאוסטזיס ותפקוד 5 , 6. HTT בזמן מבוטא ubiquitously, בינוני קוצני נוירונים בסטריאטום פגיע באופן סלקטיבי, המושפע ביותר בגלוי עם ניוון קליפתי הבולטים המשויכים גם HD פתוגנזה.

היווצרות של אגרגטים של HTT במוח של חולים HD ומודלים בעלי חיים שימש בדרך כלל proxy סמן התקדמות המחלה ולהשיג דומיננטה-שלילי של פונקציה mHTT7. למרות המנגנון המדויק על ידי שבו חלבון misfolding, צבירת עשוי לתרום רעילות הנגרמת mHTT אינן ברורות, היווצרות של אלה תכלילים במוח של חולי HD, מודלים שונים היא תכונה קבוע ובלתי נמנע. תכלילים מופיעות כמורכבת במידה רבה של קטעים HTT שהצטברו המכיל N-מסוף מורחבת polyQ, המציין את proteolysis, וכן עיבוד של HTT באורך מלא, כמו גם אלטרנטיבה שחבור8,9 עשוי לשחק תפקיד חשוב בפתוגנזה של שברי HD. N-מסוף HTT עלולה להוות צורה פיפטות של HTT יכול לצבור במהירות, nucleate, ו להאיץ או להפיץ את תהליך של צבירת10.

עם זאת, הנוכחות של תכלילים אלה לא בהכרח לתאם עם רעילות HTT-induced או מוות תא11. HTT הוצע לעבור תהליך צבירת מ מונומר מסיסים דרך מינים oligomeric מסיסים ו β-גיליון הסיבים לא מסיסים אגרגטים, תכלילים12. פתרון אלה מינים שונים של חלבון באמצעות מבחני הביוכימי רגיל כבר אתגר בשטח עקב יציבות שלהם במאגר נמוך חומרי פירוק ולקשיי להמחיש באמצעות מבחני הביוכימי סטנדרטי. לפיכך, שיקולים מתודולוגי הם קריטיים באיתור את התואר ואת התבנית של mHTT המצטבר של צבור.

פרוטוקול המובאת כאן מספק שיטה כדי להמחיש כמה intermediates של HTT, במיוחד היווצרות של זן HMW HTT לא מסיסים המופיע לעקוב מקרוב אחר עם HD בפתוגנזה של המחלה התקדמות1,13 ,14. היכולת לזהות ולעקוב אחר מספר מינים של mHTT מספק חוקרים כלי הביוכימי ללמוד בפתוגנזה של המחלה ואף להעריך את פוטנציאל התערבויות טיפוליות דרך שלהם אפנון ואת ההשפעה על המחלה פתוגנזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דוח אתיקה בעלי חיים - ניסויים בוצעו בהתאמה קפדנית עם המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים, פרוטוקול מחקר בבעלי חיים שאושרו על-ידי (אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש IACUC) ב אוניברסיטת קליפורניה, אירווין, מוכר AAALAC המוסד. כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של בעלי החיים.

1. הכנה של פירוק מאגרי

  1. להכין "מסיסים" פירוק מאגר (10 מ מ טריס pH 7.4, 1% טריטון-X 100, 150 מ מ NaCl, 10% גליצרול) וסינון סטרילי דרך מסנן מיקרומטר 0.22.
    1. עבור עבודה "מסיסים" מאגר פירוק, N-Ethylmaleimide (NEM) וכולן ביסודיות להמיס 100 מ מ phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) מומס 100% EtOH.
      הערה: פירוק מאגר מעכבי: (i) 20 מ מ N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 מ מ PMSF; (iii) 1 מ"מ orthovanadate נתרן (Na3VO4); (iv) leupeptin µg/mL 1; (v) aprotinin µg/mL 1; (vi) 20 מ מ סודיום פלואוריד (NaF).
      התראה: תלבש מסיכת פנים בעת עבודה עם NEM לאורך כל הפרוטוקול. עובד פירוק מאגר להתבצע טריים כדי להבטיח מעכבי פעיל.
    2. עבור מאגר פירוק מסיס עם מעכבי פרוטאז, הוסף מעכבי לפי הסדר הבא: סודיום פלואוריד (NaF), עד נפח עם מאגר פירוק קר, orthovanadate נתרן (Na3VO4), Aprotinin Leupeptin.
  2. עבור מאגר פירוק "מסיסים", מוסף 4% מרחביות על-ידי הוספת µL 500 למען חברה דמוקרטית 20% 2 מ של מאגר פירוק "Soluble". יוצאים בטמפרטורת החדר.
    הערה: למען חברה דמוקרטית לזרז את כאשר שמרו ב 4 ° C; . לשמור את זה אווריריות. קומפוזיציה פירוק מאגר הסופי: 10 מ מ טריס (pH 7.4); 1% טריטון X-100; 150 מ מ NaCl; 10% גליצרול; 4% מרחביות (לא מסיס בלבד).

2. מסיסים/לא מסיס Fractionation פרוטוקול

הערה: ראה איור 1 מפרטים טכניים.

  1. תווית שתי ערכות של צינורות עבור כל דגימה: "Soluble" ו- "לא מסיסים."
  2. להוסיף X-µL קר כקרח מאגר פירוק מסיסים לעבוד עם מעכבי פרוטאז (ראה 1.1.1) לרקמה.
    הערה: X = אמצעי האחסון משתנה בהתאם כמות רקמת; ראה טבלה 1.
  3. עבור העכבר רקמת מוח (קרי, סטריאטום), דאונס לאט 30 פעמים זכוכית 1 מ"ל douncer ו pipet לתוך"לא מסיס"הנקרא צינור (לשמור בקירור).
    הערה: יש להיזהר לא לשבור את פני השטח של הנוזל לאחר הפעלת douncing, כמו בועות יהיה טופס תניב המגון לא שלם.
  4. עבור תאים (קרי, הלה, HEK293T), לשטוף תאים פעם אחת עם קר, 1 x PBS. להסיר PBS חלות נפח מינימלי של מאגר פירוק תאים, תרים עם תא המגרד.
    הערה: עבור מעל שורות תאים, התאים היו מצופה ב 5 x 105 תאים לכל צלחת טוב 6, גדל ליד confluency. אחד טוב הוא דומה לאמצעי אחסון המשמש סטריאטום העכבר.
  5. העברת homogenate או lysate לתוך התא הנקרא, צינורות "מסיסים" ואת lyse על קרח 1 h (התחל שעון לאחר עיבוד סופי צינור).
    הערה: עבור תא lysates, triturate מספר פעמים כדי לשבור את התא הגושים לפני מתחיל אינקובציה. למנוע היווצרות בועות. בקצרה מערבולת דופק כל דגימה עבור 1 s בחצי הדרך lysing.
  6. צנטריפוגה דגימות ב 4 ° C-g x 15,000 עבור 20 דקות.
  7. לשחזר תגובת שיקוע כמו השבר "Soluble".
    1. להסיר עם pipet, להיזהר שלא להפריע שכבה גלולה/מעונן כמו זה לזהם את השבר. Pipet שבר מסיסים לתוך "Soluble" תוויות שפופרת. לשמור על הקרח.
  8. לרחוץ גלולה עם 500 µL של פירוק מאגר (x2), צנטריפוגה ב 4 ° C-g x 15,000 עבור 5 דקות אחרי זה לשטוף; זה בסדר אם חלק השכבה מעונן הוא pipetted.
  9. לאחר השטיפה הסופית להסיר כל מאגר שטיפת הנותרים עוזב רק בגדר רקמות.
    הערה: מנקודה זו, דגימות לא מסיסים יש עכשיו לשמור בטמפרטורת החדר.
  10. Resuspend גלולה עם מאגר פירוק X-µL בתוספת 4% מרחביות (אמצעי אחסון ניתן להתאים בהתאם לגודל צניפה; ראה טבלה 1).
  11. Sonicate כל דגימה ל 30 s בטמפרטורת החדר עם sonicator המכשיר (125 וואט, 20 kHz, הדופק, משרעת ב-40%, ראה טבלה של חומרים).
  12. להרתיח דגימות (מתגלגל לרתיחה) במשך 30 דקות; צנטריפוגה בקצרה (15 s) ב 6,000 g x כדי לא לאבד את דוגמה.
  13. לבצע DC (דטרגנט תואם) חלבון assay (ראה טבלה של חומרים) או שיטת לאורי למדידת ריכוז חלבון (מומלץ דילולים התחיל של 1/5 מדגם במאגר פירוק בהתאמה לתרבות תא, 10/1 lysates רקמות).
    הערה: ריכוז חלבון יהיה ניתן לקריאה באמצעות וזמינותו של DC או לאורי בשל ריכוז גבוה של דטרגנט.
  14. דוגמאות aliquot 50 µL אצוות כדי למנוע בעיות ההקפאה-הפשרה.
    הערה: פרוטוקול ניתן להשהות כאן לפני ניתוח ביוכימי נוסף על-ידי אחסון שני שברים ב-20 ° C.

3. תספיג חלבון ו כמת

  1. לבצע שהכלים המערבי כפי שדווח במקום1,13 על ידי המדללת 30 µg מדגם 1:1 בקופסא טעינת מאגר (1.6 x בטעינת צבע, 1 x הפחתת).
    הערה: 30 µg של חלבון ליום שבר מספיקה, אך ניתן לכוונן את רזולוציה מיטבית. 3 - 8% טריס-אצטט פולי-אקרילאמיד ג'לים אמור לשמש את השבר לא מסיסים. 4 - 12% bis-טריס ג'לים מומלץ עבור השבר מסיסים.
  2. מרתיחים דגימות (בהרתחה מתגלגל) 5 דק צנטריפוגה בקצרה (15 s) ב 6,000 g x כדי לאסוף דוגמה.
  3. לנתח שברים על ידי עמודים מרחביות, תספיג חלבון על פי הפרוטוקול של היצרן עבור דגימות מופחת.
    הערה: שבר לא מסיסים פותר הטוב ביותר כאשר העבירו על גבי הממברנה ניטרוצלולוזה מיקרומטר 0.45. 0.45 או 0.2 µM ניטרוצלולוזה יכול לשמש עבור השבר מסיסים, בהתאם לגודל של החלבון עניין. אופטימיזציה מסוימים עשוי להידרש להעברה הטוב ביותר של חומרים HMW.
  4. כתם קרום עם חלבון כל כתם (למשל, MEMcode, ראה הטבלה של חומרים) לדמיין חלבון נצילות ההטענה.
    הערה: ניתן לנתח שהכלים המערבי באינטנסיביות פיקסל רע. אפשרות לנרמל את השברים מסיסים כדי חלבון משק בית הכי מתאים עבור מערכת ניסויית. שבר לא מסיסים כמו חלבון יחסית שפע אומתה על ידי חלבון הפיך להכתים או 3 היסטון נורמליזציה על כתם נפרדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

רזולוציה של lysates תא מסיסים ובחלקם לא מסיסים בעקבות fractionation ניתן להבחין באמצעות המערבי ניתוח ומסנן פיגור מבחני (איור 2). לדוגמה, תאים HEK293T היו transfected באמצעות ריאגנט תרביות תאים (למשל, lipofectamine 2000), עם HTT אקסון 1 cDNA קידוד המכילים גלוטמין 97 חוזר15 ואחריו האזור עשיר של פרולין פוליפוני, תאים אלה הורשו אקספרס עבור תאים ה 44 טופלו עם גם 5 מיקרומטר MG132 כדי לחסום את פרוטאוזום או דימתיל סולפוקסיד כפקד 18 h ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כמה אמצעי זהירות נדרשים עבור הפרוטוקולים לעיל להבטיח תוצאות עקביות, תפוקה. ראשית, mHTT שני שברים באופן ספונטני יהוו אגרגטים לאורך זמן על מחזורי הפשרת ההקפאה מרובים, במיוחד כאשר אתה נמצא ריכוז גבוה. לפיכך חיוני כדי להקפיא aliquots של חלבון preps, ולאחר להפשיר רק את אמצעי האחסון הדרושים לפני הפעלת וזמינותו כמתואר לעיל בפרוטוקול. עוד, אם השבר לא מסיסים התשואות precipitant לבן עם מפשיר, שיחזור ייתכן שיהיה צורך מאת נוספים הדופק sonication s 5, 5 דקות לרתיחה, כימות מחדש לפני ניתוח באמצעות מבחני הביוכימי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי NIH (RO1-NS090390). כן נרצה להודות דיון במהלך פיתוח assay זה וסיוע טכני ד ר ג'ואן Steffanfor.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסנן סטריליMilliporeSCGP505REמכסה בורג, מסנן ואקום סטרילי
1 מ"ל מטחנת רקמות, DounceWheaton357538
SonicatorQsonicaדגם Q125
DC Protein AssayBiorad5000111דומה לבדיקת Lowry
Tris 1M תמיסת חיץAlfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5M תמיסתTeknovaS0251
גליצרולפישרBP229-1
20% תמיסת SDSTeknovaS0295
N-ethylmaleimideSigmaE1271
Phenylmethylsulfony פלואורידSigmaP7626ליצור תמיסת מלאי של 100 מ"מ ב-100% EtOH, חנות ב-4° C
נתרן אורתוואנדאטסיגמאS6508צור תמיסת מלאי 0.5M במים
לופפטיןסיגמאL2884צור תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל במים
אפרוטיניןסיגמאA1153צור תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל במים
נתרן פלואורידסיגמאS4504צור תמיסת מלאי של 500 מ"מ במים
אנטי HTTMilliporeMAB5492השתמש ב-1:1000 עבור כתם מערבי, 1:500 עבור בדיקת פיגור מסנן
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875השתמש ב-1:1000 עבור כתם מערבי מסיס

מקורות

  1. Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
  2. La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
  3. Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
  4. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  5. Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
  6. Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
  7. Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
  8. Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
  9. Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).
  10. Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
  11. Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
  12. Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
  13. O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
  14. Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
  15. Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
  16. Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
  17. Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
  18. Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  19. Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
  20. Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73(2009).
  21. Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710(2013).
  22. Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
  23. Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Western BlotSDS PAGE
Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.