הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה

6.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57114

⸱

17 ביוני 2018

 , 
1Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מספק גישה מעודכן למערכת כמירה שליו-עוף קלאסית ללמוד היווצרות האיברים, על ידי שילוב של הרומן במבחנה , ב ovo בצרות.

תקציר

העובר העופות, כמודל ניסויי, היה בעל חשיבות עליונה עבור תגליות שורשיות בביולוגיה התפתחותית. בין מספר גישות, היווצרות של תרנגולת-שליו כימרות ושימוש של קרום chorioallantoic (CAM) כדי לקיים את ההתפתחות של רקמות חוץ רחמי תאריך חזרה המאה הקודמת. כיום, השילוב של טכניקות אלה קלאסית עם מתודולוגיות במבחנה האחרונות מציע פרוספקטים הרומן לחקור לעומק את היווצרות האיברים.

כאן נתאר גישה דו-שלבית ללמוד ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של organogenesis. בקצרה, האזור עובריים המכיל את השטח הרב, שעורר איבר היא מבודדת מן העוברים שליו בוגר במבחנה במערכת organotypic (עד 48 שעות). רקמות בתרבית לאחר מכן מורכבים על גבי מצלמת העובר עוף. לאחר 10 ימים של ovo פיתוח, איברים מגובשת התקבלו ברקמות המושתל. שיטה זו מאפשרת גם את האפנון של מסלולי איתות על ידי הממשל הרגיל של סוכנים תרופתי רקמות מוחיות לאורך שלבים התפתחותיים במבחנה , ב ovo . בנוסף, לפתח רקמות ניתן לאסוף בחלון כל הזמן לנתח שלהם פרופיל ביטוי גנטי (באמצעות ה-PCR כמותי (qPCR), מיקרו-מערכים, וכו '), מורפולוגיה (העריכו עם היסטולוגיה קונבנציונאלי, נוגדנים).

ההליך המתואר ניסיוני יכול לשמש ככלי לעקוב אחר היווצרות האיברים בחוץ העובר העופות, בשלבים המוקדמים של organogenesis כדי גובשה במלואה, איברים פונקציונליים.

מבוא

העופות העוברים היה בשימוש נרחב במחקרים הזרע ביולוגיה התפתחותית. היתרונות העיקריים של המודל העופות כוללים את האפשרות לפתוח את הביצה, גישה קלה יחסית של העובר, ואת היכולת לבצע המיקרומניפולציה. כמה דוגמאות מהווים מערכת כמירה שליו-עוף קלאסי ללמוד תא גורל1, יישום של גורמי גדילה ספציפי העובר2, וגידול של מבנים הסלולר חוץ רחמי מצלמת1,3, 4.

כדי לקבל תובנות חדשות שלבים של היווצרות האיברים, לאחרונה פיתחנו שיטה המשלבת טכניקות הרכבה עם מניפולציה במבחנה של רקמות עובריים5. הגישה שני שלבים מאפשר אפליה וחקירה של שניהם - ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של organogenesis, לעתים קרובות מוגבל בשל רקמת דינמיות ומורכבות מאוד אינטראקציות2. יתר על כן, היעדר סמנים רקמות ספציפיות מתאים לעתים קרובות מגביל את השימוש מהונדסים גנטית חיה מודלים6. שיטה זו הרומן של הגישה שני שלבים גוברת במידה רבה על ההגבלות.

ללמוד בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים, בשלב הראשון, הטריטוריה עובריים שליו הכוללת תחילתו איברים פוטנציאליים מבודדים, גדל בכל מערכת organotypic במבחנה במשך 48 שעות. במהלך תקופה זו, אפנון תרופתי של איתות המסלולים ספציפי יכול להתבצע על-ידי הוספת תרופות תרבות בינוני5,7. בנוסף, רקמות בתרבית ניתן לאסוף בכל שלב הצמיחה במבחנה ולהשתמש שנבדק על ביטוי גנים (באמצעות שיטות כגון qPCR, מיקרו-מערכים, וכו ').

בשלב השני, רקמות תרבותי h 48 ואז מורכבים על גבי מצלמת העובר עוף (ג) ביום עובריים (E) 8 (cE8) (המבורגר, המילטון (HH)-שלבים 33-35)8. מצלמת מתנהג כספק כלי הדם של חומרים מזינים ומאפשר דלק חילופי1,3,4 לרקמות המושתל הפעלת שלה פיתוח ב ovo עבור תקופות זמן ארוכות יותר. שלב נסיוני זה מתאים במיוחד ללמוד מאחרים-שלבים של organogenesis, כמו איברים מגובשת יכולה להיות מושגת לאחר 10 ימים של ovo פיתוח5,9,10,11 . ניתוח מורפולוגי מתבצע בקלות על ידי היסטולוגיה קונבנציונליות כדי לאשר היווצרות האיברים תקין, התורם מקורם של התאים ניתן לזהות באמצעות אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים תלויי מין (כלומר, MAb שליו PeriNuclear (QCPN)). במהלך תקופת הדגירה קאם, שתלים יכולים גם להיות גדל בנוכחות סוכנים תרופתי ונאסף בכל שלב של פיתוח כדי להעריך את ההתקדמות של organogenesis.

הגישה בשני שלבים, המתוארים כאן לעומק, כבר ננקטה. פיגירדו et al. 5 כדי לחקור את ההתפתחות ראשית יותרת התריס העופות/התימוס נפוצות. בהתאם לכך, את particularities הטבועה של השטחים עובריים, שלבי ההתפתחות מעורב organogenesis של בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס, יוצגו להלן.

בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס epithelia, אבל ברור מבחינה תפקודית, שואבים האנדודרם של השיטה בלוע (PP)12. ב העופות, epithelia של איברים אלה מקורן השלישית והרביעית PP האנדודרם (3/4PP)12, ואילו אצל יונקים האפיתל הרתי נובע 3PP האפיתל של בלוטות יותרת התריס הנגזר מן 3PP 3/4PP עכבר והן האנושיים, בהתאמה13,14.

אחד השלבים המוקדמים ביותר על היווצרות האיברים האלה היא הופעתה של בלוטת התימוס דיסקרטית ותחומים יותרת התריס ב- ראשית נפוצות. עוף, תחומים אלה יכול להיות מזוהה על ידי הכלאה בחיי עיר , עם סמנים מולקולריים ספציפי, E4.515. כמו פיתוח מתקדם, rudiments איברים אלה לבודד, להפריד בין הלוע, בעוד קפסולה mesenchymal דק, נוצר על ידי תאים נגזר הרכס העצבי, מקיף אותם (ב E5; HH-stage 27). בהמשך, האפיתל הרתי התנחלו מאת ובתאים hematopoietic (ב E6.5; HH-stage 30)12.

כמו לימודים קלאסיים שליו-עוף1,12, הגישה שני שלבים שימושי במיוחד ללמוד היווצרות של איברי הלימפה/hematopoietic, כלומר בלוטת התימוס5. כפי explant השליו, עם תחילתו איברים, הוא הושתל ב העובר עוף לפני קדמון hematopoietic תא קולוניזציה, התימוס chimeric הוא הקים עם עוף נישא בדם ובתאים שחדר מקבילה אפיתל הרתי שליו. שיטה זו היא, לכן, כלי שימושי כדי לחקור את התרומה של hematopoietic בתאים הפיתוח של מערכת הלימפה/המטו העופות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בצע טיפול בבעלי חיים והנחיות אתיות של דה Centro Académico דה רפואה Lisboa.

1. דגירה של שליו מופרית, עוף וביצים

  1. דגירה שליו יפני (שליו שליו יפני) וביצים עוף (גאלוס גאלוס) מופרית 3 עד 8 ימים, בהתאמה.
    1. מניחים את הביצים עם תא אוויר (ביצה הקהה) פונה כלפי מעלה בחממה humidified ב- 38 מעלות צלזיוס.
    2. השתמש ביצי שליו בסביבות 20, 40 עוף וביצים כדי לבצע את הניסוי הזה.
      הערה: המספרים צריך להיות כפול בעת יצירת הליך זה בפעם הראשונה.

2. בידוד שליו באזור עובריים המכיל השטח הרב, שעורר של Rudiments הרתי, יותרת התריס

הערה: בצע ביצה מניפולציה שגרות בתנאים סטריליים באמצעות תא אופקי למינארי, בכלים סטיריליים וחומרים.

  1. מכינים קערה גדולה זכוכית בורוסיליקט על 3/4 מלא עם קרות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) פתרון.
  2. פתח ביצת שליו לאחר 3 ימי דגירה על-ידי הקשה על הקליפה לחתוך חור עגול בצד הנגדי של סופו בוטה במספריים מעוגלים. בזהירות להסיר חתיכות של מעטפת, להעביר את העובר קערת זכוכית מלאים PBS קר.
  3. להחזיק את העובר שליו (q) ב- E3 (qE3) (השלב שליו המתאימים לשלב HH-21 של התרנגולת) בעזרת מלקחיים דק. עושים חתך לתוך קרום vitelline עוטף את החלמון באמצעות מספריים מעוגלים. המשך לחתוך סביב וחיצוני על ההיקף של כלי עובריים במיוחד.
  4. העברת העובר קטן קערה בערך 3/4 מלא עם PBS קר בעזרת מלקחיים דק. לשטוף ביסודיות העובר מן החלמון המצורפת הנותרים.
  5. להשתמש עוף כדי להעביר את העובר 100 מ מ זכוכית צלחת פטרי עם בסיס שחור (ראה טבלה של חומרים) המכיל 10 מ"ל של PBS קר.
  6. מניחים על צלחת פטרי תחת stereomicroscope.
    הערה:, מנקודה זו ואילך, לבצע את כירורגיים תחת stereomicroscope עבור הגדלה הדרגתית. בתור מקור תאורה, מומלץ להשתמש נוריות ה-LED שילב את stereomicroscope או את סיבים אופטיים, בהתחשב בעומס החום מוגבלת.
  7. החזק את העובר לתחתית לצלחת עם סיכות חרק דק. במקום ארבעה פינים ויוצרים צורת ריבוע באזור עובריים במיוחד.
  8. להסיר את הקרומים במיוחד עובריים של האזור cephalic בעזרת מלקחיים דק ולמקם שם סיכה החמישי.
    הערה: אם העובר ימוקם בצורה נכונה, אז את שלפוחית otic, הרכבת התחתית הלב, 1סנט, 2nd, ואת 3rd לועי קשתות (PAs) צריך להיות גלוי.
  9. לנתח את האזור עובריים של עניין, דהיינו, את 3rd ואזור 4th לועי קשת (3/4PAR), באמצעות מספריים העין Wecker.
    1. להתחיל לחתוך, longitudinally, במקביל לציר העובר, בין אזור הרכבת התחתית somite/עצבי את PAs.
    2. הסר את הצינור הלב ventrally ממוקם על ידי חיתוך זה. שמירה על המספריים באותה תנוחה, לסובב הפטרי כדי למקם מחדש את העובר בהתאם לכיוון של החתך.
    3. חותכים את 2nd בין 3rd PAs ומתחת 4th אבא
    4. לנתק את הקרומים שנותרו מן 3/4PAR בעזרת מלקחיים דק.
  10. וארוקן את רקמות מבודד (3/4PAR) ואת העברת אותם על צלחת זכוכית 3/4 מלא PBS קר באמצעות פיפטה פלסטיק סטרילית 2 מ"ל.
    הערה: בעתיד, רקמות יכול להיות מבוגר במבחנה עד 48 שעות או להיות הושתל מיד אל מצלמת העובר עוף-E8.
  11. שמור את צלחת זכוכית המכילה את 4PAR/3 מבודד על קרח במהלך הכנת וזמינותו במבחנה .

3. במבחנה Organotypic Assay: התרבות של האזור עובריים המכיל השטח הרב, שעורר של Rudiments הרתי, יותרת התריס

  1. להכין את המדיום תרבות RPMI-1640 בינונית בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    הערה: ריאגנטים תרופתי מסיסים יכולים להתווסף המדיום (לדוגמה, LY-411.575 (Ly) di-benzazepine או cyclopamine, vismodegib, כדי לעכב את הרמה של קיפוד (Hh) איתות מסלולים, בהתאמה. זה assay, השתמש 50-200 ננומטר של Ly או 5-15 מיקרומטר של די-benzazepine כדי לעכב את חריץ איתות של 3 / 4PAR. השתמש 20 מיקרומטר של cyclopamine או 10 מיקרומטר של vismodegib לעכב Hh איתות ב- 3/4PAR5.
  2. הכינו את תרבות במבחנה explant 3/4PP בצלחת 6-. טוב.
    1. למלא באר אחת מהצלחת. ובכן 6 מ של תרבות בינוני. מקום 24 מ מ הוספה ממברנה פוליקרבונט (ראה טבלה של חומרים) על הבאר בעזרת מלקחיים דק.
    2. תחת stereomicroscope, להעביר את explant 3/4PAR מתוך קערה זכוכית פני הממברנה על ידי הזזה בעדינות עם העזרה של השתלת כפית (או מרית) ורזה מלקחיים. מניחים את explants עם הצד הבטני למעלה ואת הצד הגבי בקשר עם הקרום. הוסף explants עד שבע לכל ממברנה הוספה. המשך לשלב 3.4.
  3. לחלופין, תרבות explants ב צף קרום מסננים.
    1. להכין 35 מ מ צלחת פטרי עם 5 מ של תרבות בינוני. בעזרת מלקחיים דק, צף קרום לסנן (ראה טבלה של חומרים) ולשמור על משטח יבש במגע עם האוויר.
    2. תחת stereomicroscope, להעביר את explant 3/4PAR מתוך קערה מזכוכית המסנן הממברנה על ידי הזזה עדין עם העזרה של השתלת כפית (או מרית) ורזה מלקחיים. מניחים את explants עם הצד הבטני למעלה ואת הצד הגבי בקשר עם הקרום. הוסף explants עד 8 לכל ממברנה מסנן.
  4. מניחים בזהירות את explants שהוכנו בשלבים 3.2 ו- 3.3 ב חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO2.
  5. לאחר תקופת דגירה של 48 שעות, הסר את הצלחת. ובכן 6 ו 35 מ מ פטרי החממה.
    1. לאסוף את explants בתרבית מהמכסה ממברנה של צלחת 6-. טוב.
      1. להוסיף PBS בטמפרטורת החדר (RT) תותב ממברנה.
      2. לנתק את explants של הקרום על ידי שטיפה נמרצת באמצעות פיפטה פלסטיק סטרילית 2 מ"ל.
      3. בעזרת מרית, מלקחיים דק, להעביר את explants בתרבית על צלחת זכוכית 3/4 מלא עם PBS ב RT.
    2. באופן דומה, לאסוף את explants בתרבית למסנן קרום צף של 35 מ מ פטרי.
      1. להעביר את המסנן קרום עם מלקחיים דק ממולא PBS ב RT. פטרי 35 מ מ חדש
      2. לנתק את explants מהמסנן קרום על-ידי שימוש pipetting נמרצת פיפטה פלסטיק סטרילית 2 מ"ל.
      3. בעזרת מלקחיים דק, פרוק את המסנן explant ללא ממברנה לאחר המאשר כי explants לא נותר קשור אליו.
      4. עם מרית, מלקחיים דק, להעביר את explants צלחת זכוכית מלאים PBS ב RT.
  6. להעביר את explants תרבותי עם מרית 1 מ"ל של ריאגנט לבידוד מוחלט של RNA ולהשתמש ללימודי גנים.
    התראה: חשיפה זו ריאגנט (ראה טבלה של חומרים) יכול להיות סכנה בריאותית חמורה. ללבוש eyewear הגנה מתאימים, ביגוד, כפפות. בצע את ההוראות טיפול וקרא את הסדינים בטיחות הנתונים המסופקים על ידי היצרן.
  7. לחלופין, להשתיל הרקמות בתרבית על קאם של עוברי עוף-E8. בצע עד שלב 4.

4. הכנת מצלמת

  1. הסר את ביצי תרנגולת עם 8 ימים של התפתחות של החממה.
    הערה: היו הביצים מודגרות עם אוויר החדר הפונה כלפי מעלה-38 מעלות צלזיוס חממה humidified.
  2. לכסות את הצד הקהה של הביצה עם קלטת פלסטיק שקוף כדי למנוע חתיכות של הפגז נופל לתוך תא אוויר. הקש את הקליפה וחותכים חור עגול על הביצה במספריים מעוגלים. תא האוויר צריך להיות גלוי.
  3. הסר בזהירות את קרום לבן לשכת אוויר עם מלקחיים דק. קאם הוא ואז לגלוי ונגיש עבור השתלת רקמות חוץ רחמי.
    הערה: אין להשתמש PBS מימה את מצלמת, לפני או אחרי ההשתלה, מאז PBS מקדם הזזה מוזרים של explants. אם הקרום תתייבש למחוק את הביצה.

5. הארכת Explants בתרבית על קאם

  1. יצירת נגעים/פצעים כלי דם קטנים בכלי קטן יותר של מצלמת עם microscalpel של בעל.
    הערה: השתמש קצה פיפטה פסטר ולהסיר את הדם על ידי קפילריות במקרה של דימום עודף.
  2. להשתמש דק מלקחיים, מרית כדי להעביר את explant בתרבית האזור הפצוע של מצלמת.
  3. לחתוך חתיכה של נייר סינון קצת יותר explant גדולה ומניחים אותו על החלק העליון explant.
    הערה: נייר הסינון מסייע למעקב אחר המיקום explant אחרי התפתחותה של מצלמת. בנוסף, היא מאפשרת משלוח סמים מדי יום explant במהלך הפיתוח של ovo , במידת הצורך (שמתואר בשלב 5.6).
  4. תסגור את החלון ביצה עם קלטת פלסטיק שקוף, לזהות אותו באמצעות עיפרון פחם.
    הערה: הקלטת פלסטיק מגן על העובר מהתייבשות במהלך תקופת הדגירה.
  5. תקופת דגירה הביצה מניפולציה של 10 ימים בחממה humidified ב- 38 מעלות צלזיוס. בצע לצעד 6.
  6. שלב אופציונלי: יומי והתרופות האמריקני במהלך תקופת הדגירה.
    1. כדי לגשת את המסנן, בחלקו הרם את הסרט פלסטיק. להוסיף 100 µL של סמים פתרון, טיפה על ידי ירידה, על גבי הנייר. לאטום מחדש את החלון והניחו את הביצה בחזרה בחממה humidified-38 מעלות צלזיוס.
      הערה: עבור זה assay, המינון של 20 מיקרומטר של cyclopamine ימנע Hh איתות במהלך ב ovo הפיתוח5.

6. חוץ רחמי איברים-צורה מצלמת לאחר 10 ימים של Ovo פיתוח

  1. לאחר 10 ימי דגירה, להסיר את הביצה החממה ולסגת בקפידה את הקלטת פלסטיק.
  2. חותכים את מצלמת באזור סינון באמצעות מספריים מעוגלים והעברה קאם-derived explant עם נייר סינון לכוס קטנה קערה בערך 3/4 מלא עם PBS קר.
  3. בעזרת מלקחיים דק להעביר את explant קאם-derived 100 מ מ צלחת פטרי עם בסיס שחור המכילה 10 מ"ל ל- PBS. הסר בעדינות את נייר הסינון, עודף של ממברנה בעזרת מספריים העין Wecker ומלקחיים דק.
  4. להעביר את קאם-explant פתרון מקבע (3.7% מחברים ב- PBS) עם עוף. המתת חסד העוברים עוף מבלי להסיר אותם מהביצה על ידי ביצוע חתך מדויק באזור הצוואר של העובר בעזרת מספריים גדולים.
  5. להעריך היווצרות האיברים פרפין המקטעים של explants קאם, נגזר על ידי היסטולוגיה קונבנציונאלי אימונוהיסטוכימיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

האמור לעיל תיאר פרוטוקול פרטים שיטה המאפשרת את החקירה של שניהם - ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של organogenesis, לעיתים קרובות מוגבל על ידי אינטראקציות מורכבות תאית ומולקולרית.

שיטה זו הועסק בעבר. פיגירדו et al. 5 כדי לחשוף את התפקיד של חריץ, Hh איתות בהתפתחות ראשית נפוצות יותרת התריס העופות/בלוטת התימוס.

במסמך זה, תוצאות חדשות מוצגות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היבט חיוני להצלחה של שיטה זו הוא איכות עוף והן שליו ביצים. בהתחשב התקופות דגירה ארוך, במיוחד במהלך ovo בתוך וזמינותו, באיכות טובה של ביצי תרנגולת משפר את יכולת הקיום שיעורי (עד 90%) בסוף ההליך. כדי להשיג זאת, לבדוק את הביצים מן הספקים השונים. דגירה הביצים unmanipulated לתקופות ארוכות (עד 16-17 ימים) ולבדוק את התפתחותם. כדי להיחשב אצווה איכות טובה, יותר מ- 80% של העוברים צריך להציג להתפתחות התקינה. זה גם חשוב לוודא כי כל שלב הדגירה מספק לשחזור שלבים התפתחותיים סינכרונית כדי להבטיח אמין ותוצאות באמת נציג בסוף. בשל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים Cidadão עידו, איזבל Alcobia של פריירה לאונור קריאה ביקורתית בכתב היד, Padma Akkapeddi הקריינות וידאו, ולעשות כדי Vitor Proa מן השירות היסטולוגיה של ה-e אינסטיטוטו Histologia דה Biologia Desenvolvimento, Faculdade דה רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa, לקבלת תמיכה טכנית. אנחנו חבים במיוחד פאולו Caeiro, הוגו סילבה מ Unidade דה audiovisuais (יחידת אורקולי), Faculdade דה רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa על מחויבותם מצטיינים לייצור של וידאו זה. אנו להכיר לייקה מיקרוסיסטמס בחביבות לספק סטריאוסקופ מצויד עם מערכת הוידאו, כדי Interaves - שימור אורח אגרו-Pecuária, s. A משתמשינו שליו מופרית ביצים. עבודה זו נתמכה על ידי דה Faculdade רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ביצי עוף מופרות (Gallus gallus)Pintobar, פורטוגלחוות עופות 
ביצי שליו מופרות (Coturnix coturnix)Interaves, חוות ציפורי פורטוגל 
צינורות צנטריפוגה PP 15 מ"ל צינורות צנטריפוגהPP קורנינג430052
50 מ"ל צינורות צנטריפוגהPP קורנינג430290
60 x 20 מ"מ כלי פיירקסדוראן21 755 41
100 x 20 מ"מ כלי פיירקסקבוצת דוראן21 755 48
תוספת ממברנה פוליקרבונט קורנינג341224 מ"מ טרנסוול עם תוספת קרום פוליקרבונט נקבובית 0.4 מ"מ 
מסנן ממברנהMilliporeDTTP013000.6 מ"מ מסנן ממברנה איזופור
6 בארות צלחות תרביתNunc, Thermo Fisher Scientific140675
צלחת פטרי, 35 x 10 מ"מSigma-AldrichP5112 
קערותמהסופרמרקט 
העברת פיפטותSamco Scientific, Thermo Fisher Scientific2041S2 מ"ל פלסטיק פיפט
זכוכית פסטר פיפטהנורמקס5426015
Whatman  נייר סינון איכותיSigma-AldrichWHA1001090נייר סינון
סרטמהסופרמרקט 
ציטוקרטין (פאן; חומצי ובסיסי, ציטוקרטינים מסוג I ו-II), שיבוט Lu-5BMA BiomedicalsT-1302
Cyclopamine hydrateSigma-AldrichC4116מעכב פרמקולוגי של איתות Hh
Fetal Bovine SerumInvitrogen, Thermo Fisher ScientificStandart FBS
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
פניצילין-סטרפטומיציןInvitrogen, Thermo Fisher Scientific15140-122
תמיסת מלח פוספט (PBS)GIBCO, Thermo Fisher Scientific10010023
QCPN נוגדניםמחקרים התפתחותיים Hybridoma BankQCPN
RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAX GIBCO, Thermo Fisher Scientific61870010
Bluesil RTV141A/B סיליקון אלסטומר 1.1 ק"ג ערכתELKEM/SilmidRH141001KGלהכנת הבסיס האחורי לצלחת פטרי
Stemolecule LY411575Stemgent04-0054מעכב פרמקולוגי של איתות חריץ
TRIzol ReagentInvitrogen, Thermo Fisher Scientific15596026 Reagent לבידוד RNA כולל
דומונט #5 מלקחייםכלים מדעיים עדינים11251-30 מלקחיים דקים
מספריים בון עדינים במיוחד, מעוקליםFine Science Tools14085-08מספריים מעוקלים
סיכות חרקים כלים מדעיים עדינים26001-30
מיקרו מרית כלי מדע עדינים10087-12כף השתלה
סיכות Minutienכלי מדע עדינים26002-20מיקרואזמל
מוריה מחזיק סיכות מצופה ניקלכלים מדעיים עדינים26016-12מחזיק
מוריה כף מחוררתכלי מדע עדינים10370-17רחפן
ווקר מספריים לעינייםכלי מדע עדינים15010-11
מצלמה:Leica Microsystems MC170 HD
סטריאוסקופ LeicaMicrosystems מיקרוסקופ Leica M80
Leica Microsystems DM2500
קבוצת פיירקס פלסטיק שקוף

מקורות

  1. Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
  2. Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
  3. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
  4. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  5. Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
  6. National Research Council. Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).
  7. Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660(2011).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
  9. Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
  10. Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
  11. Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
  12. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
  13. Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
  14. Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
  15. Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
  16. Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
  17. Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
  18. Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
  19. Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרבית חוץ גופיתקרומי השקית והשלייהקשתות הלועהתפתחות התימוסניתוח ביטוי גניםהיסטולוגיהאימונוהיסטוכימיהמודולציה פרמקולוגית
גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.