מאמר זה מספק גישה מעודכן למערכת כמירה שליו-עוף קלאסית ללמוד היווצרות האיברים, על ידי שילוב של הרומן במבחנה , ב ovo בצרות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה
במאמר זה
סיכום
תקציר
העובר העופות, כמודל ניסויי, היה בעל חשיבות עליונה עבור תגליות שורשיות בביולוגיה התפתחותית. בין מספר גישות, היווצרות של תרנגולת-שליו כימרות ושימוש של קרום chorioallantoic (CAM) כדי לקיים את ההתפתחות של רקמות חוץ רחמי תאריך חזרה המאה הקודמת. כיום, השילוב של טכניקות אלה קלאסית עם מתודולוגיות במבחנה האחרונות מציע פרוספקטים הרומן לחקור לעומק את היווצרות האיברים.
כאן נתאר גישה דו-שלבית ללמוד ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של organogenesis. בקצרה, האזור עובריים המכיל את השטח הרב, שעורר איבר היא מבודדת מן העוברים שליו בוגר במבחנה במערכת organotypic (עד 48 שעות). רקמות בתרבית לאחר מכן מורכבים על גבי מצלמת העובר עוף. לאחר 10 ימים של ovo פיתוח, איברים מגובשת התקבלו ברקמות המושתל. שיטה זו מאפשרת גם את האפנון של מסלולי איתות על ידי הממשל הרגיל של סוכנים תרופתי רקמות מוחיות לאורך שלבים התפתחותיים במבחנה , ב ovo . בנוסף, לפתח רקמות ניתן לאסוף בחלון כל הזמן לנתח שלהם פרופיל ביטוי גנטי (באמצעות ה-PCR כמותי (qPCR), מיקרו-מערכים, וכו '), מורפולוגיה (העריכו עם היסטולוגיה קונבנציונאלי, נוגדנים).
ההליך המתואר ניסיוני יכול לשמש ככלי לעקוב אחר היווצרות האיברים בחוץ העובר העופות, בשלבים המוקדמים של organogenesis כדי גובשה במלואה, איברים פונקציונליים.
מבוא
העופות העוברים היה בשימוש נרחב במחקרים הזרע ביולוגיה התפתחותית. היתרונות העיקריים של המודל העופות כוללים את האפשרות לפתוח את הביצה, גישה קלה יחסית של העובר, ואת היכולת לבצע המיקרומניפולציה. כמה דוגמאות מהווים מערכת כמירה שליו-עוף קלאסי ללמוד תא גורל1, יישום של גורמי גדילה ספציפי העובר2, וגידול של מבנים הסלולר חוץ רחמי מצלמת1,3, 4.
כדי לקבל תובנות חדשות שלבים של היווצרות האיברים, לאחרונה פיתחנו שיטה המשלבת טכניקות הרכבה עם מניפולציה במבחנה של רקמות עובריים5. הגישה שני ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בצע טיפול בבעלי חיים והנחיות אתיות של דה Centro Académico דה רפואה Lisboa.
1. דגירה של שליו מופרית, עוף וביצים
- דגירה שליו יפני (שליו שליו יפני) וביצים עוף (גאלוס גאלוס) מופרית 3 עד 8 ימים, בהתאמה.
- מניחים את הביצים עם תא אוויר (ביצה הקהה) פונה כלפי מעלה בחממה humidified ב- 38 מעלות צלזיוס.
- השתמש ביצי שליו בסביבות 20, 40 עוף וביצים כדי לבצע את הניסוי הזה.
הערה: המספרים צריך להיות כפול בעת יצירת הליך זה בפעם הראשונה.
2. בידוד שליו באזור עובריים המכיל השטח הרב, שעורר של Rudiments הרתי, יותרת התריס
הערה: בצע ביצה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
האמור לעיל תיאר פרוטוקול פרטים שיטה המאפשרת את החקירה של שניהם - ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של organogenesis, לעיתים קרובות מוגבל על ידי אינטראקציות מורכבות תאית ומולקולרית.
שיטה זו הועסק בעבר. פיגירדו et al. 5 כדי לחשוף את התפקיד של חריץ, Hh איתות בהתפתחות ראשית נפוצות יותרת התריס העופות/בלוטת התימוס.
במסמך זה, תוצאות חדשות מוצגות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היבט חיוני להצלחה של שיטה זו הוא איכות עוף והן שליו ביצים. בהתחשב התקופות דגירה ארוך, במיוחד במהלך ovo בתוך וזמינותו, באיכות טובה של ביצי תרנגולת משפר את יכולת הקיום שיעורי (עד 90%) בסוף ההליך. כדי להשיג זאת, לבדוק את הביצים מן הספקים השונים. דגירה הביצים unmanipulated לתקופות ארוכות (עד 16-17 ימים) ולבדוק את התפתחותם. כדי להיחשב אצווה איכות טובה, יותר מ- 80% של העוברים צריך להציג להתפתחות התקינה. זה גם חשוב לוודא כי כל שלב הדגירה מספק לשחזור שלבים התפתחותיים סינכרונית כדי להבטיח אמין ותוצאות באמת נציג בסוף. בשל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מודים Cidadão עידו, איזבל Alcobia של פריירה לאונור קריאה ביקורתית בכתב היד, Padma Akkapeddi הקריינות וידאו, ולעשות כדי Vitor Proa מן השירות היסטולוגיה של ה-e אינסטיטוטו Histologia דה Biologia Desenvolvimento, Faculdade דה רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa, לקבלת תמיכה טכנית. אנחנו חבים במיוחד פאולו Caeiro, הוגו סילבה מ Unidade דה audiovisuais (יחידת אורקולי), Faculdade דה רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa על מחויבותם מצטיינים לייצור של וידאו זה. אנו להכיר לייקה מיקרוסיסטמס בחביבות לספק סטריאוסקופ מצויד עם מערכת הוידאו, כדי Interaves - שימור אורח אגרו-Pecuária, s. A משתמשינו שליו מופרית ביצים. עבודה זו נתמכה על ידי דה Faculdade רפואה de Lisboa, Univ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ביצי עוף מופרות (Gallus gallus) | Pintobar, פורטוגל | חוות עופות | |
| ביצי שליו מופרות (Coturnix coturnix) | Interaves, חוות ציפורי פורטוגל | ||
| צינורות צנטריפוגה PP 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה | PP קורנינג | 430052 | |
| 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה | PP קורנינג | 430290 | |
| 60 x 20 מ"מ כלי פיירקס | דוראן | 21 755 41 | |
| 100 x 20 מ"מ כלי פיירקס | קבוצת דוראן | 21 755 48 | |
| תוספת ממברנה פוליקרבונט | קורנינג | 3412 | 24 מ"מ טרנסוול עם תוספת קרום פוליקרבונט נקבובית 0.4 מ"מ |
| מסנן ממברנה | Millipore | DTTP01300 | 0.6 מ"מ מסנן ממברנה איזופור |
| 6 בארות צלחות תרבית | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| צלחת פטרי, 35 x 10 מ"מ | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| קערות | מהסופרמרקט | ||
| העברת פיפטות | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 מ"ל פלסטיק פיפט |
| זכוכית פסטר פיפטה | נורמקס | 5426015 | |
| Whatman נייר סינון איכותי | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | נייר סינון |
| סרט | מהסופרמרקט | ||
| ציטוקרטין (פאן; חומצי ובסיסי, ציטוקרטינים מסוג I ו-II), שיבוט Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | מעכב פרמקולוגי של איתות Hh |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| תמיסת מלח פוספט (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN נוגדנים | מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAX | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B סיליקון אלסטומר 1.1 ק"ג ערכת | ELKEM/Silmid | RH141001KG | להכנת הבסיס האחורי לצלחת פטרי |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | מעכב פרמקולוגי של איתות חריץ |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 Reagent לבידוד RNA כולל | |
| דומונט #5 מלקחיים | כלים מדעיים עדינים | 11251-30 | מלקחיים דקים |
| מספריים בון עדינים במיוחד, מעוקלים | Fine Science Tools | 14085-08 | מספריים מעוקלים |
| סיכות חרקים | כלים מדעיים עדינים | 26001-30 | |
| מיקרו מרית | כלי מדע עדינים | 10087-12 | כף השתלה |
| סיכות Minutien | כלי מדע עדינים | 26002-20 | מיקרואזמל |
| מוריה מחזיק סיכות מצופה ניקל | כלים מדעיים עדינים | 26016-12 | מחזיק |
| מוריה כף מחוררת | כלי מדע עדינים | 10370-17 | רחפן |
| ווקר מספריים לעיניים | כלי מדע עדינים | 15010-11 | |
| מצלמה: | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| סטריאוסקופ Leica | Microsystems | מיקרוסקופ Leica M80 | |
| Leica Microsystems | DM2500 |
מקורות
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
