בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

סיכום

יש כבר נכשל בשל מאמצים כדי להבין microglial פונקציה בפירוט חוסר בדגמי תרבות microglial לסכם את מאפייני מיקרוגלייה בוגרת ויוו . פרוטוקול זה מתאר גישה בידוד ותרבות שנועדו לשמור על ההישרדות חזקים של עכברים בוגרים מאוד כחוד מיקרוגלייה בתנאים מוגדרים-בינוני.

תקציר

מיקרוגלייה לייצג 5-10% של כל התאים במערכת העצבים המרכזית (CNS), יותר ויותר מושכים תשומת לב בשל תרומתם במהלך הפיתוח, הומאוסטזיס, ומחלות. למרות מקרופאגים נחקרו בפירוט במשך עשרות שנים, תכונות מיוחדות של מיקרוגלייה, את המקרופאגים רקמות תושב של מערכת העצבים, נותרו במידה רבה מסתורי, בין השאר בשל מגבלות ביכולת להתרכז microglial בוגרת מאפיינים בתרבות. כאן, אנחנו להמחיש תהליך פשוט לבידוד מהירה של מיקרוגלייה טהור מהמוח מכרסמים בוגרת. אנו מתארים גם תנאים תרבות ללא סרום התומכים רמות גבוהות של הכדאיות microglial לאורך זמן. מיקרוגלייה תרבותי בתנאים אלה מוגדרים-בינוני התערוכה תהליכים כחוד משוכלל והתנהגות מעקב דינמי. אנו להמחיש כמה תופעות של סרום חשיפה על מיקרוגלייה בתרבית, לדון איך תרבויות אלה ללא סרום בהשוואה הן תרבויות החשופים סרום, כמו גם מיקרוגלייה בתוך vivo.

מבוא

כמו מקרופאגים של CNS parenchyma, מיקרוגלייה לקיים אינטראקציה עם מגוון רחב של מעגלים עצביים ורשתות איתות גליה. הם ממלאים תפקיד חיוני בתחום הפיתוח הומאוסטזיס של המוח באמצעות גיזום סינפטית, סיווג תא אפופטוטיים להיפגע, ארעית אינטראקציות עם תהליכים עצביים^1,2. מיקרוגלייה הם המגיבים מוקדם כדי מפציעות נוירולוגיים, הרחבת תהליכי שלהם ארוך, דק לאתרים הנגע לתאם תגובות דלקתיות ולהגביל המדמם^3,4. שינויים microglial מורפולוגיה ומתפקדים בכל מקום פציעות CNS אקוטי וכרוני, נספח מיקרוגלייה שינו מורפולוגיה, לוקליזציה, ביטוי של מתווכים דלקתיים ב מגוון רחב של מחלות הברית¹. מחקרים גנטיים בבני אדם מציינים כי מוטציות שמשנות סיכון למחלות ניווניות בעיקר לעיתים קרובות או באופן בלעדי מבוטאים על-ידי מיקרוגלייה ב מערכת העצבים ללא פגע, הצבעה על תפקיד קריטי עבור מיקרוגלייה בפתוגנזה של המחלה או התקדמות⁵ . בהתחשב שהמוניטין שלהם, פציעות ומחלות, בהבנה של ביולוגיה microglial הוא בעדיפות גבוהה לפיתוח גישות טיפוליות חדשות.

רבים ההתקדמות קריטית להבנת הביולוגיה microglial נרקמו על ידי חיוץ שיטות ומנגנונים שהתגלו במחקרים של אוכלוסיות אחרות מקרופאג כולל שיטות, ביטוי גנים פרופילים של הגדרות של פונקציונלי / מורפולוגי של הברית. למרות מוכללת מקרופאג פונקציות לעתים קרובות לשחק בדרכים מפתיעות בתוך נוף CNS, מיקרוגלייה הם עצמם מאוד מיוחדים, מפגין חתימה ביטוי גנים ייחודיים המציבה אותם מלבד רקמות אחרות ומורפולוגיה כחוד מקרופאגים⁶. מיקרוגלייה יש שושלת זו נבדלת מקרופאגים רקמות ביותר אחרים; לישוב מערכת העצבים במהלך גל עובריים של hematopoiesis פרימיטיבית, מוקדם והם לחדש עצמי לאורך החיים, עצמאית התרומות סופית hematopoiesis⁷. החתימה ביטוי גנים לבגרות מלאה של מיקרוגלייה למבוגרים לא מושגת עד שבוע לאחר הלידה השניה⁸. רמזים סביבתיים מן הרקמה שמסביב לשחק תפקיד מרכזי הכתבת רקמות ספציפיות מקרופאג תכונות⁶, הכולל ב מערכת העצבים חשיפה מוגבלת נישא בדם גורמים שהעניק את מחסום הדם - מוח⁹.

מכשול אחד להבנת באופן מלא microglial תרומות CNS הומאוסטזיס ומחלות הוא הקושי של recapitulating מאפיינים מיוחדים של בוגרת מיקרוגלייה ראיתי ויוו עם תאים מטוהרים במבחנה. שיטות רבות פותחו כדי לבודד, תרבות מיקרוגלייה ללא פגע, אבל רוב הגישות להסתמך על סרום כדי לתמוך הישרדות cell. הראינו כי תוספת של סרום, אשר הוא ריאגנט מטבעו משתנה המכיל מגוון רחב של מולקולות ביו, בעייתית במיוחד כאשר עבודה עם מיקרוגלייה כי הוא מקדם של מורפולוגיה amoeboid, גדל התפשטות, ו phagocytosis מוגברת⁹ הנצפה לעתים קרובות vivo כאשר מיקרוגלייה נחשפים דם נישא גורמים לאחר ערעור מחסום הדם - מוח. על ידי מדדים אלה, תאים החשופים הנסיוב דומה מיקרוגלייה פציעה או מחלה, אבל שינויים כאלה מופחתים מתי מיקרוגלייה מתורבתים מדיום הגידול מוגדרים המכילים נוזל מוחי-שדרתי-1 (או איל-34), TGF-β, כולסטרול ו הסלנייט.

פרוטוקול זה מספק פרטים culturing עכברוש לנוער מיקרוגלייה בתנאים ללא סרום, הקשורים בעבודה שפורסם לאחרונה⁹. פרוטוקול זה התייעלה עבור חולדות מיום כמחנכת 21-30 (P21 - P30), אך ניתן להתאים כדי לבודד מיקרוגלייה של חולדות ועכברים בכל גיל, למרות התשואה ואת הכדאיות הכוללת ישתנו בהתאם מינים של גיל של החיה. התשואות מקסימלי ואת הכדאיות המיטבית מושגת כאשר משתמשים מעט ילדותית מיקרוגלייה (~ P9), עם תשואות הכדאיות בהדרגה אובליסק במידת מה רמות נמוכות יותר בבעלי חיים למבוגרים. מיקרוגלייה ניתן גם מבודד מן העכברים, אבל מצאנו כי תאים עכברוש להראות גבוה משמעותית בתשואות, הכדאיות ומורכבות של כחוד מורפולוגיות, בהשוואה לתאים העכבר בתרבויות ללא סרום. בעלי חיים בגיל גדול יותר P50 לא הוערכו עם פרוטוקול זה. הליך בידוד immunopanning מוטבה כדי למזער את השינויים בפרופילי תעתיק microglial במהלך בידוד, כדי למקסם את הכדאיות במורד הזרם של התאים. באמצעות טכניקות אלה ניסוחים מדיה, גבוהה-יכולת הקיום העיקרי תרבויות יכול להתקיים במשך שבועות. מיקרוגלייה תרבותי בתנאים אלה שהפגינו מורפולוגיה כחוד מאוד מעורבים הרחבה מהירה ו הכחשה של תהליכים, נמוכה יחסית המחירים של התפשטות. להדגיש את חשיבות סרום-חשיפה על מאפיינים אלה, ואנו נדבר על נקודות החוזק והחולשה של שיטה זו ביחס גישות אחרות.

פרוטוקול

בכל ההליכים הכרוכים מכרסמים תאמו הנחיות אוניברסיטת סטנפורד, העומדים בתקני הלאומי ואת חוקי המדינה ומדיניות. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי פאנל ניהול באוניברסיטת סטנפורד על מעבדה חיה על עצמך.

הערה: כל פתרון, מאגר של יצירות הינם מסופקים בכל טבלה של חומרים.

1. מכינים את צלחת פטרי עבור CD11b Immunopanning (יום 0)

הערה: להכין תבשיל immunopanning 1 המוח עכברוש ילדותי כל 1-2.

1. להוסיף מ 25 ל 50 מ"מ טריס pH 9.5 פתרון צלחת פטרי 15 ס מ.
2. להוסיף עז העכבר אנטי איג (H + L שרשראות) המנה עבור ריכוז סופי של 6 µg/mL. מערבולת צלחת לפיזור אחיד.
3. דגירה המנה עבור 1-3 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
4. יש לשטוף כלים שלוש פעמים עם DPBS⁺⁺ (באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עם Ca^{2 +} ו- Mg^{2 +}), לאחר מכן להחליף עם פתרון של גלילה רציפה מאגר המכיל 1 µg/mL נוגדן OX42. תשאירי את הכלים ללילה בטמפרטורת החדר על משטח שטוח.

2. רקמת אוסף (יום 1)

הערה: פרוטוקול זה צריך לקחת ~ 3-4 שעות.

1. לפני שאתחיל להבטיח שכל הפתרונות הם וסטרילי, צונן על קרח. להירגע כל הכלים על הקרח ולחטא עם אתנול לפני השימוש.
2. הפרוצדורות הבאות הרגולציה המתאימה, להקריב עכברוש מעבדה לנוער בעזרת פחמן דו-חמצני.
   הערה: לחלופין, חיים צעירים עלול להיות קורבן עם מנה קטלנית של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (100-200 µL של קטמין 24 מ"ג/מ"ל, חריגות השירותים הווטרינריים 2.4 mg/mL). קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים חייב לשמש אם בעלי החיים בגיל פחות מ- 14 ימים. אם משתמשים מרובים בעלי חיים, לחלץ את הרקמה חיה אחת והנח אותו לתוך צונן מראש DPBS⁺⁺ על הקרח לפני שתמשיך לבעלי עוקבות.
3. לצבוט hindpaw ולהבטיח את בעיית חוסר מוחלט מן החיה לפני שתמשיך.
4. Transcardially perfuse החיה עם 10-30 מ של המאגר הקר זלוף באמצעות מחט 27½-G עד מאגר רץ ברורה.
   הערה: נפח של מאגר זלוף משתנה בהתאם הגודל/גיל של החיה.
5. מיד לאחר זלוף להסיר את הראש של החיה. . מגיעים חוט השדרה לחתוך בעצם העורפית בכל צד עם מספריים לנתיחה, יש להיזהר לא נזק למוח. לאחר חיתוך צד לחתוך בזהירות, צד אחד לאורך דופן בקיבה, עצם המצח לכיוון עצם האף. עם מלקחיים בקפידה לסגת העליון של הגולגולת במהירות להסיר את המוח (או מבנים CNS עניין), מניחים מראש צוננת DPBS⁺⁺ על הקרח.
6. חזור על כל בעלי החיים הנותרים.
   הערה: כל השלבים בהליך צריכה להתבצע בתוך תא למינארי בתנאים סטריליים ראויים.

3. מכני דיסוציאציה (יום 1)

1. לאחר שנאסף כל המוח, קוצצים מח אחד לתוך 1 מ³ נתחים בצלחת פטרי על הקרח עם להב קר אזמל ולאחר להעביר מהמגן דאונס קר כקרח עם המאגר הקר douncing 5-7 מ. מביצועם מח אחד בכל פעם.
2. מביצועם הרקמה באמצעות קווים עדינים ולא שלמים 10-20 עם מהמגן דאונס רופפים. הקפידו לא ישירות למחוץ את הרקמה בתחתית מהמגן, אך במקום זאת מאלצים את הרקמות בחלל בין צידי הבוכנה מהמגן.
3. הסר בזהירות את הבוכנה כדי למנוע את כניסתה של בועות אוויר. לאפשר הפומבית לקוי רקמת נתחים להתיישב לתחתית מהמגן, להעביר את תגובת שיקוע צוננת 50-mL חרוט צינור.
4. החלף את אמצעי האחסון שהוסר מאגר douncing טריים, וחזור על הצעדים 3.2 ו- 3.3 עבור סכום כולל של 3-4 סיבובים, או עד רקמות כל חלופה מועדפת. חזור על התהליך עבור כל המוח.

4. מיאלין להסרת (יום 1)

הערה: הסרת המיאלין משמש עבור בידוד של מיקרוגלייה מחיות שגילם P12.

1. למדוד את עוצמת הקול של התליה תא בצינור חרוט 50-mL באמצעות פיפטה 25 מ ל ולאחר מכן להוסיף מאגר douncing קר כקרח כדי לכוונן את העוצמה הכוללת 33.5 מ.
2. להוסיף 10 מ ל מאגר ההפרדה מיאלין (MSB) תא ההשעיה, לערבב ביסודיות על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. התוצאה תהיה 23% הסופי ריכוז MSB באמצעי אחסון של 43.5 מ.
3. צנטריפוגה תאים למשך 15 דקות ב 500 g x ב 4 ° C עם בלימה איטי.
   הערה: לצנטריפוגה צריך לקחת כ- 1.5-2 דקות כדי להאט. פעולה זו תיצור רובד גבוה של מיאלין, שאריות תאים מתים, תגובת שיקוע מנוסתם של גלולה קטנה יותר זה מועשר עבור תאים חיים.
4. להסיר את השכבה העליונה של המיאלין/פסולת, את תגובת שיקוע עם פיפטה. יש להיזהר בעת הסרת השכבה העליונה כדי להבטיח הרבה ממנו הוסר ככל האפשר.
5. Resuspend בגדר תא ב 12 מ של מאגר גלילה רציפה. בעדינות triturate התליה תא כדי לשבור את כל גושים של תאים שאולי נותרו.

5. Immunopanning (יום 1)

1. עוברים התליה תא מסננת תא 70-מיקרומטר להסרת פסולת גדולה או תא גושים.
2. יש לשטוף את הצלחת השתוותם מצופים OX42 שלוש פעמים עם DPBS⁺⁺. אל תאפשר את הצלחת עד יבש לחלוטין בין שוטף.
3. יוצקים את כביסה DPBS⁺⁺ האחרון ולהחיל התליה תא מסוננים השתוותם למנה. בעדינות מערבולת את הצלחת להפיץ את התאים ולאחר מכן דגירה את הצלחת על משטח שטוח בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות לאפשר תאים לדבוק. דגירה לא יותר מ 20 דקות או תאים יהיה קשה מאוד לשחזר המנה.
4. לשטוף את הצלחת פנורמית עם DPBS⁺⁺ 10 פעמים כדי להסיר תאים שאינם מחסידי. מיקרוגלייה יהיה מחובר היטב לצלחת, אז מערבולת לצלחת עם כל שטיפה כדי להבטיח הסרה של תאים שאינם מחסידי אחרים.
5. יוצקים את כביסה DPBS⁺⁺ האחרון והחלף 15 מ"ל DPBS⁺⁺ וμl 200 טריפסין (פתרון 1.25% מניות).
6. דגירה המנה ≤10 דקות ב 37 ° C עם 10% CO₂ כדי trypsinize.
   הערה: אל תמשיך יותר מ 10 דקות או מיקרוגלייה יהפוך קשה להסיר.
7. לאחר 10 דקות של trypsinization, עדיין יהיה תקוע מיקרוגלייה לצלחת. יוצקים את טריפסין/DPBS⁺⁺ ולשטוף בעדינות 2 x עם DPBS⁺⁺ כדי להסיר טריפסין, החלף 12 מ של מדיום הגידול מיקרוגלייה כקרח (MGM).
8. המקום panning המנה בקירור למשך 2 דקות כדי לעזור להחליש את המצע תא/אינטראקציה, וודא כי המנה הוא שטוח כדי למנוע תחומי המנה השתוותם מתייבשת.
9. פיפטה נמרצות עם 10-mL פיפטה, pipet בקר על מהירות גבוהה להתאושש תאים המנה פנורמית. שואבים רשת 16 x 16 עם הזרם של נוזל פיפטה ואנסה להסיר כל התאים.
10. בדוק תאים במיקרוסקופ בהגדלה X 20 כדי לוודא תאים יש מנותקת צלחת. מארק כתמים על המנה שבו תאים עדיין תקוע, אני חוזר pipetting באזורים אלו.
11. לאסוף את ההשעיה תא aliquot מ ל 3-4 של תגובת שיקוע למחזור חרוט 15-mL. ספין למשך 15 דקות ב 500 g x ב 4 ° C עם בלימה איטי.
    הערה: ספינינג מיקרוגלייה דרך אמצעי אחסון קטן מאפשר התאוששות מקסימלית של תאים.
12. תשאף את תגובת שיקוע, עוזב 0.5 מ של MGM עם בגדר תא.
13. Resuspend כל גלולה ב- MGM הנותרים, בריכה תאים מן כל הקברים.
14. ספירת תאים עם hemocytometer.
15. צלחת תאים כפי שמתואר שלבים 6 - 7 בהתאם ליישום.
16. התרבות תאים ב 37 ° C עם 10% CO₂.
    הערה: תאים יכול להיות תרבות עד 3-4 שבועות עם שינויים מדיה רגיל או שבוע אחד ללא שינויים מדיה.

6. במקום ציפוי תרביות רקמה צלחות/Coverslips (יום 1)

1. צלחת 15 µL של קולגן הרביעי ציפוי ישירות במרכז צלחת 24-טוב anionic/cationic תרביות רקמה מצופה (לפרטים, ראה טבלה של חומרים ) דגירה למשך 15 דקות ב 37 ° C עם 10% CO₂.
2. לאחר ספירת תאים עם hemocytometer לדלל לתאים 2.3 x 10 /mL⁵ב- MGM. האחות קולגן הרביעי במקום, מיד צלחת 15 µL תא השעיה במקום הזה; זה ייתן 3.5 x 10³ תאים/נקודה. תקופת דגירה של 5-10 דקות ב 37 ° C ב- 10% CO₂ כדי לאפשר תאים לדבוק, להוסיף 500 µL של CO_{2 -}equilibrated TGF-β2/IL-34/כולסטרול המכילים מדיום הגידול (טיק) בעדינות אל הבאר.
3. אם ציפוי על coverslips, הראשון המעיל סטרילי coverslips זכוכית דקה עם 10 µg/mL ploy-D-ליזין (PDL) H₂O עבור h 1-RT, לשטוף 3 פעמים עם H₂O, ותנו יבש בשכונה תחת אור UV. לאחר coverslips יבש, להמשיך עם ציפוי ספוט על coverslips כמתואר ב- 6.2 שלב.

7. ציפוי לבידוד RNA/חלבון

1. יום 1, המעיל כל שטח 24-טוב anionic/cationic מצופה תרביות רקמה צלחת עם ציפוי הרביעי קולגן, דגירה במשך 10 דקות - 1 h ב 37 ° C ב- 10% CO₂, ולאחר מכן להסיר, מיד צלחת 3-5 x 10⁴ תאים/טוב CO₂ equilibrated טיק מדיה.
2. יום 2, לבצע שינוי מדיה 50% עבור כל טוב יום אחרי ההכנה. תאים מתים נוטים אשכול במרכז של הבאר, אז קחו מדיה משם.
3. לבצע שינוי 50% מדיה כל 2-3 ימים כדי לשמור על התרבויות. אם שינויים מדיה אציג משתנה לא רצויות על התרבויות, תאים יכולים לשרוד במשך כ שבוע ללא שינויים מדיה, לעומת מעל 3 שבועות עם תחזוקה שוטפת.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי מיקרוגלייה טוהר גבוהה כחוד תרבות של חולדות לנוער. תוצאות דומות ניתן להשיג באמצעות בעלי חיים ילדותית, הלידה, למבוגרים, כפי שמתואר להלן. מאז תא ומשום כוללים לעיתים קרובות בניואנסים, הזדמנויות רבות עבור תאים למות, השתמשנו בקרת איכות מחסומים כדי לקבוע להצלחה בכל השלבים השונים. אנחנו בדרך כלל פיקוח תא המתלים. באמצעות hemocytometer של מספר השלבים בפרוטוקול בידוד (איור 1 א'). ומשום מוצלחת אמור להניב 2.5-5 x 10⁵ תאים/לנוער בעלי חי...

דיון

כיוון מיקרוגלייה לשמש תאים חיסוניים הפלאג של מערכת העצבים, הן מאוד קשוב לשינויים סביבתיים; לכן, זהירות רבה נדרשת כדי למזער את תגובות דלקתיות בתוך התאים במהלך הבידוד שלהם ואת התרבות⁸. זו מושגת ב פרוטוקול זה דרך טמפרטורה ומהירות. שמירה על התאים על קרח או ב 4 ° C בכל האפשר מקטינה באופן משמעותי ההפעלה, אז כל השלבים צנטריפוגה יתקיים ב 4 ° C, החיות הן perfused עם מאגר זלוף קר כקרח, הפרוטוקול התייעלה כדי למזער את הזמן בין רקמות חילוץ, culturing של התאים. אם הערכת דפוסי ביטוי גנים של תאים בודדים טרי, לקצו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חולדה: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
עכבר נגד חולדות CD11b חד שבטי (שיבוט OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	פאנינג: 1:1,000; צביעה: 1:500
עז פוליקולונל אנטי-IBA1	Abcam	Cat# AB5076	צביעה: 1:500
ארנב פוליקלונלי אנטי-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	צביעה: 1:500
Alexa Fluor Donkey נגד עכבר 594	Invitrogen	Cat# 11055	מכתים: 1:500
Alexa Fluor Donkey נגד עזים 488	Invitrogen	Cat# A-21203	צביעה: 1:500
Alexa פלואור חמור נגד ארנב 647	Invitrogen	Cat# A-31573	מכתים: 1:500
Triton-X (חומר ניקוי בצביעה ICC)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen ציוד מעבדה	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
פפטון ממוצקי חלב	סיגמא	Cat# P6838
TGF-β 2	Peprotech	Cat# 100-35B
עכברים IL-34	R& D Systems	Cat# 5195-ML/CF
כולסטרול צמר בקר	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
קולגן IV	Corning	Cat# 354233
חומצה אולאית	קיימן כימיקלים	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) חומצה	קיימן כימיקלים	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
פניצילין / סטרפטומיצין	ג'יבקו	חתול # 15140-122
גלוטמין	גיבקו	חתול# 25030-081
N-אצטיל ציסטאין	Sigma	Cat# A9165
אינסולין	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
נתרן סלניט	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (גלוקוז גבוה)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
פולי-די-ליזין	Sigma	Cat# A-003-E
צלחות פרימריה	VWR	Cat# 62406-456
שם	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
>ריאגנטים למלאי
אפו-טרנספרין			בנייה מחדש: 10 מ"ג/מ"ל ב-PBS ריכוז בשימוש: 1:100 אחסון: -20° C
N-אצטיל ציסטאין			בנייה מחדש: 5 מ"ג/מ"ל ב-H2O ריכוז בשימוש: 1:1,000 אחסון: -20° C
נתרן סלניט			בנייה מחדש: 2.5 מ"ג/מ"ל ב-H2O ריכוז בשימוש: 1:25,000 אחסון: -20° C
קולגן IV			בנייה מחדש: 200 μ גרם/מ"ל ב-PBS ריכוז בשימוש: 1:100 אחסון: -80° C
TGF-b2			בנייה מחדש: 2 מ"ג/מ"ל ב-PBS ריכוז בשימוש: 1:1,000 אחסון: -20° C
IL-34			Reconstitution: 200 μ גרם/מ"ל ב-PBS ריכוז בשימוש: 1:1,000 אחסון: -80°
C כולסטרול			בנייה מחדש: 1.5 מ"ג/מ"ל ב-100% אתנול ריכוז בשימוש: 1:1,000 אחסון: -20° C
Heparan sulfate			Reconstruction: 1 מ"ג/מ"ל ב-H2O ריכוז בשימוש: 1:1,000 אחסון: -20° C
חומצה אולאית/חומצה			: גונדואית: 0.001 מ"ג/מ"ל; אולאית: 0.1 מ"ג/מ"ל ב-100% אתנול ריכוז בשימוש: 1:1,000 אחסון: -20° C
Heparin			Reconstruction: 50 מ"ג/מ"ל ב-PBS ריכוז בשימוש: 1:100 אחסון: -20° C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions  מתכון
חיץ			: 50 μ g/mL heparin ב-DPBS++ (PBS עם Ca++ ו-Mg+ +) הערות: השתמש כאשר
		דונקינג	: 200 μ L של 0.4% DNaseI ב-50 מ"ל של DPBS++ הערות: השתמש כאשר
		פאנינג	: 2 מ"ג/מ"ל פפטון ממוצקי חלב ב-DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			מתכון: DMEM/F12 המכיל 100 יחידות/מ"ל פניצילין, 100 μ גרם/מ"ל סטרפטומיצין, 2 מ"מ גלוטמין, 5 ו-mu; גרם/מ"ל N-אצטיל ציסטאין, 5 μ גרם/מ"ל אינסולין, 100 μ גרם/מ"ל אפו-טרנספרין, ו-100 ננוגרם/מ"ל נתרן סלניט הערות: השתמש ב-MGM קר כקרח כדי להוציא מיקרוגליה מכלי אימנופאנינג.
לציפוי			: MGM המכיל 2 μ מתכון
		הפרדת מיאלין	קולגן: 9 מ"ל פרקול פלוס, 1 מ"ל 10x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2 הערות: מערבבים היטב לאחר הוספת   CaCl2 ו-MgCl2
TGF-b2/IL-34/כולסטרול המכיל מצע גדילה (TIC)			מתכון: MGM המכיל 2 ננוגרם/מ"ל TGF-b2 אנושי, 100 ננוגרם/מ"ל עכברים IL-34, 1.5 μ גרם/מ"ל כולסטרול צמר עברים, 10 μ גרם/מ"ל הפראן סולפט, 0.1 μ גרם/מ"ל חומצה אולאית, ו-0.001 μ גרם/מ"ל חומצה גונדואית הערות: הקפידו להוסיף כולסטרול למצע שחומם ל-37 מעלות; C ואל תוסיף יותר מ-1.5 μ גרם/מ"ל או שהוא ישקע החוצה. אין לסנן מדיה המכילה כולסטרול. אזנו את מדיית ה-TIC עם 10% CO2 למשך 30 דקות עד שעה לפני הוספתם לתאים כדי להבטיח pH אופטימלי.

צמר בקר גונדואית זלוףמתכון מאגר קר כקרחמתכון חיץ קר כקרחמתכון קולגן IVחיץ קולגן IV