מאמר שיטה

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DOI:

10.3791/57146

⸱

30 באפריל 2018

 ,  ,  ,  , 
1Cell Cycle and Cancer Biology Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג זברה שימשו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA במהלך הפיתוח. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש דג זברה העוברים של פרופיל שכפול תזמון. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד שכפול תזמון מוטציות, סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה ו מינים אחרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תזמון שכפול ה-DNA הוא מאפיין חשוב הסלולר, מפגין יחסים משמעותיים עם הכרומטין, שעתוק DNA מוטציה המחירים. מתרחשים שינויים בתזמון שכפול במהלך התפתחות של סרטן, אבל העיתוי שכפול תפקיד ממלא בהתפתחות, המחלה לא ידוע. דג זברה הוקמו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד שכפול תזמון. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש של דג זברה כדי לקבוע תזמון שכפול ה-DNA. לאחר מיון תאי העוברים, דג זברה למבוגרים, ניתן לבנות דפוסי תזמון שכפול DNA הגנום כולו ברזולוציה גבוהה על-ידי קביעת שינויים מספר עותק DNA בעזרת ניתוח של נתונים רצף ' הדור הבא '. דג זברה מודל המערכת מאפשרת הערכה של השינויים תזמון שכפול להתרחש ויוו במהלך ההתפתחות, והוא יכול לשמש גם כדי להעריך שינויים סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה או הקווים המוטנטים. שיטות אלה יאפשרו מחקרים חוקרת את מנגנוני ואת גורמים של שכפול עיתוי הקמה, אחזקה במהלך הפיתוח, העיתוי שכפול תפקיד ממלא מוטציות tumorigenesis, ואת ההשפעות של perturbing תזמון שכפול על פיתוח ומחלות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור תאים לחלק בהצלחה, הם חייבים קודם בדייקנות ובנאמנות לשכפל את הגנום כולו שלהם. שכפול גנום מופיעה תבנית לשחזור, המכונה תוכנית1תזמון שכפול ה-DNA. תזמון שכפול ה-DNA הוא מתואם עם כרומטין הארגון, סימני epigenetic ג'ין ביטוי2,3. שינויים בתזמון שכפול להתרחש במהלך הפיתוח, ויש תוכניות באופן משמעותי הקשורים תעתיק והשינויים סימני כרומטין, ארגון4,5. יתר על כן, שכפול התזמון הוא מתואם עם תדרים mutational, שינויים בתזמון שנצפו בסוגים שונים של סרטן-6,-7,-8. למרות ההבחנות הללו, מנגנונים של גורמים של שכפול עיתוי הקמה ורגולציה ידועות עדיין במידה רבה, התפקיד אותו ממלא בהתפתחות ואת המחלה הוא לא נקבע. בנוסף, עד לאחרונה שכפול הגנום כולו עיתוי השינויים המתרחשים במהלך פיתוח חוליות רק נבדקו במודלים התרבות תאים.

דג זברה, רזבורה rerio, מתאימים היטב לימודים שכפול תזמון ויוו במהלך הפיתוח, כמו זוג ההזדווגות יחיד ניתן תשואות של מאות העוברים המתפתחים במהירות עם קווי דמיון רבים יונקים פיתוח9, 10. יתר על כן, במהלך פיתוח דג זברה, ישנם שינויים מחזור התא, כרומטין הארגון ותוכניות תעתיק החולקות קשרים עם תזמון שכפול הדנ א11. דג זברה הם גם מודל גנטי מעולה, כפי שהם נתונות במיוחד למניפולציות של transgenesis, מוטגנזה מכוונת, מוטציות יישוב, מסכי גנטי זיהו גנים רבים הדרושים עבור פיתוח חוליות12. לכן, דג זברה יכול לשמש לזיהוי גנים המעורבים שכפול עיתוי הקמה, אחזקה, כדי לבחון את ההשפעות של deregulating שכפול תזמון על פיתוח חוליות. קווים הטרנסגניים יכול לשמש גם כדי להעריך את תזמון שכפול של סוגי תאים בודדים מבודדת timepoints התפתחותיים שונים או בתנאים המחלה. חשוב, ישנם מודלים שונים דג זברה של מחלות אנושיות יכול לשמש כדי לחקור את התפקיד של שכפול תזמון המחלה היווצרות והתקדמות9,13,14.

לאחרונה, הפרופילים תזמון שכפול הראשון היו להפיק של דג זברה, ביסוס זה כמערכת מודל ללמוד שכפול עיתוי ויוו15. כדי לעשות זאת, תאים נאספו מעוברים דג זברה-בשלבים רבים של פיתוח, בסוג תא מבודד דג זברה למבוגרים. התאים היו אז לפי FACS (תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון) בהתבסס על תוכן ה-DNA כדי לבודד אוכלוסיות שלב G1 ו- S. באמצעות המדגם G1 כפקד מספר עותק, העתק מספר וריאציות בשלב S אוכלוסיות היו נחושים ומשמש להסיק שכפול היחסי תזמון16. שינויים בתזמון שכפול ניתן לאחר מכן ישירות להשוות בין סוגי תאים ודוגמאות התפתחותיים שונים, זה שימש לקביעת שינויים בתזמון שכפול המתרחשים ויוו במהלך פיתוח חוליות. שיטה זו מציעה כמה יתרונות על פני שיטות אחרות גנומית, בעיקר כי זה לא דורש תיוג עם תחליפי תימידין או immunoprecipitation של ה-DNA4,6.

. זה מפורט הפרוטוקולים של הגנום כולו פרופיל DNA שכפול תזמון-ברזולוציה גבוהה בדג זברה. פרוטוקולים אלה שימשו לקביעת יחסים עם תכונות גנומית של epigenetic הגנום דג זברה, כמו גם יצירת פרופיל שינויים ביחסים אלו שמתרחשות במהלך הפיתוח. פרוטוקולים אלה בקלות גם מותאמים ללמוד שינויים בתזמון שכפול זנים מוטציה של דג זברה, במודלים של המחלה. בנוסף, שיטות אלה מספקים בסיס ניתן להרחיב על ללמוד שכפול תזמון סוגי תאים ספציפיים, על-ידי מיון הראשון החוצה את סוגי תאים בודדים מ דג זברה. דג זברה יכול לשמש כמערכת מעולה ויוו דגם ללמוד שכפול תזמון וכדי לחשוף בסופו של דבר בפונקציות ביולוגיות של תכונה epigenetic חשובה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל החיות שטופלו בהתאמה קפדנית עם פרוטוקולים אושרה על ידי אוקלהומה מחקר קרן מוסדיים חיה טיפול רפואי לשימוש הוועדה.

1. הגדרת דג זברה בוגרת לגידול

  1. השתמש קבוצה גדולה של דג זברה זכר ונקבה בוגרים של זן יחיד לגידול. ישנם הבדלים קטנים במבנה הגנטי של דג זברה של אפילו זן יחיד, השתמש עמית גדולים כדי להבטיח תוצאות יהיו נציג של השונות הגנטית באוכלוסייה, לא מוגבל תת קבוצה קטנה של האוכלוסייה.
  2. בלילה לפני העוברים ייאספו, למקם את עשרות מבוגרים רבייה רבייה טנקים, להשתמש במספרים שווים בקירוב של זכרים ונקבות. בהתאם הניסוי, להשתמש באסטרטגיות רבייה הבאות.
    1. רבייה אסטרטגיה 1: במקום כמה דג זברה זכר ונקבה במיכלים גידול בודדים, להפריד בין הזכרים לבין הנקבות עם מחיצה. אם נעשה שימוש בגישה זו, הגדרת טנקים רבייה שונים רבים, בריכה העוברים מכל אחת כדי להבטיח ההשתנות הביולוגי מייצג של האוכלוסייה.
    2. רבייה אסטרטגיה 2: לשלב עשרות דג זברה זכר ונקבה במיכל גדול הרבייה. להשתמש באסטרטגיה זו כל עוד ישנם מספר גדול מספיק של העוברים, סביר להניח באו ממגוון רחב של המייסדים והם ולכן נציג גנטית של האוכלוסייה.

2. matings - איסוף, מיון, דיור דג זברה עוברי לניסויים מתוזמן

  1. לבצע matings מתוזמן, מתחיל ברגע האור מחזורי להיות בבוקר. למחוק את כל העוברים שנוצרו בין לילה.
  2. לאפשר הדגים מתרבים במים רדודים (3-5 ס מ) לתקופה של 10 דקות, עם תחתית כפולה עבור עוברי לברוח דרך.
  3. לאחר 10 דקות, לאסוף העוברים על ידי מזיגת דרך מסננת ושטיפה לתוך צלחת 10-ס מ עם בקבוק שטיפה. בריכה כל העוברים שנאספו בנקודת זמן זהה, לסמן אותם עם הזמן אוסף, ומקום מיד בתוך אינקובטור ב- 28.5 ° C.
  4. מאות עוברי ניתן לצפות מן זוג ההזדווגות אחת ביום. לאפשר מבוגרים להתרבות תוך עשר דקות מחזורים עד מספר העוברים שהושג הוא פחות מ-20.
  5. כ 1-1.5 h לאחר איסוף, מיון עוברי להסיר את העוברים מופרית ומתה. כדי למיין את העוברים, להסיר מן החממה ולצפות תחת מיקרוסקופ ויבתר.
    1. ספור עוברי ומניחים על צפיפות של עוברי 100 לכל צלחת 10 ס מ.
    2. להוסיף E3 טריים בינונית (5 מ"מ NaCl, מ"מ 0.17 אשלגן כלורי, 0.33 מ מ CaCl2, 0.33 מ מ MgSO4) וחוזרים עוברי החממה 28.5 ° C.

3. Dechorionate, deyolk, ולתקן את העוברים דג זברה

הערה: סעיף זה של הפרוטוקול מיועד העוברים לפני 48 שעות שלאחר ההפריה (hpf). אין צורך להסיר את chorions של העוברים בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות (לאחר 48 hpf), כפי שהם נופלים לעתים קרובות באופן טבעי. אין צורך deyolk או להסיר את chorions של דגים בוגרים 5 הימים פוסט הפריה (dpf).

  1. כאשר עוברים מגיעים לגיל ההתפתחותי הרצוי, לוודא המתאים התפתחות מורפולוגית תחת מיקרוסקופ אור על פי "שלבים של עובריים פיתוח של דג זברה"17.
  2. העברת העוברים בשלבים עד 1500 ל צינור חרוטי 15-mL ולשטוף מספר פעמים עם E3.
    1. להוסיף 1 מ"ל של E3 ו µL 20 Pronase פתרון (30 מ"ג/מ"ל) עבור כל העוברים 100 ו מערבולת בעדינות. עד 1500 עוברי ניתן dechorionated צינור יחיד עם 15 מ"ל של E3.
    2. להניח צינור על צידה, לארגן העוברים בתוך שכבת אפילו כדי להבטיח השטח המרבי יחס נפח. בעדינות להתסיס צינור כל 2-3 דקות עד chorions כל נפל ממני העוברים. הזמן הכולל dechorionation משתנה בהתאם לפעילות Pronase.
  3. להסיר את תגובת שיקוע ולשטוף בעדינות את העוברים 3 פעמים עם 10 מ"ל של E3. במקום העוברים על קרח למשך שארית סעיף זה של הפרוטוקול.
  4. להסיר את E3 ולשטוף העוברים עם מאגר הטרי deyolking קר כקרח (0.5 x פתרון גינזבורג דגים רינגר, ללא סידן: 55 מ"מ NaCl, 1.8 מ"מ אשלגן כלורי, 1.25 מ"מ NaHCO3).
    1. להוסיף 1 מ"ל של המאגר הקר deyolking עבור עוברי עד 500.
    2. שימוש של P1000, בעדינות פיפטה עוברי למעלה ולמטה 5 - 10 פעמים כדי לשבש את שק החלמון.
    3. להעביר 1 מ"ל 1.5 mL microfuge ובשעות צנטריפוגה-4 ° C ו- 500 x g במשך 5 דקות.
  5. הסר גלולה supernatant, תשטוף עם 1 מ"ל של PBS קר כקרח x 1 (buffered פוספט תמיסת מלח, pH 7.0) כדי להסיר את תמיסת רינגר. צנטריפוגה ב 4 ° C ו- g x 500 במשך 5 דקות.
  6. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאים 1 מ"ל של PBS 1 x. במקום הצינור על קרח.
  7. להוסיף 3 מ"ל של אתנול כקרח (EtOH) צינור חרוטי 15-mL. מערבולת של צינור EtOH בעדינות על הגדרה נמוכה.
    1. שימוש של P1000, לאט לאט (טיפה 1 לשניה) טפטוף דג זברה העובר תא ההשעיה לתוך EtOH בעת vortexing בעדינות.
    2. להוסיף סכום של 1 מ"ל של התליה תא העובר, הפתרון הסופי קיבוע של 75% EtOH.
  8. לאחר 1 מ"ל של תא ההשעיה נוספה, בעדינות מערבולת צינור כדי לערבב מקום ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה. מומלץ למקם את הצינורות בצד שלהם כדי להבטיח השטח המרבי יחס נפח ולהפחית את מספר העוברים ואת התאים ביחד. חנות תאים עובריים ב-20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שבועות.

4. צביעת DNA ו FACS מיון עוברי

הערה: סעיף זה של הפרוטוקול מיועד עוברי-1 dpf.

  1. להסיר תאים עובריים EtOH-קבוע-20 ° C, צנטריפוגה ב g 1500 x 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    1. במקום הצינור על קרח, בזהירות הסר תגובת שיקוע. שימוש של P1000, resuspend בעדינות תאים 1 מ"ל של טריות קר PBS-BSA (1 x PBS, אלבומין פרה 1%).
    2. צנטריפוגה תאים על 4 ° C ו- g x 1500 למשך 5 דקות ומניחים על קרח.
  2. הסר תגובת שיקוע, resuspend תאים propidium יודיד (PI) צביעת פתרון (µg 50/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7.0), שימוש 200 µL עבור כל העוברים 1000.
    1. מאפשרים לתאים דגירה בפתרון PI למשך 30 דקות בקרח, בעדינות ערבוב כל 5 דקות.
    2. מניחים מסננת תא ניילון 40 µm על צינור חרוטי 50-mL על קרח. בעדינות פיפטה תאים כדי לערבב, לסנן דרך רשת השינוי.
      הערה: אם הצינורות מרובים של העוברים מן timepoint באותה נאספו בסעיף 3 של הפרוטוקול, לשלב אלה העוברים בשלב הזה כך הן כל ממוינות ביחד.
    3. שימוש בדירה בתוך סוף פומפה מזרק, בעדינות לשבש כל הנותרים גושים של תאים על רשת השינוי.
    4. לשטוף התאים דרך המסנן עם 500 µL של PBS קר-BSA עבור כל העוברים 1000.
    5. מיקום רשת 40-מיקרומטר מעל צינור חרוטי 15-mL על קרח ולסנן התליה תא מהצינור חרוט 50-mL בפעם השנייה לתוך הצינור 15-mL.
  3. באמצעות תא המתאים מיון כלי נגינה, הגדר את עירור לייזר זיהוי 561-nm, פליטה ל- 610/20 כדי לזהות propidium יודיד.
    1. לערבב 15 מ"ל שפופרת של תאים מוכתם בקצרה על-ידי vortexing ומקום בייצור מכשירים ב 4 º C.
    2. להפעיל תאים על זרם איטי קצב, אידיאלי 1.0 מ"ל לדקה, על מנת לקבל פרופיל נקיים מחזור התא, הימנעות מערבוב G1 או G2/M תאים עם ה-S שלב האוכלוסייה.
    3. שער ראשון, עבור x SSC FSC-A-(פיזור קדימה אזור על-ידי פיזור מצידו) כדי להסיר את פסולת (איור 1 א').
      הערה: תאים מן העוברים יכול להיות משתנה גדלים בהתאם לסוג התא והבמה. המסנן דחיסות נייטרלית (ND) ייתכן שיהיה צורך להחליף בין 1.0 ל- 1.5 בהתאם לגודל כדוריות. שער אזור גדול לאיסוף רוב התאים של הסרת לכלוך.
    4. השער השני, עבור האס-אזור (האס-A) לפי PI-אזור (PI-A), כדי להסיר את הלכלוך ותא doublets (איור 1B).
    5. שלישית, שער עבור האס-A על ידי האס-W (רוחב) כדי להסיר את כל doublets תא הנותרים (איור 1C).
  4. להציג את אוכלוסיית מגודרת היסטוגרמה עם מספר הטלפון הנייד (ספירה) על האזור יודיד-y ואת propidium (PI-A) בציר ה-x. עבור עוברי hpf 24, זה אמור לתת פרופיל מחזור התא סטריאוטיפי כמו דמות 1D.
    1. כדי למיין את האוכלוסייה שלב S, להגדיר את השער מצד ימין של הפסגה G1 בצד שמאל של הפסגה G2, כולל רק כמות מזערית של אוכלוסיות G1 ו G2. עבור עוברי hpf 24, זה תכלול בדרך כלל כ- 10-15% מהאוכלוסייה מגודרת (ראה איור 1D).
    2. כדי למיין את האוכלוסייה G1, להגדיר את השער בצד שמאל של הפסגה G1, לא להעביר בראש הפסגה. להתאים את רוחב השער G1 כמו צר ככל האפשר (ראה איור 1D).
    3. חזרה לשער ה-G1 ואוכלוסיות שלב S כדי להבטיח נאות הראשונית חסימה (איור 1E).
  5. למיין את אוכלוסיות שלב G1 ו- S לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל עם 3 מ ל PBS-BSA. המטרה צריכה להיות כדי להשיג בין 500,000 ו 1 מיליון או יותר תאים ממוינים לפי שבר (שלב G1 ו- S).
  6. לאחר מיון הושלמה, צנטריפוגה צינורות-1500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: בגדר תא קטן יהיה קשה לראות וזה חשוב למנוע שיבוש זה, כך להשתמש רצוי רוטור דלי מתנדנדים מעל הרוטור קבוע-זווית.
  7. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend גלולה עם 1 מ"ל של PBS 1 x. להעביר תאים 1.5 mL microfuge ובשעות צנטריפוגה ב 6,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  8. להסיר את כל הנוזל מהצינור ובזהירות להקפיא יבש גלולה ב-20 ° C. חנות בגדר ב-20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שבועות.

5. DNA בידוד, RNase וטיפול, טיהור DNA

  1. הסר תא צניפה-20 ° C ומקום על קרח.
    1. להוסיף 400 µL מאגר מרחביות (50 מ מ טריס-HCl (pH 8.0), 10 מ מ EDTA, 1 M NaCl, 0.5% מרחביות) גלולה, resuspend.
    2. להוסיף proteinase K ריכוז סופי של 0.2 מ"ג/מ"ל ומערבבים בקצרה על-ידי vortexing.
    3. דגירה בדגימות ב 56 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, מערבולת כל 15 דקות.
  2. לאחר 2 h, לבצע חילוץ פנול-כלורופורם על-ידי הוספת µL 400 של פנול-כלורופורם (אלכוהול פנול: כלורופורם: Isoamyl 25:24:1, רווי 10 מ מ טריס, pH 8.0, 1 מ"מ EDTA).
    1. מערבולת עבור מדגם s וצנטריפוגה 20 ב g 16,000 x עבור 5 דקות להפריד בין שלבים.
    2. בזהירות להסיר את פאזה מימית העליון (400 µL) העברת צינור 1.5 מ.
  3. לבצע משקעים EtOH על-ידי הוספת µL 40 של 3 מ' סודיום אצטט (pH 5.2), 2 µL של גליקוגן, 1 מ"ל של EtOH.
    1. מערבולת כדי לערבב ביסודיות במקום ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כדי לזרז את הדנ א. גם יכול להיות זירז מדגם ב-80 מעלות צלזיוס, או על קרח יבש לשעה.
    2. . דגימת צנטריפוגה-4 ° C ו- g x 16,000 למשך 30 דקות ל- DNA גלולה
    3. ביטול supernatant, תשטוף גלולה עם 1 מ ל 70% EtOH. צנטריפוגה ב 4 ° C ו- g x 16,000 במשך 5 דקות.
    4. למחוק את supernatant ואת air-dry צנפה בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות.
  4. להמיס גלולה ב 96 µL של מים בלוק, ולהוסיף 4 µL של RNase A (2 mg/mL).
    1. מערבבים היטב בעזרת vortexing, דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
  5. מבצע החילוץ פנול-כלורופורם על-ידי הוספת µL 100 של פנול-כלורופורם, ההליך הבא בשלבים 5.2.1 - 5.2.2.
  6. בצע למשקעים EtOH על-ידי הוספת 10 µL של 3 מ' סודיום אצטט, גליקוגן µL 1 µL 250 EtOH, בעקבות ההליך בשלבים 5.3.1 - 5.3.5.
  7. Resuspend צנפה ב- 60 µL טה מאגר (10 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0), EDTA 10 מ מ (pH8.0)) ולקבוע את ריכוז הדנ א באמצעות שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית כמותית. מאגר ה-DNA ב-20 ° C.
    הערה: חשוב לכמת הדנ א באמצעות צבע מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית איגוד ה-DNA, או אמצעים אחרים יותר אמין מאשר שיטות מבוססות-ספקטרומטר UV.

6. הכנת ספריות DNA ורצף הדור הבא

הערה: G1 עותק מספר הפניה מדגם עבור כל מקור ביולוגי נדרש עבור כל הפעלה רצף (קרי WT, מוטציה, מהונדס, תא קו, וכו '). השווה בין כל שלב S דוגמאות מאותו מקור ביולוגי ב רצף זהה נוסעות אסמכתא G1 זהה. הפעל משכפל ביולוגית לפחות שני של כל דגימה כדי להבטיח עקביות בין הדגימות.

  1. למהול 1 µg של ה-DNA לאמצעי הסופי של 50 µL, העברת צינור מיוחד עבור sonication.
  2. להטות דנ א גנומי יעד של 250-300 bp ב ultrasonicator ממוקד, על פי מפרט היצרן פרוטוקול.
  3. ודא איכות וגודל הוטו DNA גנומי באמצעות מכונת אלקטרופורזה אוטומטי, על פי מפרט היצרן פרוטוקול. וודאו כי אין לשיא גדול של ~ 250-300 bp ה-DNA גנומי הוטו.
  4. להכין רצף ספריות באמצעות ערכת הכנה של ספריית ה-DNA עם מולטיפלקס oligos עבור רצף על פלטפורמה אילומינה, על-פי הפרוטוקול של היצרן.
  5. ודא איכות של הספרייה במכינה באמצעות מכונה אוטומטית אלקטרופורזה, על-פי הפרוטוקול של היצרן. וודאו כי אין לשיא גדול של ~ 400-450 bp, ויש פסגות מינימלי עבור הדימרים פריימר (80-85 bp) ו הדימרים מתאם (~ 120 bp).
  6. לכמת ספריות באמצעות ערכת כימות של ספריית DNA עבור רצפי DNA הדור הבא, על-פי הפרוטוקול של היצרן.
  7. µL 15 שתדללו של ספריית לשם ריכוז של 5 nM ו לשלב מרובב ספריות כפי הדרוש להשגת הרצוי באופן ייחודי מיפוי לקרוא ספירות לכל דגימה.
    הערה: מספר ייחודי מיפוי קריאות לפי המדגם יקבע את הרזולוציה. שימוש גם 5 מיליון ממופה בהיקף קורא כדי להעריך את התזמון שכפול של הגנום דג זברה. מומלץ להתחיל עם 10-20 מיליון קריאות.
  8. לבצע לזווג-end 100 bp כל הגנום רצפי DNA של דגימות בפלטפורמה רצף הדור הבא, על פי הוראות היצרן.

7. ניתוח של נתוני רצף

הערה: בהתאם להוראות סעיף זה מיועדים כקו מנחה לניתוח. להשתמש באמצעים נוספים ליישור רצף, סינון, עיבוד, וכו '. סעיף זה של הפרוטוקול יעסוק השיטה המועדפת של ניתוח בעבודה זו. אם נעשה שימוש באמצעים נוספים, להתאים את הפרמטרים והפונקציות כדי להתאים למטרות האלה. הפקודות שלהלן מוזנים Ubutnu או Mac מסוף, עם החבילות המתאימות מותקן.

  1. להשיג את הגירסאות האחרונות של הגנום דג זברה (danRer10, החל כאשר פרוטוקול זה נכתב) מהדפדפן הגנום UCSC באמצעות הפקודות הבאות:
    wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
    1. דחיסה של קובץ ה-fa.gz עם הפקודה הבאה:
      gunzip danRer10.fa.gz
    2. ליישר נתונים רצף הגנום באמצעות BWA-מ באמצעות הפקודות הבאות:
      bwa mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
  2. להמיר קובץ .sam קובץ .bam באמצעות samtools עם הפקודה הבאה:
    samtools להציג -bS input.sam > output.bam
    1. למיין את הקבצים מסודרים רצף באמצעות samtools עם הפקודה הבאה:
      samtools למיין output.bam > output_sorted.bam
    2. אינדקס את הקובץ .bam באמצעות samtools עם הפקודה הבאה:
      samtools מדד output.bam
  3. מארק PCR כפילות עם פיקארד באמצעות הפקודות הבאות:
    java-Xmx2g-ג'אר picard.jar MarkDuplicates \
    INPUT=input.bam
    OUTPUT=output.bam
    REMOVE_DUPLICATES = false
    METRICS_FILE=output_metrics.txt
  4. ליצור קבצי טקסט (. txt) הקריאות עבור כל כרומוזום באמצעות הפקודה הבאה:
    כי אני ב {1.25}; האם כרום = "chr" $i; אקו $CHROM; samtools להציג input.bam $CHROM | לחתוך -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {ט}. txt; עשיתי
    הערה: העמודות בקובץ. txt שנוצר הן דגל, מיקום, mapQ, זוג chr, זוג מיקום וגודל פרגמנט, בהתאמה.
  5. לקרוא קבצי. txt לתוך Matlab (או כל תוכנה דומה אחרת) באמצעות הפונקציה textscan.
    1. לסנן קריאות באיכות נמוכה במיפוי על-ידי הגדרת סף mapQ של 30.
    2. הסר את קריאות עם דגלים עבור יישור לא הראשי, PCR כפילויות או מיפוי זוג כרומוזום שונים.
    3. לסנן כל קריאה עם זוג שלהם מעבר לסף מסוים מרחק של 2000 bp.
    4. הערכת נתונים סטטיסטיים של קריאות שנוצר כדי לקבוע מספר סטטיסטיקות קריאה, כיסוי, הוספה גודל ואיכות (איור 2).
  6. לקבוע כיסוי קריאה ב- windows 100 bp קבוע עבור כל דגימה על ידי ספירת מספר הקריאות במרווחים לחץ דם 100 על פני האורך של כל כרומוזום.
    1. חישוב שהחציון ספירת עבור windows כל קריאה.
    2. לסנן אזורי כיסוי גבוהה על-ידי הסרת windows גדול מסטיות תקן 5 החציון.
  7. הגדרת אזורים עבור ניתוח הדגימות הפניה G1 על ידי מציאת מקטעים לאורך כל כרומוזום עם 200 קריאות באמצעות חלונות הזזה.
    1. לקבוע עומק קריאה בכל מדגם שלב S על ידי ספירת מספר הקריאות שלב S בחלונות ספירת 200-קריאה מוגדרת עבור ההפניה G1 הנלווה.
  8. להחליק את הנתונים הגולמיים באמצעות הפונקציה csaps בתוכנה, עם גורם אינטרפולציה (p) של 10-16.
  9. לנרמל את הנתונים מוחלקים ניקוד-z עם ממוצע 0 וסטיית התקן של 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות נתוני תזמון שכפול שפורסמו, שכפול נציג תזמון פרופילים אמצעי בקרה הינם מסופקים15. השלבים הראשונים של עיבוד לערב יישור הנתונים רצף הגנום, חישוב אורך הקריאה סטטיסטיקות כיסוי של הגנום וסינון באיכות נמוכה, אינטראקצית, ו- PCR קריאות כפולים. קריאה סטטיסטיקה עבור מדגם רצף דג זברה טיפוסי מוצגים באיור2. לאחר סינון, קריאה ספירות נחושים בטיפוח הנתונים וחלונות בגודל משתנה החליק, מנורמל. שכפול החליק/מנורמל טיפוסי פרופילים התזמון של כרומוזום ד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג זברה לספק מערכת מודל חדש וייחודי ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA. מתי matings מתוזמן מבוצעות כפי המפורט בעלון זה נסיוני, אלפי עוברי ניתן לאסוף ביום אחד לניסויים. אלה העוברים לפתח באופן סינכרוני באמצעות בדיוק בעיתוי ומתאפיינות במובהק שלבי הפיתוח. דג זברה יכול להיות בקלות ובדייקנות מבוים על ידי מורפולוגיה באמצעות של stereomicroscope, העוברים דג זברה מבחוץ ולפיתוח ברורים שטיחות. פרוטוקול זה מפרט את השימוש דג זברה העוברים ללמוד שכפול תזמון במהלך פיתוח חוליות.

אזורים של פרוטוקול שעלול להצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי לאומי כללי לרפואה למדעי של מכוני הבריאות הלאומיים דרך מעניקה 5P20GM103636-02 (כולל Flow Cytometry תמיכה הליבה) ו- 1R01GM121703, וכן פרסים מהמרכז אוקלהומה עבור תאי גזע בוגרים מחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
NaClFisher ScientificBP358-10
KClFisher ScientificP217-500
CaCl2Fisher ScientificC79-500
MgSO4EMD MilliporeMMX00701
NaHCO3Fisher ScientificBP328-500
תמיסת פרוטאזPronaseSigma10165921001
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)SigmaD1408
אתנול (EtOH)KOPTECV1016
אלבומין בסרום בקר (BSA)SigmaA9647-100G
Propidium Iodide (PI)InvitrogenP3566
Tris-HClFisher ScientificBP153-500
EDTASigmaE9844
SDSסנטה קרוזSC-24950
פרוטאינאז KNEBP8107S
פנול: כלורופורםסיגמאP3803-100 מ"ל
נתרן אצטטJ.T.Baker3470
גליקוגןאמביוןAM9510
RNase AThermo ScientificEN0531
Quanit-iTInvitrogenQ33130ריאגנטים לכימות DNA מבוסס פלואורסצנטי
Covaris AFA microTUBECovaris520045צינור מיוחד לסוניקציה
Covaris E220 SonicatorCovarisE220אולטרסאונד ממוקד
Agilent 4200 TapestationAgilentG2991AAמכונת אלקטרופורזה אוטומטית
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582ריאגנטים למכונת אלקטרופורזה אוטומטית
ערכת הכנה לספריית NEBNext Ultra DNA עבור IlluminaNEBCat # E7370Lערכת הכנת ספריית DNA
ערכת אוליגוס מולטיפלקס NEBNext עבור Illumina (סט פריימרים אינדקס 1)NEBCat # E7335Sאוליגוס מולטיפלקס לערכת
הכנת ספריית DNAערכת אוליגוס מולטיפלקס NEBNext עבור Illumina (סט פריימרים אינדקס 2)NEBCat#E7500Sאוליגוס מולטיפלקס נוסף עבור ערכת הכנת ספריית
DNA ערכת כימות ספריית NEBNext עבור IlluminaNEBE7630Lערכת כימות להכנת ספרייה
Agencourt AMPure XP חרוזיםבקמן קולטרA63882חרוזים מגנטיים
Illumina HiSeq 2500IlluminaSY– 401– 2501פלטפורמת ריצוף DNA מהדור הבא
40 ומיקרו; m מסננת תאי ניילון פלקוןפישר סיינטיפיק08-771-1
צלחת פטרי חד פעמית VWR 100 x 25 מ"מVWR89107-632
מזרק 6.0 מ"ל לניצ'יריו דגם 8100VWR89078-446
צינורות לחיצה פוזי, 1.7 מ"ל, צבע טבעידנוויל סיינטיפיקC2170 (1001002)ללא דנאז/רנז
מערבולת ג'יני 2תעשיות מדעיותSI-0236
בקבוקי כביסהVWR16650-022פוליאתילן בצפיפות נמוכה, מסננת פה רחב
VWR470092-4406.9 ס"מ,
מיכל קורסינגAquaneeringZHCT100מיכל גידול אישי
iSpawnTechniplastN/Aמיכל רבייה גדול
FACSAria IIBD biosciencesN/Aמכונת מיון תאים
Wild M5a סטרומיקרוסקופWild HeerbruggN/Aמיקרוסקופ מנתח
Qubit 3 פלואורומטרThermo ScientificQ33216שיטה מבוססת פלואורסצנטי כמותית לקביעת ריכוז DNA
MatlabMathworksגרסה 2017a
ארגז כלים סטטיסטי MatlabMathworksגרסה 11.1
ארגז כלים התאמת עקומה של MatlabMathworksגרסה 3.5.5
רשת עדין

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).
  2. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  3. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
  4. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245(2008).
  5. Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
  6. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
  7. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
  8. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  9. Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
  10. Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
  11. Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
  12. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  13. Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
  14. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  15. Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
  16. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Zebrafish EmbryosCell SortingNext Generation SequencingPropidium Iodide StainingFlow CytometryGenome wide AnalysisReplication Fork InitiationEmbryonic Development StagesSingle cell Suspension

מאמרים קשורים