הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

11.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57156

⸱

11 במרץ 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical School, Ardabil University of Medical Sciences, 2Neurosciences Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, 3Research Center for Pharmaceutical Nanotechnology, Faculty of Pharmacy, Tabriz University of Medical Sciences

במאמר זה

סיכום

המטרה הכוללת של נוהל זה היא לספק טכניקה מאוד לשחזור להערכת ויוו של ערעור מחסום הדם - מוח במודלים עכברוש של שבץ איסכמי.

תקציר

שבץ איסכמי מוביל בצקת במוח vasogenic פגיעה במוח העיקרי עוקבות, אשר מתווך דרך הרס מחסום הדם - מוח (BBB). חולדות עם שבץ איסכמי המושרה הוקמה ומשמשת כמודלים ויוו לחקור את שלמות פונקציונלית של BBB. Spectrophotometric זיהוי של אוונס כחול (EB) הדגימות המוח עם איסכמי יכול לספק הצדקה אמינה עבור מחקר ופיתוח של שיטות טיפוליות הרומן. שיטה זו יוצרת תוצאות לשחזור, ישימה במעבדה כלשהי ללא צורך בציוד מיוחד. כאן, אנו מציגים קו מנחה מטמיעים וטכני על זיהוי extravasation של EB בעקבות אינדוקציה של שבץ איסכמי בחולדות.

מבוא

Vasogenic בצקת במוח עקב הפרעה מחסום הדם - מוח (BBB) נותר סיבוך חשוב של שבץ איסכמי של דטרמיננטה העיקריים של שיעור ההישרדות שבץ בחולים1,2. מחסום הדם - מוח (BBB), אשר נוצר על ידי תאי אנדותל נימי המוח (BCECs), המורכבת מרכיבים נוירו-וסקולריים נפרדות (למשל, צמתי צר בין BCECs, pericytes, astroglial ותאים עצביים3), מספק מתמחה ודינאמיים ממשק בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) לבין מחזור הדם ההיקפיים4,5. עלבונות כמו פציעות איסכמיה-פגיעה reperfusion יכול לשבש את שלמות פונקציונלית של BBB, להוביל חדירה עוקבות של מחזורי לויקוציטים אל parenchyma המוח המפעילות בסופו של דבר דלקת מוחית ופגיעות מוח ראשוניים 6 , 7. מודלים בעלי חיים יש צורך זיהוי מדויק תפקוד לקוי של BBB בעקבות התרחשות של אירוע מוחי. כאלה הן חשיבות רבה ללימוד שבבסיס מנגנונים הקשורים pathophysiological ולהציג neuroprotective אסטרטגיות חדשות. במבחנה תא תרבות מבוססי מודלים של BBB יש כבר מאוד שפותחו ונמצאות בשימוש במחקר מולקולרי של ה BBB physiopathology8,9,10. ובכל זאת, ויוו חייתיים, אשר מייצרים נזק איסכמי של BBB הדומה תנאים קליניים האנושי, הם גם משתלם מאוד בהקשר הזה. זיהוי כמותית extravasation של אוונס כחול (EB) היא טכניקה מקובלת היטב ורגיש שבו נעשה שימוש עבור הערכה של BBB תקינות ותפקוד מחלות ניווניות, לרבות שבץ איסכמי11, 12 , 13 , 14. שיטה זו היא חסכונית, ריאלי, הדירים החלים לחלוטין במעבדה כל ניסיוני. יישומה אינו דורש ציוד מתקדם, כגון קליעים נותבים רדיואקטיביים15 או תהודה מגנטית (MRI)16, כי הם התנאים המוקדמים עבור שיטות אחרות. במאמר זה נדגים באופן מקיף תהליכים טכניים בסיסיים של BBB הערכה באמצעות EB extravasation במודלים עכברוש של שבץ איסכמי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות באוניברסיטת ארדביל מועצת המחקר הרפואי-מדעי עבור מחקרים בבעלי חיים (מספר הקוד האתי: IR. ARUMS. REC.1394.08)-במחקר זה דמיינו, השתמשנו למבוגרים זכר ספראג-Dawley חולדות (300-350 גר') המתקבל המכון מספוא (טהראן, איראן).

1. Flowmetry והרדמה

  1. לגרום הרדמה באמצעות 4% איזופלוריין ולתחזק אותו עם איזופלוריין (1-1.5%) בתערובת של תחמוצת החנקן (70% v/v) וחמצן (30% v/v) משך זמן הניתוח.
  2. במקום חיה anaesthetized בתנוחת שכיבה על שמיכת חימום מבוקר להזנה חוזרת ולשמור על טמפרטורת הגוף על 37±0.5 ° C באמצעות בדיקה רקטלית מחובר זו יחידת הסקה.
  3. למרוח כמות קטנה של משחה אופטלמולוגיות בשתי העיניים למניעת יובש.
  4. לגלח את האזור הכירורגי על הצד השמאלי של הגולגולת עם קוצץ חשמלי. השתמש betadine פתרון עם כרית גזה כדי לחטא את העור. לשטוף את האזור בפד סטרילי המכיל 70% אתנול, חזור על שני שלבים בשלושה מחזורים17.
  5. על שיכוך כאבים, להזריק 0.2 מ של 0.5% נמשך subcutaneously לתוך אזור הניתוח17.
  6. עושים חתך עור ארוך 1 ס מ על הגולגולת (המשתרעת canthus הלטראלי של העין השמאלית לבסיס של אוזן שמאל) ומנתחים את השריר temporalis השמאלי כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן, ליצור בר קטן חור 5 מ מ לרוחב כדי 1 מ"מ אחורי לכביש bregma18 כדי להקל על השמה של הקצה של המכשיר עיפרון דופלר זרימה.
  7. להפוך העכברוש מ נוטה לעמדה פרקדן ולאחר מכן שים החללית עיפרון לייזר לתוך הגולגולת בעבר קדח העיוור-החור כדי לנטר את זרימת הדם האזורית מוחי (rCBF).
  8. להקליט rCBF הבסיסית של כל בעל חיים, תחשיב את זה כ- 100%. ראוי לציין, עורק המוח התיכון סגר (MCAO) הוא התחיל כל אימת לירידה rCBF של יותר מ- 80% שזוהו19,20.

2. אינדוקציה של איסכמיה מוקד Cerebra

  1. לגלח את אזור הצוואר, לחטא את העור עם betadine פתרון ו- 70% אתנול. להזריק 0.2 מ של 0.5% נמשך subcutaneously באתר הניתוח שיכוך כאבים17.
  2. עושים חתך כירורגי זמן 2 ס מ על גבי המשטח הגחון של הצוואר כדי לגשת את השמאלי עורק תרדמני (LCCA). לבודד את LCCA של השכן fascia והעצב התועה כדי לגשת נגע הסתעפות של עורק התרדמה החיצוני (ECA), העורק (ICA).
  3. מאתרים ומפסיקים לצמיתות ' LCCA ' או ' ECA העסקת 5-0 בתפר משי ומנתחים ICA חינם לרמה של העורק pterygopalatine.
  4. באופן רופף במקום עניבה של 5-0 בתפר משי סביב LCCA, וחברי ואז באופן זמני ICA עם מיקרו-סרטון כלי הדם.
  5. עושים חתך קטן-LCCA לפני הקודם שמוקם העניבה רופף, להוסיף 4-0 בתפר ניילון מצופה סיליקון לתוך המרחב luminal של יק א ואז להדק את התפר סביב LCCA כדי לאבטח את התפר ניילון ולמנוע דולף הדם.
  6. הסר את כלי הדם של המיקרו-קליפ יק א. לאחר מכן, מראש הלהט intraluminal מצופה סיליקון עד התבוננות התדרדרות ב rCBF זה מצביע על חסימה של המקור MCA. בסוף תקופת איסכמי (90 דקות), להתחיל פגיעה reperfusion פורש את התפר intraluminal21.

3. ומוחלף תעלות אוונס הכחול הזרקה (EB)

  1. עושים חתך אורכי 1 ס מ בצוואר בצד שמאל של האמצע ומנתחים אז בלשון בוטה fascia שטחית משם כדי לגשת הסניף חיצוני של ווריד הצוואר השמאלי (LGV). לאחר מכן, לצמיתות מאתרים ומפסיקים את סוף הגולגולת LGV בתפר משי 5-0. באופן רופף במקום שני קשרים סביב הווריד, ואז באופן זמני תהדק את הלב סוף LGV של מיקרו-מלקחיים לכלי הדם.
  2. עושים חתך קטן על LGV בין שני תפרים, ואז להוסיף סרום heparinized מלא קטטר לתוך מרחב luminal של LGV ואת שנייה, כ 10 מ מ. לאחר מכן, להדק את ליגטורות סביב הווריד מאובטחים הצנתר ולמנוע דימומים. להזריק כמויות קטנות של סרום כדי למנוע כיווץ את הווריד.
  3. בתחילת תקופת פגיעה reperfusion, לאט תזריקי צבע EB (1 מ"ל/ק"ג של 2% פתרון EB בתוך תמיסת מלח) במשך 5 דקות. לאחר מכן, לשטוף את הצינורית על ידי זריקה של 0.5 מ ל תמיסת מלח, למשוך את הצינורית בהזרקה לווריד12,22.
  4. לבסוף, תפר את החתכים צוואר וראש ולהזריק 0.05 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין intraperitoneally (IP) לחזור על הזריקה כל 6-8 h בתקופה פגיעה reperfusion נגד כאבים לאחר הניתוח17.
  5. להזריק 5 מ של saline(IP) ומחוממת מראש כדי לספק לחות בתוך כלוב ההתאוששות17.
  6. המקום החיה בכלוב שחזור מיוחד המצויד טמפרטורה, בקרת מיזוג אוויר ונטר את ההתאוששות של החיה מן ההרדמה.

4. הערכה של החדירות מחסום דם המוח

  1. לאחר 24 שעות של פגיעה reperfusion, עמוק עזים ומתנגד החיה עם הנתרן התיופנטל. לאחר מכן, פתח את חלל בית החזה על ידי ביצוע חור קטן מתחת לעצם החזה.
  2. עושים חור קטן באטריום ימין ולהזריק 250 מ ל תמיסת 0.9% מראש ומחוממת (37 הלעפה תרוטרפמט), בלחץ של 110 מ מ כספית דרך החדר השמאלי למשך 15 דקות לשטוף EB הרחק זרימת הדם עד היציאות מלוחים נורמלי מהאטריום הופך שקוף23.
  3. מיד להסיר את המוח לגולגולת ומקם אותה המטריצה המוח. לנתח את הריח הנורה, המח ולאחר מכן באמצעות סכין גילוח נקי, להפריד בין האונה הימנית של המוח משמאל (Lesioned) לאורך הקו האמצעי.
  4. שוקל האונה כל homogenize אותם בנפרד ב- 2.5 מ ל תמיסת פוספט buffered ו מערבבים את זה עם 2.5 מ של חומצת חומץ טריכלור (60%) למשך 2 דקות בעזרת מכונה מערבולת.
  5. צנטריפוגה דגימות המוח במשך 30 דקות ב 1,322 x g ולאפשר את הדוגמאות להתקרר במקרר 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. להשתמש את supernatants כדי לאמוד את ספיגת EB על ידי ספקטרופוטומטרים 610 nm23.
  7. לחשב ריכוזים EB מפני עיקול רגיל ותוצאות אקספרס כמו µg/g של רקמת המוח.

5. ייצור של העקומה סטנדרטי EB

  1. הכינו 10 פתרונות לדוגמה EB עם ריכוזים של 1-10 µg של EB ב 5 מ ל תמיסת פוספט באגירה מלאה.
  2. למדוד את ספיגת הערכים של כל דגימה-610 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים.
  3. להפוך תרשים פיזור בעזרת גיליון אלקטרוני, נוכח ריכוז EB בציר ה-X ואת הערכים ספיגת בציר Y (איור 1).
  4. הגדרת קו מגמה ליניארי של העקומה עם המשוואה שלו. לאחר מכן, להשתמש בו כדי להשיג את הריכוז EB של דגימות.
  5. לדווח את התוצאות הסופיות של EB extravasation כמו µg/g ממשקל רקמת המוח.

6. מבצע המזויפים

  1. בצע את אותו תהליך כירורגי עם חולדות בקבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים (כולל ביצוע חתך באזור הצוואר, הזרקת EB) אבל לא לכלול את MCAO.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

היה הבדל משמעותי ברמות EB בהאונה הימנית לעומת האונה השמאלית של החולדות המופעלים דמה (1.06 ± 0.1 µg/g ו- 1.1 ± 0.09 µg/g, בהתאמה). כפי שמוצג דמויות 2A-2B, אינדוקציה של איסכמיה ארעי (איסכמיה 90 דקות / פגיעה reperfusion 24 שעות ביממה) גרם הבדל משמעותי ברמות EB (10.41 ± 0.84 µg/g, p < 0.001) באונה השמאלית של חולדות איסכמי, לעומת בהתאמה המיספירה # חצי הכדור בחולדות המופעלים באמצעות העמדת פנים. באופן קולקטיבי, ממצאים אלו מצביעים על כך בתנאים רגילים, EB לא יכול בקלות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עד כה, בשיטות שונות כגון autoradiography וזיהוי של קליעים נותבים רדיואקטיביים24,25, immunofluorescence מיקרוסקופ26,27, EB extravasation טכניקה20, 23 השתמשו כדי להעריך את הנזק מחסום הדם - מוח. EB לצבוע בחום מסוגל לקשור אלבומין והוא משמש מכשיר מעקב עבור איתור דליפה כלי הדם של לכימות28,29

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים בסגן הקנצלר לחקר ארדביל האוניברסיטה למדעי הרפואה (ארדביל, איראן) לקבלת סיוע כספי (גרנט לא: 9607).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
איזופלורןפיראמלAWN 3404110020 - 25 מעלות; C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)Molekula312163684 שנים
Sprague– חולדות דולי מכון פסטור (טהרן, איראן)300-350 גרם
אוונס בלו סיגמא-אולדריץ' 314-13-6
חומצה טריכלורואצטית סיגמא-אולדריץ' 76-03-9שנתיים
Bupivacaine HCl (0.5%)Delpharm Toursלמטה  25 & deg; C
בופרנורפיןExir (איראן)
סודיום קרבונטסיגמא-אולדריץ' 497-19-8
נתרן כלורי סיגמא-אולדריץ' 7647-14-5
די-סודיום מימן פוספטEMD Millipore 231-448-7
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ'   7447-40-7
אתנול סיגמא-אולדריץ' 64-17-5
סיליקון (קסנטופרן)HeraeusEN ISO 4823
מפעיל אוניברסלי בתוספתמלקחיים מיקרו חיתוך 66037445
52100-41
מספריים קפיצייםסטולטינג52130-00
הפעלה  מספרייםRoboz52140-70
מטריצת מוח Stoelting51390
מכונת הרדמה לבעלי חיים קטנים |  Kent ScientificSS-01
Power Lab systemAD InstrumentsML880
מד זרימה דופלר לייזרAD InstrumentsML191
מערכת הזנה חוזרת לחימוםHarvard Appratus72-7560
מיקרו מהדק כלי דםFineScienceTools 18055-03
משי 5-0 חוט תפרEthicon682G
חוט תפר אתילון 4-0 EthiconEH6740G
Heraeus

מקורות

  1. Jin, G., et al. Protecting against cerebrovascular injury: contributions of 12/15-lipoxygenase to edema formation after transient focal ischemia. Stroke. 39 (9), 2538-2543 (2008).
  2. Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 399-415 (2003).
  3. Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 33, 379-408 (2010).
  4. Zhang, C., et al. The potential use of H102 peptide-loaded dual-functional nanoparticles in the treatment of Alzheimer's disease. J Control Release. , (2014).
  5. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  6. Fang, W., et al. Attenuated Blood-Brain Barrier Dysfunction by XQ-1H Following Ischemic Stroke in Hyperlipidemic Rats. Mol Neurobiol. 52 (1), 162-175 (2015).
  7. Huang, J., et al. CXCR4 antagonist AMD3100 protects blood-brain barrier integrity and reduces inflammatory response after focal ischemia in mice. Stroke. 44 (1), 190-197 (2013).
  8. Omidi, Y., Barar, J. Impacts of blood-brain barrier in drug delivery and targeting of brain tumors. Bioimpacts. 2 (1), 5-22 (2012).
  9. Cho, H., et al. Three-dimensional blood-brain barrier model for in vitro studies of neurovascular pathology. Sci Rep. 5, (2015).
  10. Barar, J., Rafi, M. A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Blood-brain barrier transport machineries and targeted therapy of brain diseases. Bioimpacts. 6 (4), 225-248 (2016).
  11. Kaya, M., et al. Magnesium sulfate attenuates increased blood-brain barrier permeability during insulin-induced hypoglycemia in rats. Can J Physiol Pharmacol. 79 (9), 793-798 (2001).
  12. Pasban, E., Panahpour, H., Vahdati, A. Early oxygen therapy does not protect the brain from vasogenic edema following acute ischemic stroke in adult male rats. Sci Rep. 7 (1), 3221(2017).
  13. Haghnejad Azar, A., Oryan, S., Bohlooli, S., Panahpour, H. Alpha-Tocopherol Reduces Brain Edema and Protects Blood-Brain Barrier Integrity following Focal Cerebral Ischemia in Rats. Med Princ Pract. 26 (1), 17-22 (2017).
  14. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
  15. Bodsch, W., Hossmann, K. A. 125I-antibody autoradiography and peptide fragments of albumin in cerebral edema. J Neurochem. 41 (1), 239-243 (1983).
  16. Jiang, Q., et al. Quantitative evaluation of BBB permeability after embolic stroke in rat using MRI. J Cereb Blood FlowMetab. 25 (5), 583-592 (2005).
  17. Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J Vis Exp. (48), (2011).
  18. Hungerhuber, E., Zausinger, S., Westermaier, T., Plesnila, N., Schmid-Elsaesser, R. Simultaneous bilateral laser Doppler fluxmetry and electrophysiological recording during middle cerebral artery occlusion in rats. J Neurosci Methods. 154 (1-2), 109-115 (2006).
  19. Panahpour, H., Nouri, M. Post-Ischemic Treatment with candesartan protect from cerebral ischemic/reperfusioninjury in normotensive rats. Int J Pharm Pharm Sci. 4 (4), 286-289 (2012).
  20. Panahpour, H., Dehghani, G. A., Bohlooli, S. Enalapril attenuates ischaemic brain oedema and protects the blood-brain barrier in rats via an anti-oxidant action. Clin Exp Pharmacol Physiol. 41 (3), 220-226 (2014).
  21. Panahpour, H., Nekooeian, A. A., Dehghani, G. A. Blockade of Central Angiotensin II AT1 Receptor Protects the Brain from Ischemia/Reperfusion Injury in Normotensive Rats. Iran J Med Sci. 39 (6), 536-542 (2014).
  22. Panahpour, H., Nekooeian, A. A., Dehghani, G. A. Candesartan attenuates ischemic brain edema and protects the blood-brain barrier integrity from ischemia/reperfusion injury in rats. Iran Biomed J. 18 (4), 232-238 (2014).
  23. Kaya, M., et al. The effects of magnesium sulfate on blood-brain barrier disruption caused by intracarotid injection of hyperosmolar mannitol in rats. Life sci. 76 (2), 201-212 (2004).
  24. Schöller, K., et al. Characterization of microvascular basal lamina damage and blood-brain barrier dysfunction following subarachnoid hemorrhage in rats. Brain Res. 1142, 237-246 (2007).
  25. Bodsch, W., Hossmann, K. A. 125I-Antibody Autoradiography and Peptide Fragments of Albumin in Cerebral Edema. J Neurochem. 41 (1), 239-243 (1983).
  26. Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
  27. Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
  28. Kucuk, M., et al. Effects of losartan on the blood-brain barrier permeability in long-term nitric oxide blockade-induced hypertensive rats. Life Sci. 71 (8), 937-946 (2002).
  29. Uyama, O., et al. Quantitative evaluation of vascular permeability in the gerbil brain after transient ischemia using Evans blue fluorescence. J Cereb Blood Flow Metab. 8 (2), 282-284 (1988).
  30. Kleinig, T. J., Vink, R. Suppression of inflammation in ischemic and hemorrhagic stroke: therapeutic options. Curr Opin Neurol. 22 (3), 294-301 (2009).
  31. Del Zoppo, G. J., Mabuchi, T. Cerebral microvessel responses to focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 23 (8), 879-894 (2003).
  32. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  33. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
  34. Shin, H. K., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
  35. Bottiger, B. W., et al. Global cerebral ischemia due to cardiocirculatory arrest in mice causes neuronal degeneration and early induction of transcription factor genes in the hippocampus. Brain Res Mol Brain Res. 65 (2), 135-142 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

Evans Blueחסימה של העורק המוחי האמצעיזרימת דם מוחית אזוריתזיהוי ספקטרופוטומטריקניולציה של הווריד הג'וגולריהומוגניזציה של רקמת מוחמד זרימה בלייזר דופלרתקופת רפרופוזיה
הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.