מאמר שיטה

בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

DOI:

10.3791/57166

⸱

4 במאי 2018

 ,  ,  , 
1Chang Gung University, 2Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 3California Northstate University College of Medicine, 4Department of Nephrology, Clinical Poison Center, Chang Gung Memorial Hospital, 5Kidney Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, 6Center for Tissue Engineering, Chang Gung Memorial Hospital, 7Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 8College of Oral Medicine, Taipei Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול לחקור את סמנים ביולוגיים של mRNA ביטוי של קרום העצם, נגזר תאים (שיתפקדו) הנגרמת על ידי ויטמין C (ויטמין C), 1,25-dihydroxy ויטמין D [1,25-(OH)2D3]. בנוסף, נוכל להעריך את היכולת של בקר קבוצת מחשבים ראשי להבדיל לתוך osteocytes, chondrocytes ו- adipocytes.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גזע mesenchymal (MSCs) קיימים במגוון של רקמות, יכול להיות מובחן סוגי תאים רבים, לרבות תאי העצם. בין מקורות שיניים MSCs, קרום העצם היא רקמה נגיש בקלות, אשר זוהה להכיל MSCs בשכבה cambium. עם זאת, מקור זה לא כבר נרחב נחקרה.

ויטמין D3 ו- 1,25-(OH)2D3 הוכחו לעורר במבחנה הבידול של MSCs לתוך תאי העצם. בנוסף, ויטמין C מסייע צמיחת תאים היווצרות ועצם קולגן. עם זאת, אף מחקר עדיין חקרה את ההשפעות של ויטמין D3 וויטמין C על MSCs.

כאן, אנו מציגים שיטה אנליטית MSCs מן האדם קרום העצם מכתשיים לבחון את ההשערה כי 1,25-(OH)2D3 לנצל השפעה osteoinductive על תאים אלה. אנו גם לחקור את הנוכחות של MSCs ב קרום העצם מכתשיים אנושי, להעריך אדהזיה לתאי גזע והתפשטות. כדי להעריך את היכולת של ויטמין C (כמו פקד), ריכוזים שונים של 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8ו 10−7 מ') לשנות מפתח סמנים mRNA הביטוי מבודד MSCs mRNA של phosphatase אלקליין (ALP), עצם sialoprotein (BSP), ליבה מחייבת גורם אלפא-1 (CBFA1), קולגן-1 ואוסטאוקלצין (OCN) נמדדים באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (RT-PCR).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות אינספור טכניקות הרלוונטיים פותחו בשנים האחרונות, עצם שחזור נותר מוגבל על-ידי אילוצים מרובים ולאחר הערכת שמידת השחזור נחוץ לעתים קרובות בלתי אפשרי. רקמה קשה הגדלת נדרשת כדי להשיג את המטרות אסתטי ופונקציונלי בנוסף שיעור הצלחה לטווח ארוך חיובית. שיטות משמש בדרך כלל הליכים כאלה כוללים בעזרת השתלת עצם autogenous, allogenic, האורתופדיה אלופלסטי בעזרת השתלת עצם. בין סוגים שונים של עצם, שתלי עצם autogenous נחשבים היעיל ביותר. עם זאת, תחלואה האתר התורם vascularity פרוץ, רקמות מוגבל זמינות1 כבר החסרונות העיקריים עבור בעזרת השתלת עצם autogenous. בנוסף, שתלי עצם allogenic ו- xenografts קושרו עם העברת מחלות. כיום, שתלי עצם סינתטי נמצאים בשימוש נרחב כדי לפתור בעיות אלה. עם זאת, עם פוטנציאל osteogenic חוסר שלהם, התוצאות הקליניות יש מגוונות. חומרים כגון תאית משויכות תנודות נפח זיהום, חוסר כוח.

בניית עצם באמצעות הנדסת רקמות יצר עניין רב. בטכניקה זו, גזע mesenchymal (MSCs) בתחילה משמשים כדי לקדם אוסטאובלסט בידול, אשר מושתלים ואז לאתר של איבוד העצם כדי להשיג את עצם תיקון. הליך זה מוחל כרגע בטיפול תא. השגת שיקום העצם על-ידי חילוץ כמות מוגבלת של רקמות היא פשוט פחות פולשני לעומת שיטות אחרות.

התפקיד הפוטנציאלי של MSCs ככלי מבוססת תא טיפולים מכוון התחדשות שיניים הוא עניין המתעוררים בקרב קבוצות מחקר שונות. מחקרים אישרו כי ניתן להבחין MSCs מן הסוגים הבאים של רקמות: מח עצם, אדיפוז, synovial ממברנה, pericyte, עצם trabecular, הטבור אנושי ו-2,רקמות שיניים3. מקורות נפוצים של MSCs כוללים מח עצם, רקמת שומן ברקמות שיניים. לעומת MSCs נגזר רקמת שומן, מח עצם, היתרונות של תאי גזע שיניים הם נגישות קלה ותחלואה פחות קטיפתו. לעומת תאי גזע עובריים, MSCs נגזר רקמות שיניים מופיעים nonimmunogenic, אינם משויכים דאגות אתיות מורכבות3.

בשנת 2006, האגודה הבינלאומית נייד טיפול מומלץ שימוש בתקנים הבאים כדי לזהות MSCs: ראשית, MSCs חייב להיות מסוגל הצמדת פלסטיק. שנית, MSCs חייבת להיות חיובית עבור אנטיגנים משטח CD105, CD73 ו- CD90 ושלילית עבור הסמנים ומונוציטים, מקרופאגים, תאי B בנוסף אנטיגנים hematopoietic CD45 CD344. כקריטריון הסופי, MSCs דרושה היכולת להתמיין שלושת הסוגים הבאים של תאים בתנאים סטנדרטיים של בידול במבחנה : תאי העצם, adipocytes ו- chondrocytes4. עד היום, שישה סוגים של תאי הגזע האנושי שיניים יש כבר מבודד ו מאופיין. הסוג הראשון שבודד רקמה אנושית זולה, כינה זולה שיניים כמחנכת תאי גזע5. לאחר מכן, שלושה סוגים נוספים של MSCs שיניים יש מבודד, המאופיינת: תאי גזע של השיניים נשירים exfoliated6, חניכיים רצועה7ו- papilla הפסגה8. לאחרונה, שיניים נגזר זקיק9, נגזר רקמת חניכיים10, ניצן שיניים גזע cells(DBSCs)11וציסטה periapical MSCs (hPCy-MSCs)12 גם זוהו.

Friedenstein היה הראשון להגדיר MSCs13. MSCs התערוכה פוטנציאל גבוה בתי־ספר, אפשר לגרום להם להבדיל לפני להיות מושתלים, מה שמרמז כי הם מועמדים אידיאליים עבור תהליכי הרגנרציה10.

למרות רוב המחקרים יש להשתמש במח העצם כמקור של תאי גזע, תאי נגזר קרום העצם (שיתפקדו) היו גם בשימוש לאחרונה14. קרום העצם נגיש בקלות רבה יותר מאשר הוא במח העצם. לכן, בטכניקה זו, אנו משתמשים קרום העצם מכתשיים כדי לבטל את הצורך חתכים נוספים במהלך הניתוח וכדי להקטין תחלואה postsurgical בחולים. קרום העצם היא רקמת החיבור טפסים הציפוי החיצוני של עצמות ארוכות, ומורכב משתי שכבות נפרדות: סיבי השכבה החיצונית המורכבת fibroblasts, קולגן וסיבים אלסטיים15, השכבה הפנימית עשיר תא cambium במגע ישיר עם משטח העצם. השכבה cambium מכיל אוכלוסיה לתא מעורב, בעיקר fibroblasts16, תאי העצם17, pericytes18ו subpopulation קריטי מזוהה MSCs19,20,21. רוב המחקרים דיווחו כי שיתפקדו דומים, אם לא עדיפה, על הנגזרות מח העצם בתאי גזע (bMSCs) עצם ריפוי והתחדשות22,23,24. קרום העצם נגיש בקלות ותערוכות האפקטיביות משובי מעולה. עם זאת, מחקרים מעטים התמקדו26,25,27קרום העצם.

לגבי עצם תיקון, ונוהגין קליניים כרוך את השתלת של חידוש ובתאים מוגבר בתוך פיגומים תומכת. המחקרים האחרונים התמקדו רכישת תאי גזע באזורים הפגומים ונקיטה ובתאים התחדשות רקמות20. רופאי שיניים צופים גם יישומים עתידיים של התחדשות העצם חניכיים, טיפולי חניכיים, שתלים דנטליים. לגבי האתר התורם, קרום העצם ניתן בקלות לקצור על ידי מנתחים שיניים כללית. זה משווה לטובה נגד מח סטרומה תאים, כמו קרום העצם ניתן לגשת במהלך ניתוח אוראלי שגרתית. לפיכך, מטרת מחקר זה היא להקים עבור קציר שיתפקדו פרוטוקול להעריך את המורפולוגיה, קובץ מצורף, הכדאיות ואת התפשטות תאי גזע אנושי קרום העצם.

ויטמין D מטבוליטים להשפיע על ויוו עצם-מינרליים שיווי משקל דינמי. מחקר אחד דיווח 24R,25-(OH)2D3 הטופס הפעיל של ויטמין D אינו חיוני הבידול osteoblastic של MSCs (hMSCs) אנושי28. עצם הומאוסטזיס ותיקון מוסדרים על ידי רשת של מטבוליטים3 ויטמין D, של איזה 1,25-(OH)2D3 (קלציטריול) הוא פעיל ביותר מבחינה ביולוגית, הרלוונטי בוויסות בריאות העצם. ויטמין D3 חיונית הסתיידות29. במחקר אחד שימוש בעכברים קונמינג לבן בן d-2, הגופים embryoid בעכברים ציינו כי תוספי ויטמין C, ויטמין D באופן יעיל קידם את הבידול של תאי העצם ESC-derived30. בין שלה פעילויות ביולוגיות נוספות, 1,25-(OH)2D3 מעוררת את הבידול במבחנה של hMSCs על תאי העצם, אשר ניתן לנטר מבוסס על הגדלת פעילות האנזים אלקליין פוספטאז (ALP) או OCN ג'ין ביטוי.

מחקרים מעטים גילו קשר מנה-תגובה של טיפולים בשילוב עם ויטמין C ו 1,25-(OH)2D3 ב שיתפקדו האנושי עם דגש מיוחד על הנדסת רקמות העצם. לפיכך, במחקר זה, אנו בוחנים את ריכוז אופטימלי לטיפול יחיד או בשילוב של 1,25-(OH)2D3 , ויטמין C להשראת הבידול osteogenic של האדם שיתפקדו. המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לקבוע אם אוכלוסיה תא מבודד קרום העצם מכתשיים שיניים מכיל תאים בעלי פנוטיפ של MSC, תאים אלה יכול להיות מורחבת בתרבות (במבחנה) ואם הבדיל כדי ליצור את הרקמה הרצויה . בנוסף, נוכל להעריך את היכולת של בקר קבוצת מחשבים ראשי להבדיל לתוך osteocytes, chondrocytes ו- adipocytes. החלק השני של המחקר בוחן את ההשפעות של ויטמין C ו 10−1010−9, 10−8, 10−7 מ' 1,25-(OH)2D3 על הפעילות osteogenic של בקר קבוצת מחשבים ראשי. המטרה העיקרית של מחקר זה הוא להעריך את הפונקציות של ויטמין C ו- 1,25-(OH)2D3 במהלך הבידול osteoblastic של שיתפקדו על ידי פעילות ALP, גנים פרו-osteogenic, כגון ALP, קולגן-1, OCN, BSP ו- CBFA1. בנוסף, מחקר זה קובע את התנאים osteoinductive האופטימלי עבור שיתפקדו אנושי על בסיס ממצאים אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול המחקר אושרה על ידי המוסדיים סקירה לוח של צ'אנג קונג ממוריאל החולים. כל המשתתפים מסופקים בכתב הסכמה מדעת.

1. רקמות הכנה

  1. הקציר חידוש רקמות מחולים במהלך ניתוח שיניים (איור 1). לאחר הרהור דש בהרדמה מקומית, קחי פיסה של רקמת קרום העצם העצם מכתשיים באמצעות מפריד חידוש31.
  2. לאחר הקטיף, לאחסן את הפרוסות חידוש רקמות של 5 מ מ × 2 מ מ מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) עם U/mL 300 של פניצילין, 300 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין. העברת הרקמות למעבדה תוך 24 שעות.
  3. מינצ השברים מכתשי חידוש רקמות עם אזמלים עד טחון היטב ולשמור את הדגימות מעבר 0 בינוני (מורכב של U/mL 300 של פניצילין 300 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין, α-מ 5% סרום שור בעובר [FBS]) תרבותי בתוך אינקובטור ב 37 ° C עם humidified האוויר (5% פחמן דו-חמצני). בחממה, להכין קערה מים כדי לשמור על לחות.
  4. לשנות את המדיום לאחר 3 ימים פעמיים בשבוע לאחר מכן.
  5. כאשר התאים הגיעו subconfluence (80%), לשחרר את התאים חסיד עם 200 µL של 0.25% טריפסין בחממה (37 מעלות צלזיוס) למשך 3 דקות, ולאחר מכן השתמש 4.5 מ של המדיום כדי לסיים את התגובה.
  6. צלחת התאים שוב מעבר טרי 1 בינוני (α-מ, 10% FBS, 100 יחידות/mL פנצילין ולאחר μg/mL 100 של סטרפטומיצין). צלחת הוא 5 × 103 תאים (לפי ספירת של hemocytometer).
  7. לבצע כל קטע עוקבות אחרי התאים להשיג למפגש 80%31.
    הערה: בראשית, המדיום יהיה כתום אדום. לאחר שלושה ימים בערך, צבע בינוני אמור להשתנות בגוון צהבהב. הפעם הכפלה של התאים הוא בערך 30-40 h, הזקוקים 7 ימים במשך 3-5 דורות.
  8. תרבות שיתפקדו מבודדים בα-מ בתוספת 10% FBS, U/mL 100 של פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  9. להתבונן צמיחת תאים מדי יום ולהחליף את מדיום הגידול פעמיים בשבוע. השתמש כדי החמישית-הדור השלישי תאים לניסויים נוספים.

2. דנ

  1. קציר 1 × 106 תאים דרך מערכת העיכול טריפסין:
    1. להוסיף 200 µL של טריפסין 0.25%. לאחר 3 דקות, השתמש 4.5 מ של תרבות בינוני המכיל FBS כדי לסיים את התגובה של טריפסין ולאסוף באמצעות צנטריפוגה (1500 סל ד, 5 דקות, 22 ° C).
    2. לשטוף את כדורי תא שלוש פעמים באמצעות 1 x DPBS. Resuspend תאי µL 200 1 x מאגר permeabilization. לספור את התאים עם hemocytometer.
  2. לבחון את סמני פני ביטוי הביע של שיתפקדו דרך לזרום cytometry (תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון)32. להשתמש נוגדנים חד-שבטיים (MAb) נגד CD19 (fluorescein isothiocyanate (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE) ותזמורת כלי קשת-1 (אלכס), ד ר הלע (FITC)32.
    1. הוסף את הנוגדנים דגימות והתרבות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. לשטוף את התאים עם 1 x DPBS שלוש פעמים.
    3. לתקן את התאים באמצעות 2% פורמלדהיד והמשך עם ניתוח cytometry זרימה32.

3. תא המצורף ואת הכדאיות עם Osteogenic, Adipogenic ו Chondrogenic בידול

זירוז התמיינות התאים לתוך osteogenic, adipogenic, ו chondrogenic שושלות מאת culturing חידוש התאים כל שלושה מעברים על שש-ובכן צלחות עם מדיה התמיינות ספציפיים.

  1. עבור בידול osteogenic, התרבות התאים α-מ ב צפיפות של תאים 5000 לכל טוב על צלחות תרבות שש-. טוב.
    1. על השגת 80% הנהרות, התרבות התאים המדיה המכילה α-גברתי, 5% FBS, β-glycerophosphate (10 מ מ),−7 M 10 דקסמתזון (0.1 מ מ), ו- 5 מ ל חומצה אסקורבית (100 אמ). תרבות הפקד שליליים בתקשורת בהיקף של α-מ ו-5% FBS.
    2. לשנות את המדיה פעמיים בשבוע.
    3. לאחר 4 שבועות, להעריך את הפוטנציאל של התאים כדי להתמיין השושלת osteogenic על ידי מכתימה את התאים באמצעות וזמינותו של פון Kossa, המפרידה הנוכחות של הפקדות מסויד ב תרבות33.
      1. להוסיף 10% פורמלין לתיקון. בתוך 30 דקות, להוסיף 5% כסף חנקתי, להתייחס מתחת לאור אולטרה סגול (UV) לשעה בטמפרטורת החדר.
      2. להוסיף נה 5%2כדי4 ארבע פעמים, המאפשר 3 דקות על כל תגובה. לבסוף, יש לשטוף את התאים פעמיים עם מים מזוקקים.
        הערה: פון Kossa מכתים הוא תגובה משקעים איפה יוני כסף ואנטיביוטיקה פוספט מגיבים בנוכחות חומר חומצי; טכניקה מכתימים זו אינה ספציפית סידן. במחקר זה, כאשר התאים ובדוקים שטופלו כסף חנקתי פתרון, סידן — אשר הוא מופחת על ידי אור UV חזקה – הוחלף על ידי כסף, אשר הפך גלוי כמו כסף מטאלי.
  2. עבור בידול adipogenic, התרבות התאים-צפיפות של תאים 5000 לכל טוב על לוחות שש-ובכן תרבות המכיל α-מ.
    1. על השגת 80% הנהרות, התרבות התאים המדיה המכילה α-מ, 5% FBS, 0.5 מ מ 3-איזובוטיל-1-methylxanthine (100 מ"ג/מ"ל), 1% פניצלין 10 דקסמתזון−6 מ' (1 מ מ) אינסולין (5 מ"ג/מ"ל), indomethacin (60 מ מ).
    2. תרבות הפקד שליליים בתקשורת בהיקף של α-מ ו-5% FBS.
    3. לאחר 6-9 שבועות, להשתמש בשמן O אדום כדי להכתים את התאים להדגיש טיפות שומנים בדם, ובכך לקביעת הנוכחות של בידול adipogenic33:
      1. להוסיף 10% פורמלין לתיקון. בתוך 30 דקות, מכתים התאים עם 0.5% שמן אדום O בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 60% אלכוהול איזופרופיל למשך 3 דקות בכל פעם; לבסוף, יש לשטוף את התאים עם מים מזוקקים.
        הערה: שמן אדום O הוא lysochrome (מסיס בשומן) diazo צבע המשמש עבור צביעה של שומנים נייטרלי, בעיקר אסטרים triacylglycerol ליפופרוטאין, כולסטרול. לצבוע מתמוסס ב טיפות השומנים בתא, מאדימה את טיפות השומנים.
  3. עבור chondrocyte בידול, התרבות תאים על לוחות שש-ובכן תרבות עם כל טוב המכיל תאים 5000.
    1. להוסיף על בידול בינוני שמכילים α-מ 5% FBS,−7 M 10 דקסמתזון (0.1 מ מ), נתרן פירובט (100 µg/mL), אינסולין-transferrin-סלניום-A (1 × ITS), הפיכת גורם גידול-β (10 ng/mL), 5 מ ל חומצה אסקורבית (100 מיקרומטר).
    2. תרבות הפקד שליליים בתקשורת בהיקף של α-מ ו-5% FBS.
    3. אחרי 4-5 שבועות, להשתמש Alcian כחול מכתים כדי להדגיש את פוליסכרידים חומצי, כגון glycosaminoglycans או סוגים מסוימים של mucopolysaccharides, ב- הסחוס של התאים כדי לקבוע הנוכחות של בידול chondrocyte33.
      1. להוסיף 10% פורמלין לתיקון. בתוך 30 דקות, להוסיף 3% חומצה אצטית ולאפשר 2 דקות בשביל התגובה. לאחר מכן, לשטוף עם מים מזוקקים שלוש פעמים, להוסיף 1% Alcian כחול 8GX הדגירה במשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים. לבסוף, להוסיף 3% חומצה אצטית ושטוף במשך 3 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים לסיים.
        הערה: חלקי התא במיוחד כתם על ידי זה דיי להיות כחול עד כחול-ירוק אחרי מכתים, והם נקראים "alcianophilic".

4. השפעות של 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2יח3) על פרכת

  1. לפצל את P3 כדי שיתפקדו P5 שש קבוצות ותרבות על 6-ובכן צלחות עם מדיה תרבות שונים:
  2. קבוצת שלילי (α-מ ו-5% FBS);
  3. קבוצת ויטמין C (α-מ 5% FBS, 10 מ מ β-glycerophosphate, דקסמטסון 10−7 ז + 100. ויטמין C);
  4. וקבוצה 10−7 M 1,25-(OH)2D3 (α-מ, 5% FBS, 10 מ מ β-glycerophosphate, ואת דקסמתזון מ'−7 10 + 10−7 M 1,25-(OH)2יח3).
  5. להוסיף 2 מ"ל של המדיום באינקובטור (37 מעלות צלזיוס) כל טוב ושנה המדיום פעמיים בכל שבוע.

5. הפוך תמלול/כמותי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת

  1. לאחר d 7 אוסטאובלסט בידול, לבודד את הרנ א הכולל על קרח באמצעות תגובה כימית המסחרי (ראה טבלה של חומרים):
    1. להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט בידוד כל טוב. להוסיף 200 µL של bromochloropropane להשאיר 10 דקות ליצירת RNA בשכבות ולאחר מכן צנטריפוגה-במהירות של 10,000 סל ד למשך 15 דקות ב 4 º C.
    2. לאחר צנטריפוגה, להוסיף 500 µL של 2-פרופנול µL 500 של RNA המכיל supernatant. לזרז את הרנ א על הקרח ולאפשר 15 דקות עבור התגובה.
    3. לאחר הניתוח, צנטריפוגה-12,000 סל"ד למשך 15 דקות ב 4 ° C, לאחר מכן הרנ א ממוקם בתחתית הצינורית. לאחר מכן, להסיר את תגובת שיקוע באמצעות 1 מ"ל של 75% אלכוהול לרחצה, צנטריפוגה-7,500 סל"ד למשך 8 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
    4. הסר את תגובת שיקוע ולהשתמש concentrator ואקום לייצור RNA מהחלק התחתון של הנוזל. לשחזר עם מים.
  2. הפוך לתמלל את הרנ א (1 μg) באמצעות myeloblastosis העופות וירוס רוורס טרנסקריפטאז. קבע את תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) לפעול ב 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ואחריו 50 ° C עבור 60 דקות ולאחר מכן 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לפני שמירה לבסוף ב 4 º C.
  3. לסנתז הראשון-גדיל DNA משלימים (cDNA). לבצע PCR כמותי (qPCR) באמצעות 5 μL של 1:10 מדולל cDNA. התנהלות RT-PCR כמותי (לרביעיית-PCR) באמצעות תחל ALP, BSP, OCN, CBFA1 של קולגן-1.
    הערה: כדי למנוע זיהום דנ א י, רצפי ואחורה כל פריימר עוצבו על exons נפרדים.
  4. לבצע qPCR באמצעות תבנית בסיס PCR מסחרי לערבב (ראה טבלה של חומרים) בהתאם להוראות היצרן. הגדר הצנטרפוגה תרמי ב 50 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות ולאחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 40 מחזורי כל אחד ב- 95 ° C 15 s ולאחריו 60 ° C 60 s.
    הערה: פרוטוקול SYBR גם דורש שלב עקומת להמיס, אשר מנוהלת ב 95 ° C 15 s, 60 ° C 60 s ולאחר מכן 95 ° C 15 s.
  5. לנרמל את ערכי הסף מחזור ALP, BSP, CBFA1, קולגן-1, ו- OCN לזה של הגן משק בית GAPDH. 34
  6. פריימר זוגות מפורטים בטבלה של חומרים.

6. פעילות פוספטאז אלקליין

  1. להעריך את פעילות האנזים ALP של התאים באמצעות טכניקה שתואר לעיל35, אשר ממירה p- nitrophenyl פוספט p- nitrophenol; p- nitrophenyl פוספט הוא מצע פוספטאז הופך צהוב כאשר dephosphorylated על ידי ALP, כפי שנקבע ב 405 ננומטר אורך גל. לנרמל את הסיכום p- nitrophenol נוצר בהתבסס על החלבון הכולל כפי שנקבע על ידי וזמינותו ברדפורד.
  2. להשוות בין הפעילויות ALP של הפקד (α-גברתי, 5% FBS), ויטמין C (α-גברתי, 5% FBS, 10 מ מ β-glycerophosphate, דקסמטסון 10−7 ז + 100 אמ ויטמין C), 1,25-(OH)2D3 (α-מ, 5% FBS, 10 מ מ β-glycerophosphate, 10−7 M דקסאמתאזון + 10−8 M 1,25-(OH)2יח3), ו ויטמין C +2D 1,25-(OH)3 (α-גברתי, 5% FBS, 10 מ מ β-glycerophosphate, דקסמטסון 10−7 ז + 100 אמ ויטמין C +1,25-(OH)2יח3) קבוצות אחרי שבוע 1, 2, 3, ו 4 של תרבות.
  3. לבצע הליך שאיבת חלבון קרח:
    1. לגרד את התאים מן הלוחות 6-ובכן ולהוסיף 50 µL פירוק המאגר. כתוצאה מכך, במקום התאים על הקרח למשך 30 דקות להשמיד את התאים חינם החלבון.
    2. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה-13000 סל ד ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר צנטריפוגה, לחלץ את תגובת שיקוע עבור אחסון ושימוש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור כל מבחני כמותית, הנתונים מוצגים כמו הממוצע ± סטיית התקן (SD). כל ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות הסטודנט t-מבחן. בסך הכל, דגימות 34 התקבלו עם המשתתף שהגיל 48.1 ± 12.3 י' 11 הדוגמאות הללו התקבלו חולים זכר ו- 23 של המטופלות. עשרים ושמונה דגימות, התקבלו האזורים טוחנת ושישה מאזורים הקדמי; 26, התקבלו את הלסת העליונה ו- 8 של הלסת התחתונה. משך רעה בין ההליך שיניים התרבות היה 0.5 ± 0.1 h. של הדגימות ובדוקים 34, 20 הניב בהצלחה מושבות MSC, עם שיעור הבידוד מוצלח של 58.8%. אין הבדלים מש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודאליות טיפוליות שפותחו לאחרונה, כלומר רקמות הנדסה פרוגרמה MSCs, יש יתרונות רבים. MSCs, אשר נמצאים בכמה סוגי רקמות, תאים multipotent יכולים להתמיין מגוון תאי רקמה תפקודית mesodermal37 הינם תאים אחרים כגון תאי העצם.

קרום העצם משמש משרה עבור ובתאים והוא בתור אספקת עשיר להערכת עצם עוטף38. במחקר שלנו, של הדגימות ובדוקים 34, 20 הניב בהצלחה מושבות MSC, עם שיעור הבידוד מוצלח של 58.8%. MSCs נגזר קרום העצם נבחרו במחקר זה מבוסס על התפשטות ויכולות בידול os...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול המחקר אושרה על ידי ועדת הבדיקה מוסדי עבור קליני מחקר של צ'נג קונג לבית חולים (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B ו- 103-4223C). מחקר זה נתמך על ידי בית החולים ממוריאל קונג צ'אנג (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 ו NMRPG3C0151). כתב יד זה נערך על-ידי עריכה אקדמית וואלאס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין-EDTAGibco25200-056
2-פוספו-L-חומצה אסקורבית מלח טריסודיוםסיגמא49752
צלחות תרבית 35 מ"מקורנינג430165
3-איזובוטיל-1-מתילקסנטיןסיגמאI5879
6  צלחת בארקורנינג3516
פוספטאז אלקלייןABIHs01029144_m1
אלקליין פוספטאז פעילות ערכת בדיקה קולורימטריתBioVisionK412-500
וירוס מיאלובלסטוזיס עופות טרנסקריפטאז הפוךRoche10109118001
CD146BD561013
CD19BD560994
CD34BD560942
CD44BD561858
CD45BD561088
CD73BD561014
CD90BD561974
בנקאי תאים1ZEAOAQ11888
גורם קשירת ליבה אלפא-1ABIHs00231692_m1
דקסמתזוןסיגמאD4902
DPBSGibco14190250
FBSGibco26140-079
GAPDHABIHs99999905_m1
HLA-DRBD
אינדומתציןSigmaI7378
אינסוליןsigma91077C
אינסולין– transferrin– סלניום-ASigmaI1884
מיקרואמפ צלחת תגובה מהירה 96 באר (0.1 מ"ל)חיים4346907
מיקרואמפ סרט דבק אופטיחיים4311971
מינימום חיוני בינוני 1X שינוי אלפאHyCloneSH30265.02
פניצילין/סטרפטומיציןGibco15140-122
מאגר פרמביליזציהeBioscience00-8333-56
נתרן פירובטGibco11360070
STRO-1BioLegend340103
SYBER Green PCR Master MixApplied Biosystems4309155
TaqMan Master MixLife4304437
שינוי גורם גדילה ובטא;סיגמאT7039 
מגיב טריזול (לבידוד RNA)Life15596018
β-glycerophosphateSigmaG9422
collagen-1Invitrogenקדימה פריימר 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
פריימר הפוך 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'OCN
Invitrogenפריימר קדימה 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
פריימר הפוך 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'BSP
Invitrogenקדימה פריימר 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
פריימר הפוך 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'פריימרים
מסחריים
ALP מסחריים CBFA1 פריימרים מסחריים
562008

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79(2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9 (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. , CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. , Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. , Article ID 3529561 (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28 (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53 (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22 (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81 (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27 (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122 (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65 (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

D3RT PCR1Von Kossa

מאמרים קשורים