אנו מתארים פרוטוקול גילוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה איגוד של הקולטן מיון, sortilin, כדי luminal הלולאה הראשונה של החלבון טרנספורטר גלוקוז, GLUT4, כדוגמא.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה
במאמר זה
סיכום
תקציר
היכולת שלנו לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון הוא המפתח להבנת חיבורים רגולטוריות בתא. עם זאת, זיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון במקרים רבים מזוהה עם אתגרים משמעותיים ניסיוני. בפרט, קולטנים המיון אינטראקציה עם שלהם מטען החלבון בלומן של ממברנות התאים לעיתים קרובות באופן רגיש דטרגנט, ביצוע co-immunoprecipitation של חלבונים אלה לבלתי שמיש. עקדת sortilin קולטן המיון כדי נשא גלוקוז ש-glut4 עשוי לשמש דוגמה חלש luminal אינטראקציות בין חלבונים ממברנה. כאן, אנו מתארים assay מהירה, פשוטה וזולה כדי לאמת את האינטראקציה בין sortilin לבין GLUT4. בשביל זה יש תוכנן ואנו מסונתז כימית פפטיד מתויג myc התואם epitope sortilin מחייב פוטנציאליים בחלק luminal של GLUT4. מתויג עם שש histidines Sortilin הייתה הביע בתאים בתרבית של, מבודד lysates תא באמצעות קובלט חרוזים. Sortilin ותשמרו על החרוזים, נדגרה עם הפתרון פפטיד-ערכי pH שונים, החומר eluted נותחה על ידי סופג המערבי. Assay זו ניתן להתאים בקלות ללמוד אינטראקציות רגיש אבקת חלבון אחרים.
מבוא
GLUT4 הוא חלבון נשא גלוקוז הבאה לידי ביטוי בעיקר תאי שריר השלד ונטייה איפה זה שמתווכת ההשפעה של אינסולין על דם מים אחרונים גלוקוז סיווג1. להיות חלבון יציב מאוד, GLUT4 מוסדר ברמה post-translational. בהעדר אינסולין, GLUT4 הוא נשלל במידה רבה של קרום פלזמה (ומכאן נמוכה חדירות הבזליים של גלוקוז), הוא מקומי בעיקר בתוך התא שלפוחית קטנה מגיב לאינסולין (IRVs) ורשת הטרנס-גולג'י (TGN) סביר לייצג תא תורם אירב. על ניהול אינסולין, IRVs הפתיל עם קרום פלזמה ולספק GLUT4 לאתר של תפקודו. פעולה זו מגדילה את החדירות של קרום פלזמה על גלוקוז, אז את ספיגת הגלוקוז מהדם לתוך adipocytes של תאי שריר השלד עולה 10 כדי 40-fold. לאחר נסיגת אינסולין, GLUT4 הפנימו לתוך endosome....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הטיפול פפטיד
- עיצוב וסידור של פפטיד
- לבחור את רצף פפטיד הרצוי, וכן להוסיף תג, כגון myc epitope (EQKLISEED) בבית שלה או או C-אמיני.
- בדוק המסיסות החזוי פפטיד במים, באמצעות פפטיד מסיסות מחשבון http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. אם המסיסות נמוכה, נסה להוסיף תג אחר מסיסים במים כדי לשנות את האיזון תשלום.
הערה: השתמשנו על פפטיד המתאים לתמונה luminal הראשון (fll) של GLUT4 המתויגת את epitope myc (גופן מודגש) התחנה הסופית N (Myc-fll-GLUT4): LNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA EQKLISEEDשיש לו "טוב" החזוי מסיסות במים . - להזמין את פפטיד מותאם אישית לפחות 75% טוהר אשר היא מספקת וזמינותו, לבקש את הספק ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Lysates הוכנו מ 3T3 L1 בתאים stably transfected עם Sortilin-myc/שלו5 , מתאי L1 3T3 WT, משמש פקד שלילי. Lysates שניהם היו מודגרות עם חרוזים קובלט-pH 6 או pH 8 ושטף ביסודיות. חרוזים עם חלבונים קיבוע היו אז מודגרות בפתרון של Myc-fll-Glut4. לאחר שוטף זהיר, חלבונים מאוגדים החרוזים היו eluted עם 0.25 M Imidazole. הדגימות היו נתונים, יחד עם lysates המקורי, מרחביות עמודים ב- Tricine 10-20% ג'ל הדרגתיות ואחריו סופג המערבי עם נוגדן אנטי-Myc שמותר איתור של שני sortilin-myc/של.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Sortilin הוא קולטן אבולוציונית שנשמרת ליגנד רב חלבון שמעורב הן איתות על קרום פלזמה, תאיים מיון אירועים6,7. עם זאת, החיפוש אחר ליגנדים של sortilin אותנטי (שחלקם הם חלבוני ממברנה luminal או אינטגרלי) הוא מסובך כפי האינטראקציה של sortilin עם חלק משותפיה הכריכה מופיע יהיה רגיש דטרגנטים. לכן, קל וגישה נרחבת ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון, co-immunoprecipitation, לא ניתן ליישם בקלות. כמה קבוצות מחקר השתמשו co-immunoprecipitation כדי להדגים את האינטראקציה בין sortilin לב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר DK52057 ו- DK107498 של NIH על K.V.K. X.P נתמכה על ידי 2T32DK007201 גרנט הדרכה מוסדית של NIH.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קוקטייל מעכב פרוטאז | Sigma | P8849 | לשימוש בטיהור חלבון תג היסטידין |
| תמיסת מלח פוספט חומצית | קורנינג | 21-040-CV | PBS |
| 1 מ"ל מזרק אינסולין U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA ערכת בדיקת חלבון | פירס | 23228 | |
| מאגר כביסה | Boston BioProducts | BP-234 | לטיהור חלבון His-tag |
| HisPur שרף קובלט | Thermo Scientific | 89964 | |
| מאגר דגימת טריצ'ין | Bio-Rad | 161-0739 | עם SDS, יש להוסיף bMercaptaethanol |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | לטיהור חלבון His-tag עם 250 מ"מ Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine ג'לים טרומיים 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | להפרדת פפטיד וחלבון קטן |
| Tris/tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| מאגר העברה | Boston BioProducts | BP-190 | הוסף 20% מתנול |
| ניטרוצלולוז ממברנה 0.45 מ"מ | Bio-Rad | 1620115 | |
| בקר סרום אלבומין | סיגמא | A9647 | BSA |
| אנטי Myc נוגדן | איתות תאים | 2272 | |
| פפטיד | ארנב Genscipt | התאמה אישית של הזמנת | |
| חלבון דיוק פלוס צבע כפול Standarts | BioRad | 161-0374 |
מקורות
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pa....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
