זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

Summary

אנו מתארים פרוטוקול גילוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה איגוד של הקולטן מיון, sortilin, כדי luminal הלולאה הראשונה של החלבון טרנספורטר גלוקוז, GLUT4, כדוגמא.

Abstract

היכולת שלנו לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון הוא המפתח להבנת חיבורים רגולטוריות בתא. עם זאת, זיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון במקרים רבים מזוהה עם אתגרים משמעותיים ניסיוני. בפרט, קולטנים המיון אינטראקציה עם שלהם מטען החלבון בלומן של ממברנות התאים לעיתים קרובות באופן רגיש דטרגנט, ביצוע co-immunoprecipitation של חלבונים אלה לבלתי שמיש. עקדת sortilin קולטן המיון כדי נשא גלוקוז ש-glut4 עשוי לשמש דוגמה חלש luminal אינטראקציות בין חלבונים ממברנה. כאן, אנו מתארים assay מהירה, פשוטה וזולה כדי לאמת את האינטראקציה בין sortilin לבין GLUT4. בשביל זה יש תוכנן ואנו מסונתז כימית פפטיד מתויג myc התואם epitope sortilin מחייב פוטנציאליים בחלק luminal של GLUT4. מתויג עם שש histidines Sortilin הייתה הביע בתאים בתרבית של, מבודד lysates תא באמצעות קובלט חרוזים. Sortilin ותשמרו על החרוזים, נדגרה עם הפתרון פפטיד-ערכי pH שונים, החומר eluted נותחה על ידי סופג המערבי. Assay זו ניתן להתאים בקלות ללמוד אינטראקציות רגיש אבקת חלבון אחרים.

Introduction

GLUT4 הוא חלבון נשא גלוקוז הבאה לידי ביטוי בעיקר תאי שריר השלד ונטייה איפה זה שמתווכת ההשפעה של אינסולין על דם מים אחרונים גלוקוז סיווג¹. להיות חלבון יציב מאוד, GLUT4 מוסדר ברמה post-translational. בהעדר אינסולין, GLUT4 הוא נשלל במידה רבה של קרום פלזמה (ומכאן נמוכה חדירות הבזליים של גלוקוז), הוא מקומי בעיקר בתוך התא שלפוחית קטנה מגיב לאינסולין (IRVs) ורשת הטרנס-גולג'י (TGN) סביר לייצג תא תורם אירב. על ניהול אינסולין, IRVs הפתיל עם קרום פלזמה ולספק GLUT4 לאתר של תפקודו. פעולה זו מגדילה את החדירות של קרום פלזמה על גלוקוז, אז את ספיגת הגלוקוז מהדם לתוך adipocytes של תאי שריר השלד עולה 10 כדי 40-fold. לאחר נסיגת אינסולין, GLUT4 הפנימו לתוך endosomes/מיון מוקדם, ואז שאוחזרו כדי TGN איפה IRVs מחדש נוצרו. מיון שני השלבים מסלול GLUT4 קרי לאחזור בלבד endosomes מוקדמת היקפיים כדי perinuclear TGN, היווצרות IRVs על התורם TGN ממברנות מופעלות על ידי בן משפחה Vps10p, sortilin, אשר מייצג את סוג אני חלבון טראנסממברנלי, קולטן המיון. על פי מודל אחד, sortilin עובד כמו חלבון transmembrane לגרדום: זה נקשר GLUT4 ב לומן של endosomes, TGN, ומגייסת מתאמים retromer או clathrin cytoplasmic לצד התורם ממברנה ויה שלה קרבוקסילי^{2, 3}. זה מקל על ההתפלגות של GLUT4 לתוך לחברות התעופה vesicular translocate GLUT4 בין תאים תאיים.

האינטראקציה של זנב cytoplasmic של sortilin עם retromer, חלבונים שונים מתאם תועד היטב. עם זאת, הכריכה של sortilin GLUT4 (וכדי מספר שלה ליגנדים חלבונים אחרים) מאתגרת כדי להוכיח. בפרט, ניסיונות co-immunoprecipitate sortilin של GLUT4 לא היו מוצלחות כנראה בגלל מהות האינטראקציה בין שני חלבונים אלה הרגישים דטרגנט. בנוסף, כמו חלבון טיפוסי טרנספורטר, GLUT4 יש תחומים transmembrane 12 לולאות luminal 6 כל שילוב של אשר ייצגו שעשויות להיות אתר איגוד sortilin. במקביל, גוף גדול של ראיות נסיבתיות, כגון לוקליזציה שותף משמעותי בתא, cross-linking עם DSP קרום חדיר, האינטראקציה במערכת היברידית שני שמרים להציע את sortilin יכולים לאגד GLUT4. יתר על כן, באמצעות גישה האחרון בשילוב עם אלנין סריקה מוטגנזה מכוונת, אנחנו קודם לכן קבעו כי תחום Vps10p של sortilin נקשר בעיקר הלולאה luminal הראשון של GLUT4. עם זאת, ההוכחה של אינטראקציה כזו בתאים בתרבית של נעדר. כאן, יש בודדנו שלו מתויג sortilin מ transfected 3T3-L1 בתאים באמצעות שרף קובלט והפגינו זה יכול לקיים אינטראקציה עם פפטיד מסונתז כימית המתאים לתמונה luminal הראשון של GLUT4 ב- pH 6 ו- pH 8 הדומות לרקע חומצי, endosomal לומן, סביבה נייטרלית לומן של הממברנות TGN. אין איגוד פפטיד התגלה בניסויים שליטה בו תמצית מקריסטלים של תאים שאינם transfected הוטען על החרוזים באותו.

Protocol

1. הטיפול פפטיד

1. עיצוב וסידור של פפטיד
   1. לבחור את רצף פפטיד הרצוי, וכן להוסיף תג, כגון myc epitope (EQKLISEED) בבית שלה או או C-אמיני.
   2. בדוק המסיסות החזוי פפטיד במים, באמצעות פפטיד מסיסות מחשבון http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. אם המסיסות נמוכה, נסה להוסיף תג אחר מסיסים במים כדי לשנות את האיזון תשלום.
      הערה: השתמשנו על פפטיד המתאים לתמונה luminal הראשון (fll) של GLUT4 המתויגת את epitope myc (גופן מודגש) התחנה הסופית N (Myc-fll-GLUT4): LNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA EQKLISEEDשיש לו "טוב" החזוי מסיסות במים .
   3. להזמין את פפטיד מותאם אישית לפחות 75% טוהר אשר היא מספקת וזמינותו, לבקש את הספק מסיסות הבדיקה. הפרד את הסדר לתוך aliquots לפחות שני במקרה של בעיות בלתי צפויות עם המסת את פפטיד.
      הערה: Myc-fll-GLUT4 פקדו ב- aliquots שני. מסיסות שדווחה שלה במים הנדסה גנטית היא ≤10 מ"ג/מ"ל.
2. המסת את פפטיד
   הערה: הנדסה גנטית מים הוא הממס הטוב ביותר. אם פפטיד אינו מופיע להיות מסיסים במים, עיין http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html לקבלת הוראות.
   1. הכן 100 x הפתרון עובד של פפטיד במים הנדסה גנטית או במאגר של בחירה, עם ריכוז μg/מ.
   2. להפריד את הפתרון לתוך 50-100 µL aliquots ואחסן אותם ב-20 ° C.

2. טיפול של תאים

1. תרבית תאים
   1. השתמש פראי סוג (WT) תאים פקד שלילי, וכן תאים המבטאים את חלבון המטרה מתויג עם 6 histidines (HisP).
      הערה: השתמשנו 3T3 L1 טרום adipocytes stably transfected עם Sortilin-myc/שלו⁵.
   2. לגדל את התאים של Dulbecco בינוני נשר שונה (DMEM) גבוה סוכר, בתוספת 10% עגל שור סרום, פניצילין/סטרפטומיצין (5 μg/mL) ב 37 ° C ב- 10% CO₂וגם גלוטמין (2 מ מ).
   3. שב ארבע המנות 10 ס מ של תאים, transfect שניים מהם עם HisP, transfect השניים האחרים עם שליטה פלסמיד (WT). 48 שעות לאחר תרביות תאים, התאים צריכים להגיע confluency 80-90%.
2. הכנת Lysates תא
   1. הכנת מאגר פירוק (10 מ מ Hepes, 30 מ מ NaCl, גליצרול 5%, 10 מ מ Imidazole, 0.5% טריטון X-100, פרוטאז מעכב קוקטייל ללא EDTA עבור הבידוד שלו מתויג חלבונים, pH 7.4) ולשמור אותו ב-4 ° c:
   2. לשטוף תאים שלוש פעמים עם 10 מ ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 º C.
   3. תניחו את הכלים על קרח ולהוסיף 500 µL מאגר פירוק כל מנה. לקצור את lysates תא באמצעות המגרד של התא.
   4. מקם את התא lysate של כל מנה לתוך צינור שונה mL 1.5. תווית הצינורות כמו HisP-pH8 HisP-pH6, WT-pH8, WT-pH6.
   5. עוברים את lysates תא מזרק עם מחט 26 גרם חמש פעמים למעלה ולמטה, פירוק השלם.
   6. Centrifuge את lysates תא ב g 16,000 x 10 דקות ב 4 º C.
   7. להעביר את supernatants צינורות שכותרתו זהה חדש.
   8. לנתח את ריכוז חלבון באמצעות ערכת Assay BCA חלבון או ערכת אחרים.
   9. באמצעות מאגר פירוק, איזון חלבונים ריכוז של כל lysates 4.
   10. נפרדים aliquot קטן (ca. 20 µL) של כל אחד lysate ולשמור אותו ב-20 ° C אפשרי ניסויים שליטה ו/או פתרון בעיות.

3. איגוד של חלבונים שלו מתויג החרוזים קובלט HisPur

1. השתמש שטיפת זמינים מסחרית מאגר או להכין אחד (50 מ מ נה₂HPO₄/NaH₂PO₄, 300 מ"מ NaCl, 20 מ מ imidazole, pH 8) ולשמור אותו ב 4 º C.
2. להכין שטיפת מאגר עם pH 6 מאת באיטליה שטיפת מאגר pH 8 עם HCl. לשמור אותו ב 4 º C.
3. מערבולת בעדינות את הבקבוק של חרוזים קובלט כדי לגרום להשעיית הומוגנית.
4. לוותר על µL 40 של ההשעיה חרוזים קובלט לתוך 4 1.5 mL שפופרות מסומן לעיל (שלב 2.2.4).
5. להוסיף 1 מ"ל של פירוק מאגר כל שפופרת, ו centrifuge הצינורות ב 1000 x g עבור 5 ס' לשאוב תגובת שיקוע, ומוסיפים μL 40 פירוק מאגר שיוחסו חרוזים.
6. הוסף את lysates תא הצינורות המתאימים.
7. דגירה הצינורות במשך 90 דקות ב 4 ° C-מסובב שפופרת-סל ד 20.
8. Centrifuge הצינורות-1000 x g עבור 5 s ולאסוף תגובת שיקוע. לשמור את תגובת שיקוע ב 4 º C.
9. להוסיף 500 µL של pH 8 או מאגר שטיפת pH 6 צינורות המתאימים, מחדש להשעות את החרוזים בעדינות.
10. Centrifuge הצינורות-g 1000 x עבור 5 s ו להשליך supernatants.
11. חזור על הצעדים ציונים של 3.10 ארבע פעמים.

4. עקדת פפטיד לחלבון שלו מתויג ותשמרו על חרוזים

1. באמצעות הפתרון עובד x 100 של פפטיד (שלב 1.2.1), להכין 1 x פתרונות עבודה ב- pH 6 או מאגר שטיפת pH 8 (100 שני µL aliquots עבור כל אחד, µg 1/mL).
2. להוסיף 100 μL של פתרון פפטיד x 1 החרוזים שטוף עם ה-pH המתאים.
3. דגירה החרוזים למשך 30 דקות ב 4 ° C-מסובב שפופרת-סל ד 20.
4. Centrifuge הצינורות-1000 g x עבור 5 s, לאסוף את תגובת שיקוע ולשמור אותו ב-20 ° C.
5. חזור על הצעדים ציונים של 3.10 ארבע פעמים.
   הערה: כדי להפחית רקע אפשרי, השלבים הבאים יכול להחליף צעדים 4.4 & 4.5.
6. לקחת ארבע עמודות מיקרו עם נקבוביות μm 30, לתייג אותם כמו שלב 2.2.4, ולמקם את העמודות אוסף צינורות.
7. לאחר השלמת שלב 4.3, להעביר את התערובת הדגירה לתוך העמודות, לאפשר את הפתרון לעבור על ידי הכבידה. להמשיך את הזרימה ב-20 ° C.
8. עוברים µL 500 מאגר לשטוף עם pH 6 או pH 8 דרך שלחצנו על ידי הכבידה. למחוק את הזרימה.
9. חזור על שלב 4.8 ארבע פעמים.
10. לאחר השטיפה האחרונה centrifuge את העמודות ב 1000 g x 15 s.

5. • תנאי של קובלט חרוזים

1. שימוש מסחרי Tricine דוגמת המאגר (200 מ"מ טריס-HCl, 40% גליצרול, 2% מרחביות, 0.04% Coomassie כחול, pH 6.8) ולהוסיף β-mercaptoethanol הריכוז הסופי של 2%.
2. להוסיף 40 µL Tricine דוגמת המאגר (עם β-mercaptoethanol) חרוזים שטף של מערבולת המדגם.
3. מחממים את הדגימות 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס, מערבולת הדגימות שוב, ו centrifuge הצינורות-1000 g x עבור 5 s.
   הערה: על מנת להקטין את הכריכה לא ספציפית אפשרי ב • תנאי, השלבים הבאים יכול להחליף צעדים 5.1-5.3.
4. להוסיף 40 μL • תנאי Imidazole מאגר (50 מ מ נה₂HPO₄/NaH₂PO₄, 300 מ"מ NaCl, 0.25 מ' imidazole) נסחפה חרוזים, מערבולת, דגירה הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
5. Centrifuge הצינורות ב 3000 g x עבור 30 s, לאסוף את תגובת שיקוע (דוגמאות eluted) ולהעביר אותו ל צינורות שכותרתו החדש.
6. להוסיף 40 μL Tricine מדגם מאגר כל שפופרת, מחממים את הדגימות 10 דקות-100 ° C, מערבולת, צנטריפוגה הצינורות-1000 g x עבור 5 s.
   הערה: אם העמודות מיקרו משמשים, להוסיף החרוזים שטף, המאגר • תנאי תקופת דגירה של 20 דקות, לאסוף את • תנאי על ידי צנטריפוגה ב 8000 g x למשך 2 דקות.
   הערה: דוגמאות ניתן לשמור ב-20 ° C עד אלקטרופורזה מבוצעת.

6. אלקטרופורזה החיוורים ומכתים המערבי

הערה: הדגימות מוכנים לצורך הקמת מכשול ההפרדה על ידי עמודים מרחביות סופג המערבי עוקבות. פעלתי לפי הנהלים של בג'ל (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) עם השינויים הבאים

1. השתמש זמינים מסחרית 10-20% Tricine ג'לים הדרגתיות.
2. על הג'ל, טען µL 20 של הדגימות eluted ו- µL 20 של lysates (שלב 2.2.10). לירי צרות, מומלץ כדי לטעון µL 20 של חומר לא מאוגדים (שלב 3.8) ו- 10 ng של פפטיד; לפני הטעינה, מוסיפים כמות שווה של מאגר מדגם Tricine הדוגמיות הללו.
3. לבצע אלקטרופורזה ב מסחרי טריס/Tricine/מרחביות הפעלת מאגר (100 מ מ טריס, 100 מ מ Tricine, ו- 0.1% מרחביות, pH 8.3).
4. להעביר את החומר הג'ל על גבי קרום ניטרוצלולוזה מיקרומטר 0.45 באמצעות מאגר העברה (בסיס טריס 25 מ מ, מ מ 192 גליצין, pH 8.4) בתוספת 20% מתנול.
5. לחסום את הקרום עם 3% שור אלבומין (BSA) לשעה בטמפרטורת החדר. באמצעות סמנים משקל מולקולרי מראש מוכתם כקווי עזר, לחתוך את הקרום אופקית למחוק את החלק העליון עם נוגדן נגד HisP, כתם החלק התחתון עם נוגדן נגד epitope myc כדי לזהות את פפטיד myc מתויגת.
   הערה: במקרה שלנו, חיתוך של הקרום לא נדרש מאחר HisP והן Myc-fll-GLUT4 יכול להתגלות עם נוגדן אנטי-myc.

7. ניתוח של תוצאות

1. לכמת את עוצמת כל הסימנים תספיג באמצעות תוכנית תחנת תמונה או ImageJ.
2. לנרמל את האות פפטיד מתויג myc נגד האיתות HisP-שני ערכי ה-pH.

Results

Lysates הוכנו מ 3T3 L1 בתאים stably transfected עם Sortilin-myc/שלו⁵ , מתאי L1 3T3 WT, משמש פקד שלילי. Lysates שניהם היו מודגרות עם חרוזים קובלט-pH 6 או pH 8 ושטף ביסודיות. חרוזים עם חלבונים קיבוע היו אז מודגרות בפתרון של Myc-fll-Glut4. לאחר שוטף זהיר, חלבונים מאוגדים החרוזים היו eluted עם 0.25 M Imidazole. הדגימות היו נתונים, יחד עם lysates המקורי, מרחביות עמודים ב- Tricine 10-20% ג'ל הדרגתיות ואחריו סופג המערבי עם נוגדן אנטי-Myc שמותר איתור של שני sortilin-myc/של...

Discussion

Sortilin הוא קולטן אבולוציונית שנשמרת ליגנד רב חלבון שמעורב הן איתות על קרום פלזמה, תאיים מיון אירועים^6,7. עם זאת, החיפוש אחר ליגנדים של sortilin אותנטי (שחלקם הם חלבוני ממברנה luminal או אינטגרלי) הוא מסובך כפי האינטראקציה של sortilin עם חלק משותפיה הכריכה מופיע יהיה רגיש דטרגנטים. לכן, קל וגישה נרחבת ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון, co-immunoprecipitation, לא ניתן ליישם בקלות. כמה קבוצות מחקר השתמשו co-immunoprecipitation כדי להדגים את האינטראקציה בין sortilin לב...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
קוקטייל מעכב פרוטאז	Sigma	P8849	לשימוש בטיהור חלבון תג היסטידין
תמיסת מלח פוספט חומצית	קורנינג	21-040-CV	PBS
1 מ"ל מזרק אינסולין U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA ערכת בדיקת חלבון	פירס	23228
מאגר כביסה	Boston BioProducts	BP-234	לטיהור חלבון His-tag
HisPur שרף קובלט	Thermo Scientific	89964
מאגר דגימת טריצ'ין	Bio-Rad	161-0739	עם SDS, יש להוסיף bMercaptaethanol
Elution  Buffer	Boston BioProducts	BP-236	לטיהור חלבון His-tag עם 250 מ"מ Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine ג'לים טרומיים 10-20%	Bio-Rad	456-3115	להפרדת פפטיד וחלבון קטן
Tris/tricine/SDS running buffer	Bio-Rad	161-0744
מאגר העברה	Boston BioProducts	BP-190	הוסף 20% מתנול
ניטרוצלולוז ממברנה  0.45 מ"מ	Bio-Rad	1620115
בקר סרום אלבומין	סיגמא	A9647	BSA
אנטי Myc נוגדן	איתות תאים	2272
פפטיד	ארנב Genscipt		התאמה אישית של הזמנת
חלבון דיוק פלוס צבע כפול Standarts	BioRad	161-0374