Method Article

מהר כסף מכתים פרוטוקול המאפשר פשוטה וסמנים יעיל לזיהוי של הסובייטית באמצעות ג'ל לזיהוי Non-denaturing

DOI:

10.3791/57192

⸱

April 20th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Guangzhou University, 2Hard Winter Wheat Genetics Research Unit, United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service, 3The UWA Institute of Agriculture, University of Western Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מדווחים על כסף ופשוט נמוכים מכתים פרוטוקול אשר דורש רק שלושה ריאגנטים, 7 דקות של עיבוד, מתאימה לדור מהירה של נתונים איכותיים הסובייטית בניתוח גנטי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חזור על הרצף פשוטה (הסובייטית) הוא אחד הסמנים היעיל ביותר בשימוש מחקר גנטי החי והצומח ותוכניות השבחה מולקולרית. צביעת כסף היא שיטה בשימוש נרחב עבור זיהוי סמני הסובייטית לזיהוי ג'ל. עם זאת, פרוטוקולים קונבנציונליים עבור צביעת כסף הם טכנית תובעניים ולגזול. כמו רבים אחרים מעבדה ביולוגית טכניקות, כסף מכתים פרוטוקולים מוטבו בהתמדה לשיפור יעילות הזיהוי. כאן, אנו מדווחים כסף פשוטה מכתים שיטת מפחית עלויות ריאגנט ומגבירה באופן משמעותי את הבהירות ברזולוציה ותמונה של זיהוי. השיטה החדשה דורש שני שלבים עיקריים (הספגה ופיתוח) שלושה ריאגנטים (חנקת הכסף נתרן הידרוקסידי, פורמלדהיד), ואת רק 7 דקות של עיבוד עבור ג'ל לזיהוי שאינם denaturing. לעומת פרוטוקולים שדווחה בעבר, שיטה חדשה תהיה קלה יותר, מהר יותר ומשתמש ריאקטיבים כימיים פחות לגילוי הסובייטית. לכן, זה כסף פשוטה, בעלות נמוכה ויעיל מכתים פרוטוקול ייהנו מיפוי גנטי והשבחה בסיוע סמן על ידי דור מהירה של נתונים סמן הסובייטית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיתוח של סמנים מבוססי ה-PCR יש מהפכה המדע של הצמח גנטיקה, רבייה1. סמנים (הסובייטית) אני חוזר פשוט רצף הם בין סמני DNA הנפוצות ביותר ואת הרב-גוניים ביותר. כיסוי רחב הגנום שלהם, לשפע, ירידה לפרטים הגנום, הדיר הם חלק היתרונות של סמנים הסובייטית בנוסף ירושה codominant שלהם עבור זיהוי אחרים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים2. מספר מחקרים השתמשו הסובייטית סמנים כדי לחקור מגוון גנטי, לעקוב אחר שושלת, לבנות תאחיזה מפות, מיפוי גנים עבור תכונות כלכלית3,4.

מוצרי ה-PCR של סמני הסובייטית בדרך כלל מופרדים באמצעות agarose או לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה ול....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מוצרי ה-PCR של סמני הסובייטית

  1. להכין כל כימיקלים, ריאגנטים עבור תגובות PCR כולל תבנית ה-DNA (30 ng/µL), מיקס מאסטר PCR × 2 (מכיל 2 × PCR מאגר, 0.4 מ מ כל dNTP, 3 מ מ של MgCl2, 0.1 U µL Taq DNA פולימראז ו צבע), 10 מיקרומטר של כל אחד קדימה ולהפוך תחל , ואת מזוקקים או יונים מים (dH2O).
    הערה: סמני הסובייטית השתמשו במחקר הנוכחי היו PT51333 (להעביר רצף פריימר: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3', רצף פריימר הפוכה: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') ו PT50903 (להעביר רצף פריימר: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' ו הפוך רצף פריימר: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3') טבק, CX-43 (להעביר רצף פריימר: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' הפוכה פריימר רצף:....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amplicons ה-PCR הופקו באמצעות המתאימים הסובייטית פריימר זוגות כרוב סיני פורח וטבק. לאחר אלקטרופורזה, ג'לים לזיהוי היו מוכתמים באמצעות הכסף לעיל מכתים פרוטוקול, אשר זוהה חד משמעית את הדפוסים סימון של סמנים הסובייטית (איור 1).

כדי להשוות את יעילות הזיהוי של שונים כסף מכתים פרוטוקולים, מוצרי ה-PCR הסובייטית סמני טבק, פריחה כרוב סיני הופרדו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל לזיהוי, visualized באמצעות חמש שפורסמו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכביסה של ג'ל לאחר העיבור הוא שלב קריטי. זמן הכביסה לא מספיק וכרך מים עשוי לגרום להסרת לא שלם של הספגה פתרון על פני השטח של הלוח ואת הג'ל, לגרום רקע כהה. הזמן המתאים לפתח עוד צעד מפתח, פיתוח יתר עלולה לגרום רקע בצבע חום כהה עם ניגודיות נמוכה התמונה שברי DNA. בנוסף, הצעד הספגה באופן משמעותי משפיע על יעילות מכתימים שברי DNA. למרות הארכת הזמן הספגה מעל 5 דקות או הגדלת כמות3 AgNO בפתרון הספגה ולשפר את איכות מוכתמים, הפחתת ההפריה זמן על פחות מ 3 דקות או להקטין את הכמות AgNO3 ( < 1 g) יכול לגרום אפור או ר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומן על ידי את גואנגדונג מדעי הטבע קרן של סין (2015A030313500), המחוז הבינלאומי המפתח פלטפורמה שיתופית המחקר המדעי המחקר פרוייקט של גואנג-דונג ההשכלה הגבוהה (2015KGJHZ015), המדע, תכנית טכנולוגיה של גואנג-דונג הניהול של מונופול טבק (201403, 201705), מדע, טכנולוגיה תוכנית של גואנג-דונג בסין (2016B020201001), הפרויקט הכשרה חדשנות לאומי עבור סטודנטים לתואר ראשון (201711078001). איזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה אך ורק לצורך אספקת מידע ספציפי, לא משתמע המלצה או אישור מאת לנו משרד החקלאות. משרד החקלאות הוא הזדמנות שווה ספק המעסיק.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תערובת מאסטר PCR (Green Taq Mix)Vazyme Biotech Co. Ltd, סין#P131-03
50-2000 bp סולם DNABio-Rad, ארה"ב#170-8200
DL500 סמן DNATakara Bio Inc., יפן#3590A
בסיס טריססנגון ביוטק שנגחאי, סין#77-86-1
חומצה בוריתסנגון ביוטק שנגחאי, סין#10043-35-3
EDTA-Na2Guangzhou מפעל ריאגנטים כימיים, סין#6381-92-6
אקרילאמידסנגון ביוטק שנגחאי, סין#79-06-1
N,N'-methylene-bis-acrylamideSangon Biotech שנגחאי, סין#110-26-9
N,N,N',N'-TetramethylethylenediamineSangon Biotech שנגחאי, סין#110-18-9
אמוניום פרסולפטגואנגג'ואו ריאגנט כימי ריאגנט, סין#7727-54-0
Bind-silaneSolarbio בייג'ינג, סין#B8150
AgNO3Sinopharm מגיב כימי בייג'ינג ושות', בע"מ, סין#7761-88-8
פורמלדהידטיאנג'ין DaMao מפעל ריאגנטים כימיים, סין#50-00-0
מפעל ריאגנטים כימיים NaOH גואנגג'ואו, סין#1310-73-2
מפעל ריאגנטים כימיים של חומצה אצטית גואנגג'ואו, סין#64-19-7
Na2< / sub>CO3< / sub>Tianjin DaMao מפעל ריאגנטים כימיים, סין# 497-19-8
מפעל ריאגנטים כימיים אתנול גואנגג'ואו, סין# 64-17-5
HNO< sub>3Guangzhou מפעל ריאגנטים כימיים, סין#7697-37-2
Na2S2O3.5H2Oסינופארם מגיב כימי בייג'ינג ושות', בע"מ, סין#10102-17-7
Eriochrome שחור T(EBT)טיאנג'ין DaMao מפעל ריאגנטים כימיים, סין# 1787-61-7
מגש פלסטיקשנחאי Yi Chen פלסטיק ושות', בע"מ, סין-TS-1
שייקרQilinbeter JiangSu, סין-BenQ
M800 סורקBenQ, סין-DYY-6C
ספק כוחבייג'ינג Liuyi מפעל מכשירים, סין-גבוה
בכל מערכות ג'ל אנכיות, JY-SCZFבייג'ינג Tunyi אלקטרופורזה ושות', בע"מ, סין-

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
  2. Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
  3. Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Silver StainingSSR MarkersNon denaturing GelPolyacrylamide GelGenetic ResearchMarker DetectionImpregnation DevelopmentDNA Fragment AnalysisGel ElectrophoresisChemical Reagents

Related Articles