כאן, אנו מדווחים על כסף ופשוט נמוכים מכתים פרוטוקול אשר דורש רק שלושה ריאגנטים, 7 דקות של עיבוד, מתאימה לדור מהירה של נתונים איכותיים הסובייטית בניתוח גנטי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מהר כסף מכתים פרוטוקול המאפשר פשוטה וסמנים יעיל לזיהוי של הסובייטית באמצעות ג'ל לזיהוי Non-denaturing
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
חזור על הרצף פשוטה (הסובייטית) הוא אחד הסמנים היעיל ביותר בשימוש מחקר גנטי החי והצומח ותוכניות השבחה מולקולרית. צביעת כסף היא שיטה בשימוש נרחב עבור זיהוי סמני הסובייטית לזיהוי ג'ל. עם זאת, פרוטוקולים קונבנציונליים עבור צביעת כסף הם טכנית תובעניים ולגזול. כמו רבים אחרים מעבדה ביולוגית טכניקות, כסף מכתים פרוטוקולים מוטבו בהתמדה לשיפור יעילות הזיהוי. כאן, אנו מדווחים כסף פשוטה מכתים שיטת מפחית עלויות ריאגנט ומגבירה באופן משמעותי את הבהירות ברזולוציה ותמונה של זיהוי. השיטה החדשה דורש שני שלבים עיקריים (הספגה ופיתוח) שלושה ריאגנטים (חנקת הכסף נתרן הידרוקסידי, פורמלדהיד), ואת רק 7 דקות של עיבוד עבור ג'ל לזיהוי שאינם denaturing. לעומת פרוטוקולים שדווחה בעבר, שיטה חדשה תהיה קלה יותר, מהר יותר ומשתמש ריאקטיבים כימיים פחות לגילוי הסובייטית. לכן, זה כסף פשוטה, בעלות נמוכה ויעיל מכתים פרוטוקול ייהנו מיפוי גנטי והשבחה בסיוע סמן על ידי דור מהירה של נתונים סמן הסובייטית.
מבוא
הפיתוח של סמנים מבוססי ה-PCR יש מהפכה המדע של הצמח גנטיקה, רבייה1. סמנים (הסובייטית) אני חוזר פשוט רצף הם בין סמני DNA הנפוצות ביותר ואת הרב-גוניים ביותר. כיסוי רחב הגנום שלהם, לשפע, ירידה לפרטים הגנום, הדיר הם חלק היתרונות של סמנים הסובייטית בנוסף ירושה codominant שלהם עבור זיהוי אחרים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים2. מספר מחקרים השתמשו הסובייטית סמנים כדי לחקור מגוון גנטי, לעקוב אחר שושלת, לבנות תאחיזה מפות, מיפוי גנים עבור תכונות כלכלית3,4.
מוצרי ה-PCR של סמני הסובייטית בדרך כלל מופרדים באמצעות agarose או לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה ול....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מוצרי ה-PCR של סמני הסובייטית
- להכין כל כימיקלים, ריאגנטים עבור תגובות PCR כולל תבנית ה-DNA (30 ng/µL), מיקס מאסטר PCR × 2 (מכיל 2 × PCR מאגר, 0.4 מ מ כל dNTP, 3 מ מ של MgCl2, 0.1 U µL Taq DNA פולימראז ו צבע), 10 מיקרומטר של כל אחד קדימה ולהפוך תחל , ואת מזוקקים או יונים מים (dH2O).
הערה: סמני הסובייטית השתמשו במחקר הנוכחי היו PT51333 (להעביר רצף פריימר: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3', רצף פריימר הפוכה: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') ו PT50903 (להעביר רצף פריימר: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' ו הפוך רצף פריימר: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3') טבק, CX-43 (להעביר רצף פריימר: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' הפוכה פריימר רצף:....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Amplicons ה-PCR הופקו באמצעות המתאימים הסובייטית פריימר זוגות כרוב סיני פורח וטבק. לאחר אלקטרופורזה, ג'לים לזיהוי היו מוכתמים באמצעות הכסף לעיל מכתים פרוטוקול, אשר זוהה חד משמעית את הדפוסים סימון של סמנים הסובייטית (איור 1).
כדי להשוות את יעילות הזיהוי של שונים כסף מכתים פרוטוקולים, מוצרי ה-PCR הסובייטית סמני טבק, פריחה כרוב סיני הופרדו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל לזיהוי, visualized באמצעות חמש שפורסמו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הכביסה של ג'ל לאחר העיבור הוא שלב קריטי. זמן הכביסה לא מספיק וכרך מים עשוי לגרום להסרת לא שלם של הספגה פתרון על פני השטח של הלוח ואת הג'ל, לגרום רקע כהה. הזמן המתאים לפתח עוד צעד מפתח, פיתוח יתר עלולה לגרום רקע בצבע חום כהה עם ניגודיות נמוכה התמונה שברי DNA. בנוסף, הצעד הספגה באופן משמעותי משפיע על יעילות מכתימים שברי DNA. למרות הארכת הזמן הספגה מעל 5 דקות או הגדלת כמות3 AgNO בפתרון הספגה ולשפר את איכות מוכתמים, הפחתת ההפריה זמן על פחות מ 3 דקות או להקטין את הכמות AgNO3 ( < 1 g) יכול לגרום אפור או ר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
עבודה זו מומן על ידי את גואנגדונג מדעי הטבע קרן של סין (2015A030313500), המחוז הבינלאומי המפתח פלטפורמה שיתופית המחקר המדעי המחקר פרוייקט של גואנג-דונג ההשכלה הגבוהה (2015KGJHZ015), המדע, תכנית טכנולוגיה של גואנג-דונג הניהול של מונופול טבק (201403, 201705), מדע, טכנולוגיה תוכנית של גואנג-דונג בסין (2016B020201001), הפרויקט הכשרה חדשנות לאומי עבור סטודנטים לתואר ראשון (201711078001). איזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה אך ורק לצורך אספקת מידע ספציפי, לא משתמע המלצה או אישור מאת לנו משרד החקלאות. משרד החקלאות הוא הזדמנות שווה ספק המעסיק.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תערובת מאסטר PCR (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, סין | #P131-03 | |
| 50-2000 bp סולם DNA | Bio-Rad, ארה"ב | #170-8200 | |
| DL500 סמן DNA | Takara Bio Inc., יפן | #3590A | |
| בסיס טריס | סנגון ביוטק שנגחאי, סין | #77-86-1 | |
| חומצה בורית | סנגון ביוטק שנגחאי, סין | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou מפעל ריאגנטים כימיים, סין | #6381-92-6 | |
| אקרילאמיד | סנגון ביוטק שנגחאי, סין | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech שנגחאי, סין | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech שנגחאי, סין | #110-18-9 | |
| אמוניום פרסולפט | גואנגג'ואו ריאגנט כימי ריאגנט, סין | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio בייג'ינג, סין | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm מגיב כימי בייג'ינג ושות', בע"מ, סין | #7761-88-8 | |
| פורמלדהיד | טיאנג'ין DaMao מפעל ריאגנטים כימיים, סין | #50-00-0 | |
| מפעל ריאגנטים כימיים NaOH גואנגג'ואו, סין | #1310-73-2 | ||
| מפעל ריאגנטים כימיים של חומצה אצטית גואנגג'ואו, סין | #64-19-7 | ||
| Na2< / sub>CO3< / sub> | Tianjin DaMao מפעל ריאגנטים כימיים, סין | # 497-19-8 | |
| מפעל ריאגנטים כימיים אתנול גואנגג'ואו, סין | # 64-17-5 | ||
| HNO< sub>3 | Guangzhou מפעל ריאגנטים כימיים, סין | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | סינופארם מגיב כימי בייג'ינג ושות', בע"מ, סין | #10102-17-7 | |
| Eriochrome שחור T(EBT) | טיאנג'ין DaMao מפעל ריאגנטים כימיים, סין | # 1787-61-7 | |
| מגש פלסטיק | שנחאי Yi Chen פלסטיק ושות', בע"מ, סין-TS-1 | ||
| שייקר | Qilinbeter JiangSu, סין-BenQ | ||
| M800 סורק | BenQ, סין-DYY-6C | ||
| ספק כוח | בייג'ינג Liuyi מפעל מכשירים, סין-גבוה | ||
| בכל מערכות ג'ל אנכיות, JY-SCZF | בייג'ינג Tunyi אלקטרופורזה ושות', בע"מ, סין | - |
מקורות
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
