איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

סיכום

פרוטוקול זה מספק סקירה של נוהלי בידוד של RNA עבור פרופיל transcriptomic של הצומת לימפה רקמות חיות גדולות, כולל צעדים זיהוי, כריתה של בלוטות הלימפה של חיות המשק וחיות, דגימה גישות כדי לספק עקביות על-פני מספר בעלי חיים, שיקולים בתוספת תוצאות נציג פוסט אוסף שימור ועיבוד לניתוח RNA.

תקציר

חיות גדולות (הן חיות המשק וחיות) לשמש חשוב מאגרים של גורמי מחלה נגיפית, לרבות Brucella, חיידקי סטרפטקוקוס בוביס Mycobacterium, סלמונלהו- e. coli, והם שימושיים ללימוד פתוגנזה ו/או התפשטות החיידק ב hosts טבעי. כאשר פונקציית מפתח של בלוטות הלימפה בתגובה החיסונית המארח, רקמות לימפה לשמש מקור פוטנציאלי של RNA עבור ניתוחים transcriptomic במורד הזרם, כדי להעריך את השינויים הטמפורלי של ביטוי גנים בתאים במהלך זיהום. מאמר זה מציג סקירה של התהליך של הצומת לימפה אוסף דגימה רקמה, RNA במורד הזרם עיבוד במשק, באמצעות בקר (פרות, המטופחות) כמודל, עם דוגמאות נוספות מסופקים של ביזון אמריקאי (ביזון ביזון ). הפרוטוקול כולל מידע אודות מיקום, זיהוי, הסרה של בלוטות הלימפה מאתרים מרכזיים מרובים בגוף. בנוסף, מתודולוגיה דגימה ביופסיה מוצג המאפשר עקביות הדיגום מעבר בעלי חיים מרובים. מספר שיקולים לשימור הדגימה הנזכרים, כולל הדור של RNA מתאים מתודולוגיות במורד הזרם כמו רצפי RNA ו- RT-PCR. בשל עיכובים ממושכים הטמונה גדולים בעלי חיים לעומת העכבר פעם קורס לימודי, מוצגים תוצאות נציג ביזון ורקמות הלימפה שור כדי לתאר את מהלך הזמן השפלה בסוג זה רקמות, בהקשר של סקירה של עבודה מתודולוגי קודמות ב- RNA השפלה ברקמות אחרות. בסך הכל, פרוטוקול זה יהיה מועיל שני חוקרים וטרינרי מתחיל transcriptome פרויקטים על דגימות בעלי חיים גדולים, פיצחו המעוניינים ללמוד טכניקות ויוו רקמות דגימה ועיבוד במבחנה .

מבוא

ניתוח ה-RNA-רצף של transcriptome של בלוטות הלימפה מספק את ההזדמנות כדי לאפיין את התגובה החיסונית של חיות למגוון של פתוגנים. אמנם יש כבר מנוצל מתודולוגיה זו בהרחבה בעכברים, ניתוח הרחבת לאחרונה לתוך יונקים גדולים^1,2. משק חי/גדולים בעלי חיים בלוטות הלימפה יכול לשמש כדי לאפיין תגובות המארח, זיהום, לא רק לשימוש שלהם חיסון או רגישות גנטית מחקרים, לצורך זיהוי מטרות עבור פיתוח התרופה, אלא גם דגם מערכות עבור מחקרים בבני אדם על מחלות שפוגעות. לדוגמה, במקרה של ברוצלוזיס (מחלה חיידקית שפוגעות כי ההשפעות חצי מיליון אנשים ברחבי העולם בכל שנה), למרות גדל באופן משמעותי בעלויות, לימודי כבשים או עיזים שהן יותר רלוונטיות הדבקת בני אדם, החיסון האנושית פיתוח מודלים חיות מעבדה. העכבר זיהום מודלים מסכם את הדברים הזיהום מערכת reticuloendothelial אבל לא את הסימנים הקליניים האופייניים³_.

בניסויים בבעלי חיים גדולים לעומת מעבדה מחקרים שנעשו בבעלי חיים, התהליך של רקמות קציר בהכרח כרוך עיכוב ארוך יותר בין המתת החסד ואת האוסף רקמות, אשר מהווה אתגר פוטנציאל לשימור RNA באיכות גבוהה. RNA תקין חיוני לדור של נתונים transcriptomic רלוונטי מבחינה ביולוגית. הדור של RNA באיכות גבוהה של דגימות רקמה קריטי במיוחד ללימודי הפתוגן בעלי חיים גדולים מתבצע תוך מתקני כליאה. מחקרים כאלה הם מטבעם יותר קשה לבצע כפי שהם דורשים אישרה מתקנים, מאומנים כוח אדם אלא גם לשאת משמעותי בעלות הכספית, אשר, בהתאם לעבודה, יכול לנוע בין עשרות למאות אלפי דולרים. סוגי מחקרים אלה כרוכים גם שיתוף פעולה בין-תחומית והידע רב-תחומי להשלמת שלהם, הוספת את המורכבות שלהם. לכן, הדרכה, התפתחות, ואת הדבקות מערכת יעילה של המדגם אוסף שימור מספק יתרונות משמעותיים במחקרים מולקולריים במורד הזרם של רקמות של חיות נגועות.

האוסף של בלוטות הלימפה גדול מציג אתגרים נוספים עבור אוסף רקמה לעומת דגימה דומה מאתר בלוטות הלימפה. ההכנה הכריתה מדגם מחייבת הבנה בסיסית של האנטומיה של הצומת לימפה, לרבות המבנים הפנימיים הרלוונטיים. המבנה של הלימפה מורכבת של האוניות הלימפה מוקף הסינוסים מלא הלימפה. מבנים אלה מוקפים בתוך כמוסה קשה, סיביים. ⁴ lobule הלימפה "אנטומי פונקציונלי היחידה הבסיסית של הצומת לימפה", מורכב זקיקי, יחידת עמוק בקליפת המוח, ואת מיתרי מדולרי הסינוסים⁴ (איור 1 א'). B ו- T לימפוציטים הם ביתו זקיקי ויחידות עמוק בקליפת המוח, בהתאמה. מבנים אלה מספקים לפיגום תלת-ממד, להקל על האינטראקציה בין לימפוציטים וגם אנטיגן או אנטיגן הצגת תאים.

רווחתה, זקיקי ויחידות עמוק בקליפת המוח ניתן לזהות במשטח לחתוך כפי שהם מכילים meshwork רשתי צפופה מופיעים יותר הסינוסים, המורכב מעובדים meshwork רשתי עדין יותר ואשר נראה בהיר יותר כהה (איור 1B). לפי המוסכמות, פתולוגים להפנות האזורים של בלוטות הלימפה כמו קליפת שטחית (זקיקים), את paracortex (יחידות עמוק בקליפת המוח) לשד (מיתרי מדולרי, הסינוסים). בדיקה נכונה של כל שלושה אזורים שסברו הטובה ביותר תרגול בהנחיות שגרתית פתולוגיים הלימפה⁵. שימו לב כי יש וריאציה ניכר עקביות, גודל וצבע של בלוטות הלימפה, אפילו בתוך חיים בודד. כמו בעלי חיים גיל, בלוטות הלימפה שלהם נוטים להקטין את גודל להיות מוצק יותר מאלה של חיים צעירים, בדרך כלל עקב גידול רקמות החיבור שלהם וירידה רגיל הלימפה מבנה^6,7.

איור 1. אנטומיה של הצומת לימפה. (א) תמונה קריקטורה זו מראה את האנטומיה של הצומת לימפה, המתארים מבנים מרכזיים. (B) תמונה זו עדיין מציגה לימפה שור חותכים חתך הרוחב. המבנים/השכבות הרלוונטיות הגלויים לעין מודגשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בהתאם השאלה ניסיוני, הלימפה שונים יהיה עניין עבור איסוף וניתוח. בלוטות הלימפה ההיקפית הם אלה נמצא עמוק בתוך הרקמה התת עורית. הבקר, בלוטות הלימפה היקפי או שטחי משמש לעתים קרובות באימון קליניים וניסויים לכלול הפרוטיד, submandibular, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural), שטחי במפשעה (supramammary אצל נקבות, האשכים אצל זכרים) ( איור 2). טבלה 1, מאפייני מפתח בלוטות הלימפה שטחית, כמתואר ב- במערכת ' בקר '⁸, מתוארים. להלן, כמה תוכניות אוסף הצומת לימפה פוטנציאל למחלות זיהומיות חיידקים של הבקר מוצגים כנקודת התחלה עבור החקירה.

Melitensis abortus/Brucella brucella: תקן necropsies עבור abortus דרב-נגוע בקר ו melitensis דרב-עזים נגוע במרכז הלאומי חיה המחלה לשחזר supramammary, prescapular, רקמות parotid בלוטת לימפה , הן של שיוף שהספירה חיידקי ועל ההכנה RNA פרופיל ביטוי מארח ה-RNA. Abortus דרב ניתן לשחזר באופן קבוע בכל אחד מאותם בלוטות הלימפה בקר נגוע השפעול⁹_. הנוכחות של חיידקים בכל אחד מסוגי הלימפה ניתן להבחין ב- melitensisבנגוע עזים עד לפחות תשעה חודשים לאחר הפגיעה באמצעות למתודולוגיות מבוססי ה-RNA ממחקרים שלנו (Boggiatto. et al., לא פורסם). סלמונלה sp.: prescapular, subiliac (prefemoral), ואת בלוטות לימפה mesenteric היו שימושיים במהלך יצירת פרופילים של פגרי הבקר סלמונלה השכיחות^10,11,12 , יהיה עניין פוטנציאלי ללימודי transcriptomic. E. coli O157:H7: בלוטות לימפה mesenteric (-המעי הדק האמצעית והמיקומים המעי הדק הדיסטלי) יכול להיות האתרים של שחזור של פה ושם של חיידקים עגלים הנגוע (אך לא נגוע הבקר מבוגרים)¹³. לפטוספירוזיס (Leptospira sp.): התמדה כרונית של החיידקים נצפתה בקשרי הלימפה ניקוז בלוטת חלב¹⁴. Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס : בבקר, החיידק כבר התאושש זיהום שלאחר ניסיוני של בלוטות הלימפה mediastinal, tracheobronchial של עגלים¹⁵. בנוסף, הצומת לימפה RNA יש כבר מנוצל כדי לבחון תגובות לארח בעלי חיים גדולים וירוסים, כגון וירוס חזירי תסמונת הרבייה, מערכת הנשימה². איור 2 מציג את המיקום של קבוצת משנה של אלה הלימפה העיקרי בגוף הבקר.

איור 2: קריקטורה המתארים במיקומים שנבחרו הלימפה בבית השחי הצומת פרות, המטופחות . בלוטות הלימפה ממוספרת הם מבואר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

נייר זה ווידאו משויך, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד של גדול הלימפה חיה ללימודים RNA, תוכנן להיות אינפורמטיבי עבור פיצחו המעורבים במחקרים transcriptomic של זיהומים בעלי חיים גדולים. ראשית, אנו מספקים סקירה של ההליך בידוד בלוטות הלימפה, באמצעות דגימת רקמות שור, ביזון כדוגמאות. מזווג עם ההדגמה, כפי שהוא מוצג בסרט, הוא זרימת עבודה עבור דגימה רקמה לשחזור לבידוד RNA. בשלב הבא, אנו מתארים שיקולים חשובים עיבוד של הצומת לימפה נגועות, עם דגש על בטיחות, עקביות ואיכות RNA.

הכנת RNA מתוך הרקמה עם ריאגנט isothiocyanate פנול acidified-guanidine מבוסס על השיטה המקורית של Chomczynski וסאקי^16,17, בטהרה על-מבוססות-סיליקה ספין עמודות רכוש סוכני chaotropic בהתבסס על העבודה המקורית של Vogelstein ו גילספי¹⁸. אנו בוחנים גם את הפוטנציאל ההתאוששות של RNA עבור transcriptomics מן הבקר הלימפה שנשמרו על-ידי שיטות אלטרנטיביות. לבסוף, אנו חוקרים את ההשפעה של המשתנה פעם על איכות ה-RNA ב necropsies בעלי חיים גדולים, כולל ניסוי נציג המתארים את ההשפעה של עלייה זמן בין המתת החסד הדגימה על הפרופיל RNA התאושש מן ביזון, . בלוטות לימפה שור מאמר זה יהיה מועיל לא רק פיצחו אלא גם ל וטרינרי חוקרים מתחיל transcriptomic מחקרים.

פרוטוקול

ההליכים necropsy בעלי חיים המתואר כאן מכוסים במסגרת הפרוטוקולים המאושרים IACUC במרכז הלאומי חיה המחלה, איימס, חקירות פנים כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות מאושרים עבור טיפול בבעלי חיים ורווחה.

1. קדם תכנון לפני Necropsy

1. לפני necropsy, להכין את החומרים הבאים עבור הובלה לסוויטה necropsy:
   1. 1.5 או 2 מ"ל microcentrifuge צינורות מלאים ~ 1.0 מ"ל של תמיסת השימור RNA, במיכל מתלה או תחבורה. הקפד לעקוב אחר הנחיות היצרן היחס בין הנפח של הפתרון שימור לנפח של הרקמה.
   2. ואזמלי מנתחים חד פעמיות ומלקחיים נקי, בלוק: ערכה אחת ניקוד על העור ועל מערכת שונה לאיסוף בלוטות הלימפה (אחד עבור כל הצומת לימפה, לכל בעלי חיים), ובכך למנוע את זיהום של העור פלורה סביבתי עם הצומת לימפה רקמות.
   3. 3 מ מ מבלטים ביופסיה, necropsy סכינים, מכולה שרפ עבור ואזמלי מנתחים בשימוש ואת כלי ביופסיה, קרשי חיתוך או בתבניות חד פעמיות לשימוש dissection הלימפה.
   4. השתמש ציוד מגן אישי, כולל עיקרון השוויון הפוליטי הדרוש לעבודה ברמה BSL המתאימה עבור המערכת.
   5. אוטוקלב לשימוש חוזר כלי מתכת, כולל המלקחיים, מחבתות מתכת לפני necropsy, באמצעות את הסחורה כלי/יבש הגדרת.

2. דגימה של בלוטות הלימפה בקר ו ביזון וזיהוי

איור 3 . בלוטות הלימפה של שור הראש והצוואר. (א) זו דמות מצויירת מראה שנבחר הלימפה של הראש והצוואר של פרות, המטופחות. (B) תמונה זו מציגה את הצומת לימפה parotid חתך רוחב (משמאל) לעומת parotid בלוטת הרוק חתך רוחב (מימין). שימו לב ההבדל בין רקמות שני סוגי טקסטורות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

1. בידוד של בלוטות הלימפה prescapular הבקר, ביזון
   1. להרדימו (בקר או ביזון בכל גיל, בהתאם לניסוי) בהתבסס על פרוטוקול IACUC מקומיים. לאשר את מותו על ידי בשיטות המתוארות במפורש בפרוטוקול IACUC המוסדי, לרבות העדר דופק, חוסר נשימה, העדר רפלקס המצמוץ. הזז את החיה על הרצפה necropsy.
      הערה: קיימות שיטות שונות של ההומני בשימוש בפועל מעבדה של בעלי חיים גדולים. אולם, עירוי לוריד של פתרון נתרן סודיום פנטוברביטל, פניטואין הוא הכי נפוץ מאושרים ולא מנוצל טופס. התייעץ עם המנחים AVMA על המתת החסד של בעלי חיים. ¹⁹
      התראה: פעל כל פרוטוקולי אבטחה הרלוונטיים necropsy במוסד המארח, כולל הנחיות לרשות בטוח שרפ מיכל ניקוב-הוכחה, וכן את הטיהור של סכינים מתכת לשימוש חוזר וחדים. פרוטוקול זה מייצר פסולת שרפ מן השימוש ואזמלי מנתחים חד פעמיות. ללבוש ציוד מגן אישי כפי שמכתיבה את ההנחיות המוסדי, כולל מגפיים, הסרבל, כפפות הגנה העין.
   2. לזהות 3 משתתפים לעבוד על רקמות חיות.
      הערה: כאן, בניתוח 1 להיות אחראי רחבת היקף חלוקתה של רקמות חיות הרצוי בניתוח 2 יהיה לשחזר את בלוטות הלימפה ממקטעים שונים בעלי חיים, בניתוח 3 יעבוד בטבלה נפרדת כדי לבודד חלקים מן כל הצומת לימפה, להעביר אותם צינורות עם פתרון משמר.
   3. להתחיל על ידי הצבת החיה recumbency לרוחב.
   4. להרחיב את הכתף על-ידי הזזת את האיבר קבלה בחזרה ברמה של הברך (עצמות שורש כף היד); תנועה זו להחזיר את הכתף ולאפשר מישוש קל של הצומת לימפה. מרגיש נוכחות של הצומת לימפה "גוש".
      הערה: במהלך המחלה תנאים, לימפדנופתיה עשוי להיות נוכח, אשר מקלה את הזיהוי של בלוטות הלימפה, אך תהליך זה יכול להשפיע גם על עקביות, קומפוזיציה ואדריכלות של הצומת לימפה.
   5. ברגע ממוקם עם הכתף עדיין מורחב, השתמש בסכין שהאזמל או necropsy לעשות חתך בעור לאורך קווי המתאר של הכתף.
      הערה: לא תגביל את הגודל של החתך, אפילו אם הצומת לימפה היה ממוקם באמצעות מישוש. חתך גדול יותר מספק גישה קלה יותר לרקמות העמוקות ומקל על הכריתה של הצומת לימפה עבור בניתוח.
   6. באמצעות זוג מלקחיים, תמשוך את העור וחושף את הנקודה של הכתף או צוואר מערכת השרירים.
      הערה: הצומת לימפה prescapular נמצא לעיתים קרובות השומן התת עורית, במיוחד אצל בעלי חיים overconditioned.
   7. שוב, ימשש את המיקום של הצומת לימפה (איור 3 א).
      הערה: בניגוד שומן תת עורית, הצומת לימפה תקיים את צורתו כאשר palpated. בנוסף, בלוטות הלימפה אינם רציפים עם כל הרקמה הסובבת, כפי שהם מוקפים על ידי קפסולה סיבית דק.
   8. לאחר איתור הצומת לימפה prescapular, בזהירות לנתח השומן התת עורית, באמצעות אזמל מלקחיים, ולבודד את הצומת לימפה.
      1. חפשו את הנוכחות של קפסולה סיבית דק, כפי שהיא מתוארת איור 1B, כדי להבדיל בין הצומת לימפה רקמת שומן; בלוטות הלימפה אינם רציפים עם כל הרקמה הסובבת.
   9. העברת הצומת לימפה השולחן לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת, באמצעות מגש פלסטיק לצורך העברת רקמות, עבור עוד יותר חלוקתה.
      הערה: המראה של אלה הלימפה ביזון דומה. וידאו הקשורים מתאר את המראה של הצומת לימפה prescapular כמו גזור מחוץ הכתף הימנית של ביזון אמריקאי.
2. בידוד parotid בלוטות הלימפה בקר ו ביזון
   1. להתחיל על ידי הצבת החיה recumbency לרוחב על הרצפה necropsy. אתר את מפרק לסתי-רקתי (TMJ).
      1. אם זה קשה מאוד לאתר, הלסת התחתונה לאט לאט, לקבוע את המיקום שבו הלסת התחתונה מייחסת הגולגולת; . זה למפרק לסתי-רקתי
   2. בזהירות באמצעות סכין שהאזמל או necropsy, לעשות חתך בעור. . תתחיל לחתוך הגבי המשותף ולהרחיב אותו ventrally/אנכית לאורך קו הלסת.
   3. לנתח את העור כדי לחשוף את הרקמה התת עורית. בלוטת הרוק parotid יהיה גלוי קודם, בשל גודל גדול שלה, מראה פני השטח lobulated, צבע אדום.
   4. באמצעות מלקחיים אזמל, להזיז את בלוטות parotid הצידה כדי למצוא את הצומת לימפה parotid יושב רק הגולגולת המדיאלי כדי בלוטת הרוק (איור 3 א). לבחון את רקמת הלימפה parotid ' מרקם ' לפני עיבוד נוסף.
      הערה: בלוטות הלימפה של הפנים (parotid, submandibular) קשורים עם בלוטות הרוק, אשר יכול לבלבל את הבידוד הצומת לימפה. בהשוואה הלימפה, בלוטות הרוק הן גדולות הרבה יותר, יש מראה פני השטח lobulated. יתר על כן, על השטח לחתוך, בלוטות הרוק הומוגנית בטבע, לא להפגין את קלאסי קורטיקליים ו מדולרי דפוס אדריכלי של בלוטות הלימפה (איור 3B).
   5. לסלק את בלוטת עם אזמל. להעביר את זה השולחן לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת, באמצעות מגש פלסטיק לצורך העברת רקמות, עבור עוד יותר חלוקתה.
3. בידוד של supramammary הלימפה נקבה ובקר ביזון
   1. מקם את החיה recumbency לרוחב.
   2. להגביה את הרגל האחוריות כדי לחשוף את האזור מפשעי ולאתר עטין.
      הערה: של חיים בריא, שאינו מיניק, מישוש הלימפה האלו לא ייתכן. חיים מניקות, אלה בלוטות הלימפה עשוי להיות מוחשי על הגבול סימטרית של הבסיס של עטין.
   3. באמצעות אזמל, לבצע חתך פשוט הגבי עטין, רץ לאורך הרגל העליונה, כדי לחשוף את בלוטות supramammary.
   4. לנתח את הרקמה התת עורית, למצוא את הצומת לימפה supramammary נעוץ שכבה דקה של השומן התת עורית. אם לא מבחינה ויזואלית ניתן להבחנה, ימשש את הרקמה החשוף לנוכחות של מבנה מוצק בתוך השומן התת עורית.
   5. באמצעות מלקחיים, אזמל, לנתח בזהירות את הצומת לימפה מן השומן. להעביר את זה השולחן לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת, באמצעות מגש פלסטיק לצורך העברת רקמות, עבור עוד יותר חלוקתה.

3. חלוקתה ואחסון של בלוטות הלימפה

1. עוברים את בלוטות הלימפה מבודד מן בניתוח 2 כדי 3 ליד שולחן חיתוך סמוך למרחב הראשי necropsy dissector. במקום כל הצומת לימפה על קטע טריים של קרש חיתוך. תווית מראש את לוחות חיתוך קטעים מאת הלימפה, כדי להקל על קבלת מספר בלוטות לימפה ברצף. לקבלת דוגמאות זיהומיות, להשתמש בתבניות חד פעמיות.
2. באמצעות מלקחיים וסכין חד פעמיות שהאזמל או necropsy, להסיר מקטע של הצומת לימפה. בעזרת סכין חדה, לבצע חתך הסאגיטלי לפתוח את הצומת לימפה.
3. לבחון את הפנים של הצומת לימפה, בפרט דגימות של חיות נגועות, מחפש א-סימטרי, נגעים, הבדלי צבע, וכו ' להקליט התצפיות.
4. (אפשרות 1) קטעי רקמה קטנה
   1. השתמש ואזמלי מנתחים חד פעמיות כדי לסלק חתיכות של כל הצומת לימפה, פחות מ 5 מ מ עובי, להעביר כל קטע צינור עם פתרון שימור RNA עם מלקחיים נקי.
5. (אפשרות 2) הצומת לימפה ביופסיה או חלוקתה מתודולוגיות
   הערה: ביופסיות או מתודולוגיות אופטים, כאשר חל מקטעים מקבילים הלימפה בבית השחי הצומת על פני צמתים שונים ובעלי חיים, לספק עקביות של רקמות שנדגמו ניתוח RNA בצובר.
   1. טריז חלוקתה שיטה
      1. לאחר בחינת המקטע הסאגיטלי ללכוד תאי מעבר לפרופיל של הצומת לימפה, בלו טריז בצורת עוגה מן הצומת לימפה, מהמרכז הקפסולה החיצוני. עבור צומת 2 ס מ רוחב (גודל סטנדרטי; ראה טבלה 1), חותכים טריז למרכז זה 4 מ מ אורך קשת החיצוני ויהיה 5 מ מ עובי משקל רטוב של ~ 100 מ ג.
      2. באמצעות את האזמל, לחתוך את התבנית לחתיכות קטנות, לא עבה מ 5 מ מ ו כ 50-100 מ"ג כל רקמות רטוב במשקל.
         הערה: עקביות, לעבד כל החלקים טריז מן לימפה בודד באצווה אחת או צינורות נפרדת ואחריו RNA באגירת לספק פרופיל RNA נציג מן הצומת לימפה עניין.
      3. מקם את חתיכות רקמה עם מלקחיים לתוך צינורות המכיל לפחות 10 כרכים של תמיסת השימור RNA, לעומת הנפח של הרקמה.
   2. שיטת ביופסיה אגרוף
      1. בחרו בכלי ביופסיה אגרוף אם המטרה היא לאסוף בחלקים מסוימים, כגון זקיקים ספציפי מהצומת. בחרו כלי תואם גודל המדגם הרצוי עבור אוסף. אגרוף ביופסיה כלים זמינים במגוון של גדלים, מ- 1 עד 8 מ מ קוטר.
      2. חזותית לאתר את האזורים להעסיק מדגם הצומת לימפה.
      3. השתמש בכלי ביופסיה אגרוף לסלק את המקטעים של עניין, לחיצה ארוכה על הפעלת הכלי לתוך הרקמה כדי ליצור את הליבה. העבר את פיסת רקמה עם מלקחיים שפופרת המכילה לפחות 10 כרכים של תמיסת השימור RNA. אם סמיך 5 מ מ, להשתמש מלקחיים, אזמל לחלק נוסף של הרקמה לחתיכות קטנות יותר.
6. ברגע הדגימות הועברו אל תמיסת השימור (למשל., RNALater), להעביר אותם חזרה למעבדה בטמפרטורת החדר.
7. אחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר חדירה לרקמות.
8. למחרת, יוצקים את הפתרון שימור עודף RNA ולאחסן את דגימות רקמה ב-80 מעלות צלזיוס. להסיר כמה שיותר חומר משמר ככל האפשר לפני הקפאת הדגימות. השתמש טיפ micropipette P1000 ו/או P200 להסרת משמרים פתרון יעיל RNA.
   התראה: למחוק את הפתרון שימור יצק בהתאם, בהתבסס על מאפייני המחלה מנוצל כמו גם הסכנות כימיים וסביבתיים של הפתרון שימור כפי שצוין בגיליון נתונים בטיחות זיהומיות.
   הערה: ההנחיות כאן הינם מסופקים עבור הפתרון שימור RNA המתוארות בטבלה של חומרים. התייעץ עם הנחיות היצרן, אם באמצעות פתרונות חלופיים שימור.

4. עיבוד RNA בלוטות הלימפה

התראה: ללבוש חלוק מעבדה, כפפות והגנה עיניים נאות עבור הצעדים עיבוד.

הערה: הכימית מבוסס-פנול המשמש כאן מתוארת בטבלה של חומרים (ו הפרוטוקול מבוסס על הנחיות היצרן)²⁰. השימוש של ריאגנטים מבוסס-פנול חלופי המחייב שינוי של ההליך, בהתבסס על ההמלצות של היצרן עבור המוצר הספציפי רכשה.

1. לפני שתיכנסו הדגימות, טרום aliquot הכימית מבוסס-פנול צוננת (4 ° C) כדי המגון צינורות (1.5 mL/צינור), באמצעות פיפטה.
   התראה: פנול הוא רעיל, מאכל, סיכון בריאותי. כלורופורם הוא רעיל, סיכון בריאותי. להשלים את שלבי עיבוד 4.1-4.9 בשכונה fume כימי, יש ללבוש כפפות כדי למנוע מגע עם הכימיקלים. בארצות הברית, כלורופורם הוא בזבוז מסוכנים; תשליך צינורות המכיל פסולת מסוכנת בהתאם להנחיות מקומיות ומוסדיים. תהליך דגימות רקמה של בעלי חיים נגועים עם פתוגנים תחת BSL המתאימים-2, BSL-3, או הנחיות BSL-4.
2. לאחר דגימה יכול ישמט מן הצינורות microcentrifuge עם מלקחיים נקי, מיד להעביר כ 50-100 מ"ג של הרקמה נשמר הצינור המגון המכיל הכימית מבוסס-פנול.
   1. להגביל את הפשרתו לפני התוספת הכימית מבוסס-פנול. השתמש אחסון על קרח יבש כאשר מספר דוגמאות יוסרו מן המקפיא לעיבוד.
3. בחוזקה קאפ הצינור, להניחה מהמגן, homogenize את הדגימה עם מהמגן רקמות הרוטור-בפיתולי גלגל מכון ב הכימית מבוסס-פנול. להשלים את העיבוד בטמפרטורת החדר. מתי להשלים, בדוק על עכירות להבטיח שהמדגם היה הומוגני בהצלחה; צריך להיות מפוזרים הרקמה להשעיה מעונן.
   הערה: הגדרה חילוץ 2 דקות RNA משמש (ההגדרה RNA_02_1 שנקבע מראש עבור מהמגן תיאר את הטבלה של חומרים; מיועד רקמות קפוא). הרוטור-בפיתולי גלגל מכון שצוין בפרוטוקול זה (ראה הטבלה של חומרים) הוא גדול הטרשית, מותאם המגון של מגוון סוגי רקמות, כולל חומר סיבי. ההגדרה RNA_02_01 תוכנן במיוחד עבור קפוא (בניגוד טריים) ברקמות. כמו בלוטות הלימפה יש רקמת חיבור סיבית רכיבים, מהמגן רוטור אופטימיזציה באופן דומה-בפיתולי גלגל מכון מומלץ להשיג של דיסוציאציה יעיל. ראה את נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה²¹ לקבלת מידע נוסף אודות המלצות המגון.
   1. אם נתחים גדולים של רקמות נשארים לאחר המגון, חזור על התהליך המגון. כדי לשחזר בצורה יעילה את הרנ א, הרקמה חייב להיות טוב חלופה מועדפת.
   2. עבור סיבי יותר הלימפה חתיכות, להשתמש מלקחיים ומספריים מראש לקצוץ את החתיכה הצומת לימפה לחתיכות קטנות יותר מספר לפני העברת הצינור המגון. כפי שתואר במבוא, רקמות לימפה מחיות ישנים יותר עשויים להיות סיבי יותר.
      הערה: אם ניתוח כפול של המארח, פתוגן RNA היא הרצויה, ייתכן טיפול נוספים (כגון חרוז המגון) יהיה צורך עבור ההתאוששות של RNA חיידקי, במיוחד אם גראם חיוביים פתוגנים נוכחים ברקמות.
4. מיד להסיר את הדגימה homogenized של הצינורות, להעביר אותו ללא RNase microcentrifuge צינורות (2.0 mL בגודל) עם micropipette P1000.
5. Centrifuge לדוגמה עבור 5 דקות ב g x 12,000 ב 4 ° C כדי להסיר את כל פסולת מדגם. באמצעות טיפ micropipette P1000, להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge טריים, כשמאחוריו בגדר.
6. דגירה של תגובת שיקוע למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. פיצול כל מדגם בין microcentrifuge 1.5 שני צינורות.
7. הוספת 0.2 מ של כלורופורם לכל 1 מ"ל מהתרכובת מבוסס-פנול (קרי, mL 0.3 עבור מדגם 1.5 mL); היפוך זה ביד למשך 1-2 דקות לערבב את השלבים, אבל לא מערבולת המדגם. דגירה זה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
8. Centrifuge זה למשך 15 דקות ב g x 12,000-4 מעלות צלזיוס.
9. הסר בזהירות את השלב העליון, ברור מימית עם micropipette טיפ (P1000 או P200) שיהוו השכבה העליונה, מבלי להפריע את לאטמוספרה או השכבה פנול אדום-כלורופורם. להעביר אותו צינור microcentrifuge.
10. ערבב את זה עם אמצעי אחסון שווה של אתנול 100%; לערבב את זה באופן יסודי על-ידי היפוך הצינור 4 - 5 פעמים. הצינור יופיעו לעיתים קרובות מעונן.
11. עם טיפ micropipette, להעביר את הנוזל לעמודה מבוסס-סיליקה ספין המסחרי, כדי לטהר עוד יותר, elute את הרנ א, בעקבות ההוראות של היצרן²². Elute את ה-RNA שנוצר מתוך ~ 50 מ"ג של רקמה לתוך µl 50-100 RNase ללא מים.
    הערה: בזמן החילוץ ריאגנט מבוסס-פנול מסיר DNA בשלב אורגני, עבור השימוש במורד הזרם של RNA לרביעיית-PCR ו/או יישומים רצפי RNA, טיפול נוספים של RNA דגימות עם DNase מומלץ.
12. Aliquot הרנ א eluted כדי להפריד בין צינורות לשימוש הערכה כימות ואיכות, כדי להפחית כל ההקפאה-הפשרתו של המדגם RNA הראשי. העברת הצינורות-80 ° C עבור אחסון.
13. במקרה של הצומת לימפה דגימות נגזר בעלי חיים נגועים עם גורמי מחלה נגיפית, במיוחד באותה רמת הבלימה BSL-3, לאמת את הדגימה RNA שנוצר על ההיעדרות של פתוגנים אם המדגם תועבר אל איזור לבלימה רמת אבטחה נמוכה יותר ניתוח איכות, RT-PCR, ו/או RNA-רצף ספריית הכנה.
    הערה: זה קריטי לשקול תקנות מקומיות, במקרה של ה-CDC (המרכז לבקרת מחלות ומניעתן) איון הנחיות לעבודה עם סוכנים בחר, זה הכרחי לאמת את כל ההליכים איון באתר המקומי של החוקר.
    1. הסר 1/10^בתאנון נפח של כל מדגם ה-RNA eluted מהשלב 4.12 (קרי, µl 5 מ- µl 50 של RNA הכולל). באמצעות טכניקה סטרילי, מערבבים את הדגימה עם 100 µl התפתחות חיידקים מרק צינור microcentrifuge mL 1.5 סטרילי. שימוש של מפזר פלסטיק סטרילית, ומשטחים את התערובת RNA-מרק על פני צלחת אגר.
       הערה: בחר ציר אגר וסוג צלחת עקבית עם הצמיחה של המחלה שבה לערער את החיות.
    2. דגירה של צלחת אגר בתנאים מסוימים לצמיחה של המחלה שבה לערער את החיות. בדוק היעדר חיידקים התאושש לפני הסרת הדגימות הכלילה BSL-3.
       הערה: RNA eluted, וכתוצאה מכך כימות, בדיקות של תקינות, מתאים ליישומים במורד הזרם, הכוללים רצפי RNA, ניתוח ה-RT-PCR.
14. להעריך את ה-RNA שחזור ואת טוהר באמצעות ספקטרופוטומטרים. כדי להעריך את איכות ה-RNA, עומס 1-2 µl לדוגמה RNA eluted ספקטרופוטומטרים עבור ניתוח. שיא קשת של המדגם בטווח אולטרה סגול (UV).
    1. מ קשת UV, להקליט את היחס₂₈₀ A /A₂₆₀היחס₂₃₀ א /A₂₆₀, הערך₂₆₀ A עבור המדגם (A = ספיגת).
    2. כמו ה-RNA חד-גדילי-ריכוז של 40 µg/mL יש של ספיגת של 1.0 ב-260 nm, לחשב את ריכוז ה-RNA (µg/mL) על-ידי הכפלת את A₂₆₀ x 40 על הדגימות מטוהרים.
15. כשיטה מהירה של הערכת תקינות RNA, כדי לא לכלול דוגמיות מפורק ניתוח נוסף, מערבבים 2 µl של כל מדגם ה-RNA עם 4 µl של 1.5 x formamide טעינה צבע [95% יונים formamide, 0.025% (w/v) bromophenol כחול, 0.025% (w/v) קסילן cyanol, 5 מ מ EDTA (pH 8.0), 0.025% (w/v) מרחביות] ב- 1.5 mL microcentrifuge צינורות^23,24.
16. חום הצינורות ב 70 ° C עבור 1 דקות, ולאחר מכן להעביר הצינורות לקרח במשך 1 דקה.
17. לטעון את הדוגמאות כדי 1% agarose ג'ל המבושלות 1 x TBE (לקבלת תיאור מלא של בג'ל מקורי agarose עבור ה-RNA, ראה ריו, ארס ג'וניור, האנון ו נילסן –)²⁴. להפריד את הדוגמאות על ידי תקן ג'ל אלקטרופורזה שיטות ואשר נוכחותם של להקות ribosomal RNA 28S ו- 18S.
18. מעקב על אלקטרופורזה בג'ל עם שיטות ניתוח כמותי לקביעת תקינות RNA [למשל, ניתוח (RNA תקינות מספר) Bioanalyzer ורין] כמתואר נציג תוצאות וב -מילר, O. et al. ²⁵ ושרדר, א. et al. ²⁶.

5. שיטת החילוץ חלופית של פורמלין-קבוע, רקמות-מוטבע פרפין (FFPE)

הערה: למרות שימור רקמות FFPE אינו מייצג את השיטה החזקה ביותר של חומצת גרעין השימור, פרוטוקול שיובאו להלן ניתן דרך ללמוד כמה שינויים תעתיק. כאשר רקמות שהשתמרו אחרות אינן זמינות.

1. הכן פורמלין ריאגנטים למען שימור הרקמה על ידי dispensing פורמלין לתוך מיכלי פלסטיק. רקמות צריך להישמר בפורמלין עם יחס של 20:1 פורמלין: רקמת נפח ומשקל, בהתאמה.
   התראה: פורמלין הוא חומר מסרטן ידוע אנושי, אמנם לא רעיל בחריפות, חשיפה כרונית (בדרך כלל באמצעות אדים נשאפים) יכול לייצג סיכון בריאותי משמעותי. אוורור נאות, עיקרון השוויון הפוליטי (כלומר, השימוש nitrile כפפות, להיות שונה בתוך 15 דקות לאחר החשיפה הראשונית) נדרשים כדי למזער את הסיכונים הבריאותיים. לעיין בתקן פורמלדהיד OSHA (29 CFR 1910.1048) לקבלת מידע נוסף על הערכת סיכונים ובקרה חשיפה.
   הערה: באמצעות פורמלין מעט מדי יכול להשפיע את היכולת של רקמת להיות נשמר באופן מלא בעת שקוע בתוך חומר משמר.
2. לאחר הבידוד של הרקמה עניין, גזור בקפידה רקמות פחות מ 5 מ מ עובי.
   1. בזהירות באמצעות מלקחיים, להטביע את הרקמה החתוך לתוך פורמלין למזער כל מתיז.
      הערה: הרקמות צריך לגמרי מתחת לפני המים בפורמלין כדי לאפשר אובססיה מוחלטת. . זה קריטי כי כל המשטחים של הרקמה יהיו מכוסים לגמרי פורמלין
3. ברגע הרקמות יש שהושרתה בפורמלין, מאפשרים הקיבעון רקמות להתרחש לפחות 24 שעות בטמפרטורת החדר.
   הערה: פורמלין חודר לרקמות לאט לאט, בקצב של 1 מ מ לשעה של משטחים כל^27,28. לכן, שמירה על העובי של הסעיפים רקמות עד פחות מ 5 מ מ תוצאות אובססיה מהירה של הרקמה כולה.
4. לאחר הקיבעון, העברת הרקמות ריאגנט המתאים להטבעת פרפין.
   הערה: לדוגמה, הרקמות שנבדקו כתב יד זה הועברו אתנול 70% לפני ההטמעה.
5. להטביע את הרקמות לתוך פרפין. ²⁹
6. אזור הרקמה 10-80 מיקרומטר עובי (שימוש 10-20 מיקרומטר אם miRNA רצוי לחלץ)²⁹.
7. באמצעות אזמל ומלקחיים, הסר פיסת רקמה 40 מ ג כל מדגם יעובדו ולמקם אותו לתוך צינור סטרילי, נטולת נוקלאז microfuge.
8. לנצל את ערכת מסחרי המיועד deparaffinization והשחזור חומצת גרעין של דגימות רקמה FFPE לחלץ הדוגמאות שהשתמרו RNA.
   הערה: הערכה שאוזכרו טבלה של חומרים מנצל קסילן, אתנול שוטף כדי להסיר פרפין, צעד טיפול פרוטאז ומסנן סיבי זכוכית לטהר את ה-RNA.

תוצאות

השימוש של השיקולים שהוצגו במאמר זה (שלבים 1-4 לפרוטוקול) יסייעו בשחזור של RNA מדגימות חיות גדולות מתאים ניתוח במורד הזרם במחקרים ביטוי גנים המארח. איכות ה-RNA ליישומים במורד הזרם מוערך על ידי אמצעים סטנדרטיים מרובים. עבור ספקטרופוטומטר, היחס₂₈₀ A /A₂₆₀מספק מדד לזיהום חלבון, היחס₂₃₀ א /A₂₆₀מספק אמצעי נוסף של טוהר, להערכת יזהה מזהמים כימיים כגון פנול. בכל מקרה, יחסי של ~ 2.0 הן ראיות של RNA באיכות גבוהה, ירד יחס הם עדות לזיהום. חשוב, יחסי אלה אינם מספקים מידע כלשהו על השפלה RNA, ...

דיון

הרוב המכריע של מחקרים transcriptomic והפרוטוקולים המשויכים מתמקדים עכבר, חולדה או פוסט-מורטם דגימות אנושי. עם זאת, חקירות חיות המשק וחיות מספקים מגוון רחב של הזדמנויות עבור האפיון של התגובה החיסונית מחלה, הן לפי הצורך רפואה וטרינרית ו, לגבי מחלות שפוגעות, לבריאות הציבור האדם. פרוטוקול זה סיפק מיתאר של שיקולים מרכזיים לחילוץ RNA גבוהה-שלמות רקמות של חיות גדולות, כגון בקר, ביזון, עזים, כבשים. הגודל של בעלי החיים, כמו גם התנאים של אוסף דגימה, להפוך ההתאוששות תהליך מקיף יותר, עם זמן פוסט-מורטם עיבוד ארוך יותר מאשר להתאוששות ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פתרון שימור RNA (השתמשנו ב-RNALater לכל הניסויים)	ThermoFisher	AM7020
1.5 מ"ל או 2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה מפוליפרופילן	פישר סיינטיפיק	05-408-129
אזמל חד פעמי	Daigger Scientific	EF7281
מלקחיים לרקמות, שן עכברוש	פישר סיינטיפיק	12-460-117	מלקחיים אחרים לרקמות זמינים כולל קצה מעוקל, קצה מחודד וכו', תלוי בהעדפת המשתמש
מ"מ מחטי ביופסיה אגרוף	פישר סיינטיפיק	NC9949469
מיכל חד (קטן וניתן להובלה לנקרופסיה)	Stericycle	8900SA	1 qt. גודל מוצג כאן
קרשי חיתוך או מגשים חד פעמיים	פישר סיינטיפיק	09-002-24A	זמין במגוון גדלים, תלוי בהעדפת המשתמש
ציוד			משתנה עם פתוגן (כפפות, מסכות הנשמה, משקפי מגן וכו')
מגיב מיצוי RNA מבוסס פנול (השתמשנו במגיב TRIzol לכל הניסויים)		עמודות ThermoFisher
סיליקה (השתמשנו בערכת PureLink RNA Mini לכל הניסויים)	ThermoFisher	12183018A	מיועד לעד 100 מ"ג רקמה
100% אתנול (200 הוכחה לביולוגיה מולקולרית)	סיגמא-אולדריץ'	E7023
הומוגנייזר רקמות עם צינורות הומוגניזציה סגורים (השתמשנו בדיסוציאטור gentleMACS לכל הניסויים)	Miltenyi Biotec	130-093-235
Agarose (כללי, לאלקטרופורזה של ג'ל)	Sigma-Aldrich	A9539
1X TBE	Fisher Scientific	BP24301	יכול גם להכין מאפס במעבדה
פורממיד דה-יונים	EMD Millipore	S4117
נתרן דודציל סולפט	סיגמא-אולדריץ'	L3771
ברומופנול כחול	סיגמא-אולדריץ'	114391
קסילן ציאנול	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)	Sigma-Aldrich	EDS
UV-Vis (השתמשנו בספקטרופוטומטר NanoDrop)	ThermoFisher	ND-2000
להערכת RNA כמותית (השתמשנו בביואנלייזר, עם רכיבים ופרוטוקולים נלווים)	Agilent	G2939BA
ערכת מיצוי RNA FFPE (השתמשנו בערכת בידוד חומצות הגרעין הכוללת של RecoverAll עבור רקמה משובצת פרפין קבועה פורמלין)	ThermoFisher	AM1975
מפזר פלסטיק (מפזר בצורת L)	Fisher Scientific	14-665-231	נחוץ רק לבדיקת סטריליות לדגימות מבעלי חיים נגועים
סכיני נקרופסי	מושגי בעלי חיים	WI-0009209