הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דור של פולי שבשליטת גודל (אתילן גליקול) Diacrylate טיפות דרך דו-תלת-ממדי לזרום התמקדות Microfluidic מכשירים

7.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57198

⸱

3 ביולי 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, 2The State Key Laboratory of Precision Measurement Technology and Instruments, Tsinghua University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להמחיש את תהליכי ייצור וניסויים אימות של semi-three-dimensional (למחצה 3D) מיקוד זרימת microfluidic שבב על היווצרות droplet.

תקציר

פוליפוני אחיד ואת גודל-לשליטה (אתילן גליקול) diacrylate (PEGDA) טיפות ניתן לייצרו באמצעות הזרם התמקדות בתהליך במכשיר microfluidic. הנייר הזה מציעה semi-three-dimensional (למחצה 3D) מיקוד זרימת microfluidic שבב על היווצרות droplet. השבב polydimethylsiloxane (PDMS) היה מפוברק בשיטת הדפס אבן רכה רב-שכבתית. Hexadecane המכיל חומרים פעילי שטח שימש שלב רציף, PEGDA עם אולטרה סגול (UV) צילום-היוזם היה השלב התפזרו. פיתחה אפשרה את מתח הפנים המקומי להטיל ויצרו טיפ יותר cusped אשר קידם פורצים מיקרו-טיפות קטנות. כמו הלחץ של שלב התפזרו היה קבוע, בגודל של טיפות נהיה קטן יותר עם הגדלת לחץ מתמשך שלב לפני שלב התפזרו זרימה היה נשבר. כתוצאה מכך, טיפות עם וריאציה גודל מ מיקרומטר 1 מיקרומטר 80 קוטר ניתן להשיג באופן סלקטיבי על-ידי שינוי היחס לחץ בשני ערוצים כניסת, המקדם הממוצע של וריאציה נאמדת מתחת ל 7%. יתר על כן, טיפות יכול להפוך מיקרו-חרוזים על-ידי חשיפה UV עבור צילום-הפילמור. Conjugating מולקולות על פני מיקרו-חרוזים כאלה יש הרבה שימושים פוטנציאליים בתחומי ביולוגיה וכימיה.

מבוא

מערכות מבוססות-droplet microfluidic יש את היכולת לייצר מאוד monodisperse טיפות של ננומטר מיקרומטר קוטר טווח1 והחזק פוטנציאל גדול תפוקה גבוהה סמים גילוי2, סינתזה של מולקולות3 ,4ו-5בדיקות האבחון. בשל היתרונות הייחודיים של טיפות קטנות יותר, כגון פני השטח גדול יותר יחס נפח ויישומים בקנה מידה גדול עם צריכת microliters כמה מדגם, הטכנולוגיה משכה עניין נרחב במגוון רחב של תחומים. תחליב של שני נוזלים immiscible היא אחת השיטות האופייניות ביותר ליצירת droplet. בדוחות קודמים בתחום, חוקרים פיתחו מגוון רחב של גיאומטריות היווצרות droplet שונים, לרבות צומת t, מיקוד זרימה וזורמת משותפת גיאומטריות. ב גאומטריה צומת t, השלב התפזרו מועבר דרך ערוץ בניצב לתוך הערוץ הראשי, שבו זורם השלב רציף6,7. בגיאומטריה טיפוסי דו-ממדית (2D) מיקוד זרימה8,9 , הזרם מפוזר שלב זה לכסנתם מן הכביש הצדדי; והניח שיתוף זורם הגיאומטריה10,11, מצד שני, נים היכרות עם הזרם מפוזר שלב הוא co-axially בפנים נימי גדול עבור שותף זורם גאומטריה, כך הזרם מפוזר שלב זה לכסנתם מן לכל הכיוונים.

גודל droplet נקבע על-ידי התאמת יחס גודל ערוץ קצב זרימה, הגודל המינימלי המיוצר על ידי שותף זורם או צומת t הוא מוגבל לעשרות מיקרומטר. התמקדות-זרימה droplet היווצרות מערכת, שלושה מצבים של הפרידה droplet טופס על-ידי התאמת היחס הלחץ של שני שלבים ריכוז חומרים פעילי שטח, כולל טפטוף המשטר, המשטר לטוס ו זרימה-טיפ15. עצה-הזרמת מצב זה נקרא גם היווצרות פתיל, ואת המראה של דקה החוט ב"משיכת מהקצה של שלב התפזרו זרימה חרוט יתקיימו. מחקרים קודמים הדגימו טיפות פחות מ מיקרומטר כמה יכולים להיווצר על פי עצה-הזרמת תהליך ב- 2D או למחצה 3D מיקוד זרימה התקן8,12. עם זאת, כמו פתרון מימית המכילה ריכוז נמוך מאוד של PEGDA שימש את שלב התפזרו, היחס הצטמקות של חלקיקים PEGDA היה כ- 60% טיפות המקורי בקוטר לאחר צילום-פלמור, בעוד PEGDA ללא דילול כמו שלב התפזרו הובילו לא יציב הזרמת מידע מצב12. מתח פנים הוא פרמטר חשוב מתהליך אמולסיה, זה יקטן בשל התוספת של חומרים פעילי שטח לתוך הנוזל שלב רציפה, המוביל לירידה בגודל אגל, תדירות גבוהה יותר הדור13, עצה מאוד מעוקל, ו מניעת חוסר יציבות14. יתר על כן, כאשר ריכוז חומרים פעילי שטח בכמות גדולה הרבה יותר ריכוז קריטי מיצלה גבוה, מתח פנים כ מחזוריים במצב רוויה13 , מצב הזרמת עצה יכול להתרחש15.

מבוסס על תצפיות לעיל, בנייר זה, פיתחנו בגישה נתיישב לדור טיפות PEGDA באמצעות למחצה 3D מיקוד זרימה microfluidic, מכשיר מפוברק על ידי שיטת הדפס אבן רכה רב-שכבתית. שונה מהתקן טיפוסי 2D מיקוד זרימה, המכשיר תוך התמקדות זרימה למחצה 3D יש ערוץ רדוד שלב התפזרו ערוץ עמוק מתמשך שלב, כך השלב מפוזר יכול הטייה למעלה ולמטה לצד לרוחב. זה מספק מגוון גדול יותר התאמת מצב זרימה-התמקדות על-ידי הפחתת האנרגיה ואת הלחץ הדרוש פרידה droplet. שונה מן הדוח הקודם12, השלב התפזרו הוא מוודא כי היחס הצטמקות של חלקיקים PEGDA הוא נמוך מ 10%16; צילום PEGDAcontaining טהור-יוזם, השלב הרציף הוא התערובת של hexadecane המסת עם ריכוז גבוהות בתפזורת בסיס סיליקון nonionic חומרים פעילי שטח. גודל-לשליטה ואחידה טיפות יוצרו על-ידי התאמת היחס הלחץ של שני שלבים. הקוטר של טיפות משתנה מיקרומטר 80 1 מיקרומטר כמו הפרידה droplet תהליכי שינויים ממצב jetting למצב הזרמת עצה. בנוסף, החלקיק PEGDA סונתז בתהליך הפילמור צילום תחת חשיפה UV. מערכת microfluidic הדור droplet בקלות של ייצור תספק יותר אפשרויות עבור יישומים ביולוגיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. עובש ייצור

  1. עיצוב photomasks שני באמצעות תוכנת הציור. לתאר את קווי המתאר של המבנה microchannel להשתמש בשתי שכבות נפרדות עבור מסכת 1 ו- 2 באותו קובץ הציור, אז להבטיח כל החיבורים בין ערוצים שונים. הדפס שכבות שונות באופן עצמאי כדי כרום צלחת על הזכוכית על ידי ספק עם רזולוציה 1 מיקרומטר. ודא photomasks כהה עם מבנים מעוצב שקוף, כמו קוטביות שלילית.
    הערה: המסכה 1 מכיל את הערוץ כניסת מפוזר שלב דרך פתח בגוף. המסכה 2 כוללת את הערוץ כניסת פאזה רציפה, המסנן לשקע.
  2. במעבדה פוטוליתוגרפיה המיועד, לנקות רקיק סיליקון בקוטר 3 אינץ. למקם את לחם הקודש על coater ספין, את הריב להצמיד כשהפחד לצ'אק הספין. ספין-קואט 2-3 מ של סו-8 2025 photoresist שלילי על גבי כשהפחד 10 s ב 1,000 סל ד, אז 30 s ב-3000 סל ד, המספקת את עובי השכבה הראשונה של 20 מיקרומטר.
  3. אופים רך על פלטה 95 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. לאחר וופל מצופה מתקרר לטמפרטורת החדר (RT), לחשוף אותם דרך המסכה 1 תחת מקבילות 15 mW/cm2, 365 nm של UV על ס' 18 לאחר חשיפה, לאפות על גזייה 95 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות, ולאחר מכן לאפשר כשהפחד להצטנן עד RT.
  4. חזור על תהליך ציפוי ספין. החל מ ל 2-3 של 2100 SU-8 photoresist שלילי על גבי כשהפחד 10 s ב 1,000 סל ד, אז 30 s ב 2000 סל ד, המספקת את עובי השכבה השנייה של מיקרומטר 130. לאחר האפייה רך על גזייה 95 מעלות צלזיוס במשך 35 דקות, מניחים את המסכה 2 photoresist השכבה השנייה לחשוף ב-30 s, אשר היה מיושר עם השכבה ערוץ שלב התפזרו על ידי aligner UV. לאחר חשיפה, אופים על פלטה 95 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות.
  5. לפתח את לחם הקודש על ידי הטבעית בתוך אמבט מנוער של 50 מ של פרופילן גליקול מתיל אתר אצטט עד תכונות ברור על כשהפחד ולאחר מכן לשטוף אותו עם אתיל אלכוהול. לבסוף, במקום את לחם הקודש על פלטפורמת תרמוסטטי לאפיית קשה כבר שעתיים.

2. למחצה 3D מיקוד זרימת Microfluidic שבב פבריקציה נוספת

  1. PDMS מיקס מונומר והסוכן ריפוי שלה על יחס משקל שונה במקצת העליון ואת הרבדים התחתון, בדרך כלל 10:1 על השכבה העליונה, ו- 8:1 השכבה התחתונה, באמצעות משחה אוטומטי מסית במשך 4 דקות.
    הערה: הלוחות PDMS העליון והתחתון מוכנים על יחס שונה במקצת (10:1 ל- 8:1 בהתאמה) של בסיס PDMS לסוכן ריפוי, שיפור החוזק מליטה. כאשר 5:1 יחס נבחר לשכבה התחתונה, המתים במצב של PDMS התחתון מקשה יישור והקטנת מליטה כוח בשל חוסר גמישות. בנוסף, העובי של לוח PDMS התחתון הוא בערך 1 מ בהתאמת המרחק עבודה של מיקרוסקופ. השבב מתעוות בקלות תחת לחץ גבוה כאשר 15:1 יחס נבחר.
  2. שופכים את התערובת לתבנית סיליקון שהושלמו בצלוחית 90-מ מ ולספק עובי של 2 ~ 3 מ"מ. למקם אותו בתוך תא ואקום, דגה עד נעלמים כל בועות האוויר. לרפא ב 80 ° C לשעה בתנור.
  3. אפשר את PDMS להתקרר לשימוש RT. אזמל כדי לחתוך את המכשיר לפחות 3 מ מ מן התכונות, לאט קילוף השכבה PDMS מ כשהפחד סיליקון. פונץ ' לים מפוזר שלב, את כניסת פאזה רציפה ולשקע בשכבה העליונה PDMS באמצעות אגרוף 0.75 מ מ קוטר.
  4. לנקות את PDMS עם דבק כדי להסיר חלקיקי אבק. פלזמה להתייחס שכבות PDMS החלק העליון והחלק התחתון בו זמנית למשך 2 דקות בפלזמה W 300 מנקה. מניחים את השכבה העליונה על פני השכבה התחתונה והחלק את המשטחים יחסית עד תכונות מיושרים במלונות דרך מיקרוסקופ סטריאו.
  5. לרפא את המכשיר בתוך תנור ב 120 מעלות צלזיוס למשך יום אחד לשפר את הכוח להשלים מליטה.

3. ריאגנטים הכנה

  1. להכין את הפתרון של שלב רציף: Hexadecane על ידי המסת 18 vol % מבוססי סיליקון nonionic חומרים פעילי שטח.
  2. להכין את הפתרון של שלב מפוזרת: פוליפוני הידרופיליות (אתילן גליקול) diacrylate (PEGDA, MW 255,) המכילים 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (98%, MW 224)-ריכוז של 5 מ"ג/מ"ל צילום-יוזם, ו- rhodamine B ( 95%, MW 479.01)-ריכוז של 1 mmol/L כמו צבעי פלורסנט.
  3. למלא את המאגרים 1 מ"ל של בקר לחץ פנאומטי עם השלב רציפה. למלא את הטיפ 200 µL ג'ל טעינה עם השלב התפזרו.

4. הכנת המערכת

  1. מניחים את המכשיר microfluidic למחצה 3D על השלב של מיקרוסקופ אופטי הפוכה, במלונות עם מצלמה במהירות גבוהה.
  2. להתחבר fluorinated אתילן פרופילן (FEP) הצינור חורים מנוקבים של שלב רציף על-ידי הצמדת שפופרת מפלדת קצר, ולאחר מכן הכנס סוף טיפ הטעינה ג'ל לתוך החור מנוקב של שלב התפזרו. הכנס באורך 20 ס מ של שפופרת FEP לשקע את ההתקן ולמקם את הקצה שפופרת צנטרפוגה 15-mL.
    הערה: התצורה של המערכת מודגם באיור1.

5. טיפות היווצרות

  1. להניח את המכשיר על עבודה, שעליו מונחים של מיקרוסקופ הפוכה ולהבטיח כי הצומת בין ערוצים שונים ממוקם בערך במצב של מקור האור של המיקרוסקופ. פוקוס המיקרוסקופ הפוכה על אזור הכולל שני-שלבים לצומת, האזור דיזה במורד הערוץ.
  2. הגדר לחצים לשני שלבים באמצעות לחץ פנאומטי בקר לספק נוזלים באיטיות לאזור מצטלבים, עם 15 mbar לשלב התפזרו, mbar 30 בשלב רציף. המתן 3 דקות מייצב, equilibration עד זרימה יציבה נושאת אין בועות ושיירי PDMS.
  3. קלט את הפרמטרים על ממשק המשתמש של התוכנה שליטה. להגדיר את הלחץ של שלב התפזרו ככל שהלחץ ברמת הבסיס של המערכת כדי קבוע, לדוגמה, לשמור עליו-45 mbar. להגביר את הלחץ של פאזה רציפה עד מצב הפרידה אמולסיה השתנה מ לטוס למצב הזרמת עצה ולאחר מכן המתן 5 דקות לייצוב.
  4. מניחים בקצה צינור FEP החור עודפים מתחבר צינור צנטריפוגה כדי לאסוף את טיפות.

6. PEGDA חלקיקים אוסף ואפיון

  1. לתקן את הצינור צנטריפוגה aslant הנורה. להשיג את החלקיקים PEGDA דרך התמצקות מהירה על ידי חשיפה UV כאשר שלב נוזלי זורמים אל הצינור.
  2. לאחר סיום תהליך איסוף, לטעום ולבחון את החלקיקים PEGDA מבעד למיקרוסקופ פלורסנט עם 20 X או אובייקטים X 60 בהתאמה.
    הערה. שהתמונות הדיגיטליות פלורסנט שנתפסו על ידי המצלמה מנותחים על-ידי שיגרה תוכנות מחשב. התמונה היא deconvolution הראשון מבוסס על אלגוריתם R-L17 לחסל את השפעת blurring החוצה-של-התמקדות אור, ואת הספרה האובייקטים בתמונה מופקים המבוסס על שיטת זיהוי קצה מורכב; לבסוף, הקוטר של כל אובייקט כדור ניתן לחשב באמצעות טרנספורמציה האף18. כתוצאה מכך, וסטיית של הקוטר של ספירת אובייקטים ב כל תמונה יכול להיות מוערך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השבב למחצה 3D מיקוד זרימת microfluidic היה מפוברק באמצעות טכניקות הדפס אבן רכה שכבתיים כמתואר לעיל. תהליך ייצור ואת תוצאות עובש מאסטר ב- protocolare באיור 2. השכבה הראשונה, אשר מספק ערוץ רחב מיקרומטר 65 היכרות עם השלב מפוזרת ולא של 50 מיקרומטר רחב דיזה (איור 2), הוא 20 מיקרומטר עובי. שכבת עובי תוספת מיקרומטר 130 משמש כדי לספק את הערוץ פאזה רציפה וערוץ יציאה (איור 2b)...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הדור של טיפות במצב מיקוד זרימה באמצעות 2D ולמחצה 3D microfluidic התקן קודם לכן פותחה ב מגוון רחב של דוחות8,9,15,19,20, 21. במערכות אלו, הנוזל מימית לא יכול להיות פני השטח למוצק נבחר שלב התפזרו, כגון מים יונים8,15,20,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מחקר בסיסי שנג'ן מימון (מענק מס ' JCYJ 20150630170146829, JCYJ20160531195439665, JCYJ20160317152359560). המחברים רוצה להודות פרופסור י' חן שנג'ן מכונים מתקדמים הטכנולוגי, האקדמיה הסינית למדעים לתומכים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פרוסת סיליקוןHuashi Co., Ltd
SU-8 2025, 2100Microchem Co.מפתחת
Y111069 SU-8Microchem Co.
מסכת כרוםQingyi דיוק מסכה ביצוע ושות', בע"מ
פולידימתילסילוקסן (PDMS)Dow CorningSylgard 184
פולי (אתילן גליקול) דיאקרילט (PEGDA)Sigma26570-48-9
2-הידרוקסי-40-(2-הידרוקסיאתוקסי)-2-מתילפרופיופנוןTCIH1361-5Gפוטו-יוזם
הקסדקןSigma544-76- 3
ABIL EM 90CHT144243-53-8חומרים פעילי שטח
רודמין Bאלאדין81-88-9צבע פלואורסצנטי
ספין ציפוי
מכונת
מערבל משחה אוטומטיThinkyARV-310
תנורBluePard
מיקרוסקופ אופטיOLYMPUSIX71
מצלמה מהירהHamamatsu, יפןORCA-פלאש
MAESFLO מערכת בקרת נוזלים מיקרופלואידיתמנורת UV FUIGENTMFCS-EZ
FUTANSI365 ננומטר אור UV, 8000 MW/CM2
Y020100ליטוגרפיה

מקורות

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Xiao, Q., et al. Novel multifunctional NaYF4:Er3+,Yb3+/PEGDA hybrid microspheres: NIR-light-activated photopolymerization and drug delivery. Chemical communications. 49, 1527-1529 (2013).
  3. Pan, M., Kim, M., Blauch, L., Tang, S. K. Y. Surface-functionalizable amphiphilic nanoparticles for pickering emulsions with designer fluid-fluid interfaces. RSC Adv. 6, 39926-39932 (2016).
  4. Zhang, L., et al. Microfluidic synthesis of rigid nanovesicles for hydrophilic reagents delivery. Angewandte Chemie. 54, 3952-3956 (2015).
  5. Shembekar, N., Chaipan, C., Utharala, R., Merten, C. A. Droplet-based microfluidics in drug discovery, transcriptomics and high-throughput molecular genetics. Lab on a chip. 16, 1314-1331 (2016).
  6. Soh, G. Y., Yeoh, G. H., Timchenko, V. Numerical investigation on the velocity fields during droplet formation in a microfluidic T-junction. Chemical Engineering Science. 139, 99-108 (2016).
  7. Chiarello, E., Derzsi, L., Pierno, M., Mistura, G., Piccin, E. Generation of Oil Droplets in a Non-Newtonian Liquid Using a Microfluidic T-Junction. Micromachines. 6, 1825-1835 (2015).
  8. Moyle, T. M., Walker, L. M., Anna, S. L. Controlling thread formation during tipstreaming through an active feedback control loop. Lab on a chip. 13, 4534-4541 (2013).
  9. Moon, B. U., Abbasi, N., Jones, S. G., Hwang, D. K., Tsai, S. S. Water-in-Water Droplets by Passive Microfluidic Flow Focusing. Analytical chemistry. 88, 3982-3989 (2016).
  10. Zhu, P., Tang, X., Wang, L. Droplet generation in co-flow microfluidic channels with vibration. Microfluidics and Nanofluidics. , 20(2016).
  11. Kim, S. H., Kim, B. Controlled formation of double-emulsion drops in sudden expansion channels. Journal of colloid and interface science. 415, 26-31 (2014).
  12. Jeong, W. C., et al. Controlled generation of submicron emulsion droplets via highly stable tip-streaming mode in microfluidic devices. Lab on a chip. 12, 1446-1453 (2012).
  13. Peng, L., Yang, M., Guo, S. S., Liu, W., Zhao, X. Z. The effect of interfacial tension on droplet formation in flow-focusing microfluidic device. Biomedical microdevices. 13, 559-564 (2011).
  14. Nunes, J. K., Tsai, S. S., Wan, J., Stone, H. A. Dripping and jetting in microfluidic multiphase flows applied to particle and fiber synthesis. J Phys D Appl Phys. , 46(2013).
  15. Anna, S. L., Mayer, H. C. Microscale tipstreaming in a microfluidic flow focusing device. Physics of Fluids. 18, 121512(2006).
  16. Liu, H., et al. Microfluidic synthesis of QD-encoded PEGDA microspheres for suspension assay. J. Mater. Chem. B. 4, 482-488 (2016).
  17. Richardson, W. H. Bayesian-based iterative method of image restoration. Journal of the Optical Society of America. 62, 55-59 (1972).
  18. Mukhopadhyay, P., Chaudhuri, B. B. A survey of Hough Transform. Pattern Recognition. 48, 993-1010 (2015).
  19. Ward, T., Faivre, M., Stone, H. A. Drop production and tip-streaming phenomenon in a microfluidic flow-focusing device via an interfacial chemical reaction. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 9233-9239 (2010).
  20. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364(2003).
  21. Kim, H., et al. Controlled production of emulsion drops using an electric field in a flow-focusing microfluidic device. Applied Physics Letters. 91, 133106(2007).
  22. Dangla, R., Gallaire, F., Baroud, C. N. Microchannel deformations due to solvent-induced PDMS swelling. Lab on a chip. 10, 2972-2978 (2010).
  23. Chiu, Y. J., et al. Universally applicable three-dimensional hydrodynamic microfluidic flow focusing. Lab on a chip. 13, 1803-1809 (2013).
  24. Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. Design of pressure-driven microfluidic networks using electric circuit analogy. Lab on a chip. 12, 515-545 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PEGDAPDMSUV
דור של פולי שבשליטת גודל (אתילן גליקול) Diacrylate טיפות דרך דו-תלת-ממדי לזרום התמקדות Microfluidic מכשירים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.