בלוטת הרוק hypofunction הוא תוצאה תכופים של מחלות אוטואימוניות והקרנות. לשחזור הערכה של תפקוד בלוטת הרוק במודלים של העכבר המחלות האלה היא אתגר טכני. . הנה, מתוארת שיטה פשוטה למדידה מדויקת, לשחזור של ייצור רוק בעכברים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
חולים עם תסמונת סיוגרן, מחלה אוטואימונית משפיע על בלוטות אקסוקרינית, לפתח דלקת בלוטת הרוק, הפחיתו ייצור רוק. באופן דומה, ייצור רוק נפגעו קשות בחולים שקיבלו טיפול קרינה עבור סרטן הראש והצוואר. מודלים מכרסמים, שפותחה כדי לחקות תנאים קליניים אלה, להקל על הבנת הפתוגנזה המחלה ולאפשר הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשות. לכן, היכולת למדוד באופן מדויק, reproducibly ו שוב ושוב תפקוד בלוטת הרוק במודלים של בעלי חיים הוא קריטי. בונים על הליכים שתואר קודם לכן בספרות, שיטה פותחה עונה על קריטריונים אלה, שימש להערכת תפקוד בלוטת הרוק בעכברים. יתרון נוסף של שיטה חדשה היא כי זה הוא שולט בקלות, יש גרסא חדשה בין המפעיל. תפקוד בלוטת הרוק מוערך את הסכום (משקל או נפח) או קצב (mL/min) של הרוק מיוצר בתגובה לגירוי פילוקרפין. הרוק שנאספו הוא מקור טוב עבור הניתוחים של תכולת החלבון, ריכוזים בנוגדנים מולקולות אחרות.
מבוא
בלוטות הרוק לייצר רוק בתגובה למגוון גירויים נוירולוגית ועל מכניים1. הגירויים מתבצעות דרך מערכת העצבים הסימפתטית, הפארא-סימפתטי לקולטנים adrenergic, שימוש ב בלוטת. פילוקרפין הוא סוכן שימוש, פארא-sympathomimetic, אשר פועלת בעיקר על קולטנים מוסקריניים. בבלוטת הרוק, זה גורם הייצור של רוק על ידי משחק על קולטן מוסקריני M31. ייצור רוק בעקבות פילוקרפין המינהל הוא מחוון ליכולת של בלוטות הרוק להגיב לגירוי, הוא נפוץ כאמצעי של תפקוד בלוטת הרוק.
מדידה מדויקת של ייצור רוק הוא קריטי במחקר של מחלות בלוטת הרוק כולל תסמונת סיוגרן2 ופציעה קרינה בעקבות הראש והצוואר סרטן טיפול3. פותחו מספר שיטות שונות למדידת ייצור רוק בחולדות. אלה כוללות תעלות ישירה של צינור הרוק excretory4, אוסף של רוק בין חלל הפה תחת ואקום5, וכן אוסף באמצעות נימי זכוכית6 או7,micropipette8, 9. ישיר תעלות התעלה הרוק מספק ביותר רוק טהור ומדויקים. עם זאת, זהו תהליך מאתגר מבחינה טכנית, פוטנציאל גרימת חבלה ductal מונע אוספים רוק חוזרות של אותה חיה. איסוף הרוק תחת ואקום יכול להוביל לתוצאות משתנה עקב ייבוש של רוק מהצינור. אובדן זה היא מוגזמת נוספת אצל עכברים עם ריור מופחת. נימים זכוכית לאפשר את האוסף של רוק עבור ניתוחים שלאחר מכן, אולם, שינויי צמיגות של רוק מופרש במדינה נגועים מונע מילוי יעיל נים. יתרה מזאת, הניסיונות לטאטא את חלל הפה כדי לאסוף שאריות הרוק יכול להוביל לפציעה. שיטת pipet מאפשר איסוף מלאה, המפעיל אותו, זה עקביות במידה ניכרת בין ניסויים. עם זאת, מסיבות לא ידועות, שיטה זו מציגה וריאציה משמעותי בין מפעילי שונים. לכן, כדי לאפשר השוואות המתאים, הוא הופך להיות הכרחי שבו המפעיל אותו מבצע את כל הניסויים הקשורים לפרוייקט ספציפי. ברור, זה מייצג חיסרון מרכזי עבור מעבדה.
כדי להתגבר על בעיות אלה, הליך פותחה כי משלב רוק אוסף שיטות להשתמש עבור בני אדם ומכרסמים. שיטת ספוגית, המתוארים להלן למדידת נפח פילוקרפין-induced רוק פשוטה, לשחזור, לא השפיעו על ידי המפעיל, ניתן לבצע שוב ושוב על אותה חיה. בנוסף, היא מאפשרת איסוף הרוק עבור ניתוחים עוקבות של חלבונים, immunoglobulins או מולקולות אחרות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול המתואר להלן אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ועוקבת אחרי ההנחיות מוסרית נוסדה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים. כל הנתונים שהובאו בדו ח זה נוצר על ידי שימוש בעכברים הנשי שהיו בגיל 10-12 שבועות. זני עכברים הבאים שימשו: C57BL/6, BALB/ג, DBA1, 129S ו- F1 (B6XA/J). כל העכברים היו שוכנו בכלובים מכשול (5 חיות לכל כלוב) בתנאים מסוימים ללא הפתוגן וסיפק מזון ומים ad libitum.
1. הכנה
- כדי להכין פתרון מניות של פילוקרפין הידרוכלוריד, שוקלת 10 מ ג של המתחם, להמיס ב 1.776 מ ל תמיסת סטרילית מול מאת vortexing, בכדי לתת מענה מניות של 5.63 מ"ג/מ"ל. יש צורך לעקר את הפתרון הזה. אבל, אם תסנן את זה דרך מסנן 0.2 µM. לאחסן פתרון מניות זה aliquots מרובים במקפיא-80 oC עד 3 חודשים. כל מניה קפוא הוא לשימוש יחיד. ברגע הקרת, לא להקפיא את הפתרון פילוקרפין מחדש..
- קח 0.6 מ"ל microfuge צינורות, בזהירות אגרוף חור קטן בתחתית של כל שפופרת עם מחט אל תדאגי מחוממת. הגדר הצינורות האלה לתוך צינורות 2 מ"ל. הצינורות לא צריך להיות סטרילי.
- בעזרת סכין גילוח חד, סטרילי, לחתוך גליל מטליות סופג לחתיכות בערך 2 ס מ אורך. חותכים כל חלק 2 ס מ באלכסון כדי לתת 2 מטליות בצורת חרוט. הצב ספוגית אחת בכל אחד הצינורות microfuge 0.6 מ"ל.
- שוקלים את הצינור microfuge 0.6 מ"ל המכיל הקיסם יבש.
- העברת העכברים שילמדו לתוך כלוב נקי חדש עם בקבוקי מים. לשמור על העכברים ללא מזון במשך לפחות שעתיים לפני תחילת אוסף רוק כדי למנוע חלקיקי מזון שמזהם את הרוק שנאספו.
הערה: אין צורך לשמור על העכבר 1 לכל כלוב עבור הליך זה. עם זאת, מספר עכברים להציב בכלוב כל תלוי של המוסד הספציפי החוקים והתקנות לשימוש בבעלי חיים. - קצת לפני סוף 2 h, הכן הפתרון פילוקרפין לעבוד (0.0563 mg/mL) על ידי דילול מניות פתרון x 100 בתוך תמיסת מלח סטרילית. זה לא הכרחי כדי מסנן נוסף לעקר את הפתרון הזה. שמור תמיד את הפתרון פילוקרפין עובד על קרח.
הערה: טבלה 1 נותן כמות פילוקרפין כדי להיות מוזרק למגוון רחב של משקולות גוף העכבר כדי לתת מנה הסופי של 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף.
2. הליך
- שוקל כל עכבר, לקבוע את המינון של המיקס הרדמה עבור כל העכבר באמצעות טבלה 1. להזריק את העכבר הראשון עם נפח מתאים של המיקס הרדמה על ידי תוואי בקרום הבטן. לכוון את הטיימר למשך 2 דקות (רוב זני העכבר במקצועות פרוטוקול זה ללכת לישון על ידי 2 דקות). ודא כי העכבר הוא כראוי ומורדמת באמצעות חוסר הליכה כאשר מניחים על משטח שטוח. אם העכבר עדיין ללכת, לחכות 2 דקות נוספות לפני שתמשיך לשלב הבא. טיפה של משחה אופטלמולוגיות סיכה חלות על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.
הערה: טבלה 1, המינון של המיקס הרדמה היא 0.007 mL/גרם משקל. הטווח האופטימלי עבור הליך זה הוא במשקל הגוף כדי 0.006 0.008 מ ל/g. עם זאת, לאחר 4 דקות, אם העכבר עדיין הליכה או מציג תנועות קופצניות, התייעץ עם הוטרינר מוסדי עבור כראוי להגדיל את המינון של ההרדמה. - לקבוע את המינון של פילוקרפין אחר העכבר באמצעות טבלה 1 ולהזריק את הכמות המתאימה דרך בקרום הבטן. את הטיימר למשך 2 דקות ולהוסיף את העכבר לתוך הצינור restrainer 50 מ ל עד בראש ובאוזניים להישאר מחוץ הסוף לחתוך. הניחו את השפופרת בזווית של 45 מעלות, עם הראש למטה, ואת (גחוני) פונה כלפי מעלה. קלטת את הצינור ללוח הליך כדי למנוע את העברת.
הערה: טבלה 1 מספק המינון עבור עכברים יותר מ- 17 גרם, כמו בהליך זה ניסה לא על עכברים שקילה מתחת 17 גרם. - בסוף 2 דקות, בעדינות להוסיף זוג מיקרו לנתח מלקחיים לתוך הפה סגור והרם את הלסת התחתונה כלפי מעלה כדי לפתוח את הפה. לדחוף את המלקחיים 1-2 מ מ נוספים לתוך הפה, מוודא כי הלשון נתפסת נח על הזרוע העליונה של המלקחיים. עם עוד זוג מלקחיים בסדר, להחזיק הקיסם יבש מראש שנשקל קרוב את קצהו חרוט.
- החלק בעדינות את קצה הדגימה חרוט לתוך הפה. תיסוג המלקחיים ולהשאיר את קצה הדגימה בחלל הפה.
- לאחוז בקצה רחב יותר של הדגימה הארכת מחוץ הפה וסובב אותו כדי לאפשר מקסימום שטח המגע עם הפה. שמור את הספוגית בתנוחה זו למשך 15 דקות.
הערה: פעולה זו מבטיחה כי הדגימה נשאר בפה למשך כל האוסף. שימו לב כי קצה הדגימה חרוט משמש הפתיל, החלק הרחב של הדגימה, נותר מחוץ לפה. - בסוף 15 דקות, בעדינות לסובב הדגימה כדי לאסוף את כל רוק זה לא נספג ולמקם את הספוגית לחה בצינור microfuge 0.6 מ"ל. לסגור את הצינור ולהגדיר אותו בצינור 2 מ"ל על קרח.
הערה: בשלב זה, הרירית האוראלית יופיעו יבש לחלוטין. העכבר עכשיו ניתן להעביר בחזרה לכלוב שלו ההתאוששות מן ההרדמה. - להעביר את העכבר בתוך הכלוב. המקום לחלח באוכל שלהן בכלוב אחרי אוסף רוק כדי לסייע מהיר התייבשות.
הערה: העכברים להתעורר בתוך 10 דקות לאחר הסיום של האוסף. הזרקה תת עורית של 0.2 מ"ל תמיסת מלח מול ומחוממת מראש יכול להינתן גם כדי להאיץ את ההחלמה. - להמשיך העכבר הבאה. כל העכברים צריכים להיות במעקב עד הם התאוששו לגמרי, הן פעולות כירורגיות.
3. מדידות
- בסוף כל האוספים, לשקול את צינורות 0.6 מ"ל עם הדגימה רטוב. חישוב ההפרש בין משקל רטוב משקל יבש כדי לקבל את המשקל של הרוק מיוצר. מקם את הצינור 0.6 מ"ל עם הרוק בחזרה לתוך הצינור 2-mL.
- חתוך את הפקקים של הצינורות 2 מ"ל. לאחר מכן, centrifuge את צינורות 2 מ"ל למשך 2 דקות ב g 7500 x, ב 4oC ומפרידה מיקרו לשחזר את הרוק. למדוד את עוצמת הקול של הרוק תוך שימוש micropipette.
- לבטא את התוצאות כמו רוק משקל (מ ג)10 מעל 15 דקות או כיחס של רוק משקל (מ ג) / עכבר משקל הגוף (g).
הערה: אם יש כבר למדוד הנפח של רוק חולצו מתוך הדגימה, לבטא את התוצאות כמות הרוק התאושש (mL) או היחס בין נפח רוק (mL) / עכבר משקל הגוף (g).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במערכות דגם ניסיוני העכבר, היכולת לייצר רוק בתגובה לגירוי פילוקרפין משמש כמחוון של תפקוד בלוטת הרוק. ייצור רוק נמדדה בעכברים נקבה בת 11 בשבוע C57BL/6 בשיטת ספוגית. ב- איור 1A, התוצאות מבוטא את כמות הרוק (מ ג) שנאספו בעקבות הגדלת מינון של פילוקרפין. במינון של 1 מ"ג/ק"ג משקל גוף, חלק העכברים התחיל מפגין מצוקה (באופן לא רצוני רועד רועד). ומכאן מינונים גבוהים יותר של פילוקרפין, מעבר 1 מ"ג/ק"ג משקל גוף לא נבדקו במחקר זה. ב- איור 1B, ה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ייצור רוק הוא תהליך מורכב, מושפע מגורמים רבים. לכן, מדידת תפקוד בלוטת הרוק בחיות מעבדה עשויה להיות אתגר. אתגר נוסף הוא כי מדידות חוזרות של תפקוד בלוטת הרוק אצל אותה חיה נדרשים להקים תחילתה של מחלה או להפגין התאוששות לאחר הטיפול.
השיטה ספוגית שתוארו בדו ח זה פשוטה מבחינה טכנית לבצע עם אפשרויות מרובות כדי לייצג את הנתונים. התוצאות המתקבלות הן לשחזור, עם הבין-מפעיל גרסא חדשה. השיטה יכול לזהות ירידה בייצור הרוק מודלים שונים של תפקוד לקוי של בלוטת הרוק. יתרון משמעותי הוא השימוש של פולימרים אינרטי, ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
המחקר נתמך על ידי מענק של מכוני הבריאות הלאומיים, הלאומית המכון של שיניים ומחקר ואסטתיים (DE025030).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>כימיקלים לאיסוף רוק | |||
| פילוקרפין הידרוכלוריד | אלפא אזר, טוקסברי, מסצ'וסטס, ארה" | B21410 | מדלל במי מלח איזוטוניים סטריליים. אחסן מכסות חד פעמיות של מלאי 100X ב--80oC |
| Name | Company | >Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix Solution | Mix 1 מ"ל קטמין הידרוכלוריד + 0.5 מ"ל קסילזין + 8.5 מ"ל מי מלח איזוטוני סטרילי בבקבוקון סטרילי. ניתן לשימוש למשך 3 חודשים. | ||
| זטאמין (קטמין הידרוכלוריד) | Vet One, בויסי, איידהו, ארה"ב | מלאי C3N VT1 | הוא 100 מ"ג/מ"ל |
| אנאסד (קסילזין) | Med-Vet International, מטאווה, אילינוי, ארה"ב | מלאי RXANASED-20 | הוא 20 מ"ג/מ"ל |
| מי מלח סטריליים איזוטוני | Vet One, בויסי, איידהו, ארה"ב | 501032 | משמש כמדלל |
| דמעות מלאכותיות (משחת עיניים סיכה) | הנרי שיין, דבלין, אוהיו, ארה"ב | 48272 | משמש למניעת התייבשות העיניים במהלך ההליך |
| שם | חברה | Catalog Number | Comments |
| חומרים לאיסוף רוק | |||
| SalivaBio ספוגית ילדים | Salimetrics, LLC Carlsbad, קליפורניה, ארה"ב | N/A | ספוגיות עטופות בנפרד |
| 50 מ"ל צינורות פוליפרופילן | VWR, Radnor, PA, ארה"ב | 89004-364 | חותכים את החלק התחתון של 1 ס"מ של הצינור. וודא שהקצה החתוך חלק. |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה 0.6 מ"ל | VWR, רדנור, פנסילבניה, ארה" | 87003-290 | צור חורים בתחתית הצינור עם מחטים מחוממות 18 מד |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל | VWR, רדנור, פנסילבניה, ארה"ב | 87003-298 | |
| מזרקי אינסולין עם מחטים מחוברות לצמיתות | Becton Dickinson and Company, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה" | 324702 | |
| 18 מחטי | שיפוע רגילותבקטון דיקינסון ושות', פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב | 305195 | |
| להב אזמל סטרילי #11 | אינטגרה יורק בע"מ פנסילבניה, ארה"ב | 4-311 | |
| מלקחיים מיקרו-ניתוחים | רובוז, גייטרסבורג, MD, ארה"ב | RS-5139 | קצה זוויתי משונן 0.8 מ"מ, אורך 4 אינץ' |
| סרט תווית | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, דאלאס, טקסס, ארה"ב | sc-224487 | |
| טיימר 3 ערוצים | Amazon.com, סיאטל, וושינגטון, ארה"ב | B06W2KCYVN | |
| איזון אנליטי | מטלר טולדו, קולומבוס, אוהיו, ארה"ב | ||
| שם | חברה | Catalog Number | Comments |
| כימיקלים/ ריאגנטים לגרימת תפקוד לקוי של הרוק | |||
| LPS | Invivogen, סן דייגו, קליפורניה, ארה" | tlrl-b5lps | ממיסים במים נטולי אנדוטוקסין, ומאחסנים תמיסת מלאי ב-5 מ"ג/מ"ל. לדלל ב-HBSS סטרילי 100 ug/mL - להזריק 100 uL/moue ip |
| להזריק Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | לדלל 1:1 במי מלח סטריליים. הזרקה תוך-צפקית 0.1 מ"ל/עכבר |
| ארנב אנטי-Ro52 אנטי-סרום | נוצר במעבדה | חיסון של ארנבים עם עכבר רקומביננטי Ro52 | |
| שם | חברה | Catalog Number | Comments |
| >Chemicals/ ערכות לניתוחי רוק | |||
| <הערכת ליזוזים ברוק חזק> | |||
| ערכת בדיקת ליזוזים של EnzChek בדיקות | מולקולריות, יוג'ין, אורגון, ארה"ב | E-22013 | בשימוש לפי הוראות היצרן |
| שם< | strong>חברה | מספר קטלוגי | הערות |
| <הערכת IgA ברוק חזק> על ידי כריך ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, ברמינגהאם, AL, ארה"ב | 0106-01 | תקנים לכריך ELISA - טווח 30 ננוגרם/מ"ל עד 0.5 ננוגרם/מ"ל |
| עיזים נגד עכבר IgA ללא תווית | Southern Biotech, ברמינגהאם, AL, ארה" | 1040-01 | מעיל ב-1 ug/mL במאגר ביקרבונט |
| עיזים נגד עכבר IgA HRP | סאות'רן ביוטק, ברמינגהאם, אלבמה, ארה" | 1040-05 | נוגדן זיהוי בשימוש במצע TMB בדילול 1:4000 |
| בקטון דיקינסון ושות', פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב | 555214 | משמש לפי הוראות היצרן | |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 לוחות באר | Thermo Scientific, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב | 3855 | |
| שם | Company | מספר קטלוגי | הערות |
| הערכת חלבון רוק | |||
| Bio-Rad בדיקת חלבון תרכיז מגיב צבע | BioRad, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב | 5000006 | להערכת חלבון בהתאם להוראות היצרן |
מקורות
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
