אנו מתארים פרוטוקול של ניתוח stereotaxic עם מכשיר ביתי הראש-קבוע עבור ריאגנטים microinjecting לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית ב תאים עצביים של אזורים ספציפיים של מוח העכבר neonatal.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal
במאמר זה
סיכום
תקציר
גנים רבים באים לידי ביטוי מוח עובריים, חלק מהם מתבטאים באופן רציף במוח לאחר הלידה. עבור גנים ביטוי בהתמדה כאלה, הם עשויים לפעול כדי לווסת את תהליך התפתחותי ו/או תפקיד פיזיולוגי במוח neonatal. לחקור פונקציות הנוירוביולוגי של גנים ספציפיים במוח, זה חיוני כדי להשבית את הגנים במוח. כאן, אנו מתארים שיטה stereotaxic פשוטה כדי להשבית ביטוי גנים ב סטריאטום של העכברים הטרנסגניים ב windows בפעם neonatal. וירוסים AAV-eGFP-Cre היו microinjected לתוך סטריאטום Ai14 כתב ג'ין עכברים ביום כמחנכת (P) 2 באמצעות ניתוח מוח stereotaxic. בביטוי הגן כתב tdTomato זוהה סטריאטום P14, רומז ש-cre-loxP מוצלח מתווכת רקומבינציה DNA בתאים AAV transduced striatal. אנחנו עוד יותר תוקף טכניקה זו על-ידי microinjecting וירוסים AAV-eGFP-Cre לתוך P2Foxp2חליל/חליל עכברים. תיוג הכפול של ה-GFP, Foxp2 הראה כי תאים GFP-חיוביות חסרה Foxp2 immunoreactivity ב סטריאטום P9, רומז על אובדן Foxp2 החלבון בתאים striatal AAV-eGFP-Cre transduced. יחדיו, תוצאות אלו מדגימות של מחיקה גנטי אפקטיבי על ידי וירוסים stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre באוכלוסיות עצביים מסוימים במוחם neonatal של העכברים הטרנסגניים floxed. לסיכום, הטכניקה stereotaxic שלנו מספק פלטפורמה פשוטה וקלה עבור הנדסה גנטית במוח העכבר neonatal. הטכניקה לא ניתן להשתמש רק כדי למחוק גנים באזורים ספציפיים של המוח neonatal, אבל זה גם יכול לשמש כדי להזריק סמים תרופתי, המשדרים עצביים, optogenetics מהונדסים, chemogenetics חלבונים, אינדיקטורים פעילות. עצבית ו ריאגנטים אחרים לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal.
מבוא
מחקרים מודרניים של המבנה והתפקוד של המוח בדרך כלל דורשים מניפולציה גנטית של גנים ספציפיים בתוך תאים עצביים. כדי לחקור את הפונקציות של גנים שונים, העכברים הטרנסגניים נושאת אללים mutant, כולל נוק אאוט, טוק-in אללים באופן שגרתי נוצרו. ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים היא שיטה סטנדרטית מקומית לספק סמים, וירוסים, המשדרים, אחרים אזורים ספציפיים של המוח מכרסמים1,2. החלת ניתוח מוח stereotaxic את העכברים הטרנסגניים מתיר אחד גנטית לתפעל את תפקוד הגן ואת פעילות. עצבית באוכלוסיות ספציפיות עצביים במוח העכבר. המניפולציה ייחודיים לסוג התא מספקת גישה רב-עוצמה לפענח עצביים פונקציות מורכבות את המעגלים העצביים של המוח
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקולים בעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות של נבחרת יאנג מינג אוניברסיטת.
1. הכנה של בעל הגורים Neonatal במנגנון Stereotaxic
- להפוך את המגש בראש: לחתוך התחתון של שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL (15 מ מ אורך) לתוך הצורה שמתאימה לראש של הגורים neonatal על-ידי הסרת 1/5 של הקיר של הצינור.
- קח קופסא עצה פיפטה עם הגודל הנכון שמתאים בעזרת המעמד של המנגנון stereotaxic, להסיר את המכסה העליון. מוספית את מגש ראש המבושלות שלב 1.1 וקלטת ההטבעה רקמות על גבי הבסיס של עצה מגש עם דבק חם נמס. הגובה בקלטת ההטבעה הרקמה הוא 7 מ מ, אשר נמצא בשימוש כדי לתמוך הצוואר וגוף של הכלבלב בתפקיד ראש-קבוע.
- מקם את כל ההתאר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
על הסט הראשון של הניסוי, אנחנו microinjected 200 nL של וירוסים AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (AAV-eGFP-Cre, 1/10 דילול בתוך תמיסת מלח של Dulbecco פוספט buffered) המבטאים את recombinase Cre DNA התמזגו עם GFP לתוך סטריאטום P2 של עכברים Ai14. העכברים Ai14 אקספרס tdTomato מדווח על בתיווך Cre מחיקה של מלון loxP (floxed) עצור קלטת (איור 2F). המוח נבצרו ב P14 עבור immunostaining של ה-GFP, tdTomato. AAV רבים transduced תאים GFP-חיוביות היו המתנה לאורך סטריאטום.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקר הנוכחי, נדגים שיטה פשוטה ואמינה stereotaxic עבור הזרקת AAV וירוסים לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. אנחנו microinjected AAV-eGFP-Cre וירוסים לתוך סטריאטום של עכברים כתב Ai14-P2 ולאחר מכן נותחו בביטוי הגן כתב ב P14. מצאנו ש-AAV transduced תאים GFP-חיובית לאורך כל סטריאטום ברמות rostrocaudal. יתר על כן, כמעט כל התאים GFP-חיובית משותפת הביע הגן כתב tdTomato בתאים striatal, רומז על רקומבינציה Cre-loxP DNA מוצלחת המושרה על ידי ביטוי בתיווך AAV Cre פעילות. אנחנו עוד יותר לאשר את היעילות של גישה זו microinjections של .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע ולהעניק טכנולוגיה מעניקה MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, מכוני מחקר הבריאות הלאומי NHRI-EX106-10429NI, התוכנית מרכז מחקר אזורים נבחרים מענק משרד החינוך באמצעות מרכז מחקר המוח, האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג בטייוואן, ומענקים בתר MOST106-2811-B-010-031 (ס-ווי. סי), MOST105-2811-B-010-036, MOST106-2811-B-010-030 (ה-Y.K.).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 30G מחט PrecisionGlide | בקטון דיקינסון | REF 305106 | |
| כלורופורם | JT Baker | 9180-03 | |
| המילטון מזרק מיקרוליטר | המילטון | 80300 | 30G מחט מתאימה לצינור PE10; מחט 26G זקוקה למתאם PE20 |
| צינורות פוליאתילן PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| צינורות פוליאתילן PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| משאבת מזרק מיקרו קצב זרימה | ארוך יותר דיוק משאבת ושות'. | TJ-2A (בקר) ו-L0107-2A (יחידת כונן) | |
| מזרק 25G | בקטון דיקינסון | REF 302105 | |
| ירוק מהיר | סיגמא-אולדריץ' | F-7252 | 0.1% |
| מכשירים סטריאוטקסיים סטנדרטיים | RWD מדעי החיים | 68037 | ללא שימוש ב-68030 מתאם עכבר/חולדה יילודים |
| אנטי-FOXP2 נוגדן | Abcam | ab16046 | ארנב פוליקלונלי ל-FOXP2, 1:4,000 |
| נוגדן נגד RFP | Abcam | ab65856 | עכבר חד שבטי ל-RFP, מיקרוסקופ 1:1,000 |
| BX63 | אולימפוס | BX63 | |
| LSM 880 מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss | LSM 880 | |
| עז נגד ארנב מצומד Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | פן וקטור ליבת | AV-9-PV1848 | לוט # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, המכון למדעים ביו-רפואיים, אקדמיה סיניקה, טייוואן | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | מעבדת ג'קסון | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | מעבדת ג'קסון | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco' s פוספט חוצץ | מלח קורנינג סלגרו | 21-030-CVR |
מקורות
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
