ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

מחקרים מודרניים של המבנה והתפקוד של המוח בדרך כלל דורשים מניפולציה גנטית של גנים ספציפיים בתוך תאים עצביים. כדי לחקור את הפונקציות של גנים שונים, העכברים הטרנסגניים נושאת אללים mutant, כולל נוק אאוט, טוק-in אללים באופן שגרתי נוצרו. ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים היא שיטה סטנדרטית מקומית לספק סמים, וירוסים, המשדרים, אחרים אזורים ספציפיים של המוח מכרסמים^1,2. החלת ניתוח מוח stereotaxic את העכברים הטרנסגניים מתיר אחד גנטית לתפעל את תפקוד הגן ואת פעילות. עצבית באוכלוסיות ספציפיות עצביים במוח העכבר. המניפולציה ייחודיים לסוג התא מספקת גישה רב-עוצמה לפענח עצביים פונקציות מורכבות את המעגלים העצביים של המוח^3,4,5.

התפתחות עצבית של מערכת העצבים מתחילה אצל בשלבים עובריים מוקדמים ולהמשיך התהליכים התפתחותית לאחר הלידה עד תקופת ילדותי. כמחנכת ההבשלה של מערכת העצבים כולל את החיווט סינפטית מדויק של המעגלים העצביים, שהוא חיוני עבור פונקציות פיזיולוגיים, קוגניטיביים של המוח⁶. לכן, לימוד התפתחותית אירועים שמתרחשים בחלונות זמן neonatal חשוב לא רק להבנת התפתחות עצבית רגילה, אך זה עשויים גם כן לספק תובנות בפתוגנזה של התפתחותיות והפרעות מנוטלי^{7 ,8}. למרות שיטות ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים הם זמינים^2,9, כמה פרוטוקולים זמינים באינטרנט עבור ניתוח מוח stereotaxic עכברים neonatal^10,11. למעשה, microinjections stereotaxic של ריאגנטים לתוך מוחותיהם של העכבר neonatal הגורים קשים, כי ראשו של הגור neonatal חלש מכדי להיות קבוע במנגנון stereotaxic רגיל. עם זאת, היישום של ניתוח מוח stereotaxic העכברים הטרנסגניים הוא ריאלי עבור עכברים neonatal¹². כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה עם מלכודת תוצרת בית כדי לבצע ניתוח מוח stereotaxic ב העכבר היילוד הגורים. נדגים כי טכניקה זו מאפשרת למחיקת מותנית גנים floxed על ידי microinjecting recombinase לבטא AAV Cre DNA לתוך סטריאטום של הכתב ג'ין עכברים, מותנה העכברים הטרנסגניים floxed. טכניקה זו ישימה גם כדי לספק ריאגנטים לתוך סטריאטום neonatal של פראי-סוג עכברים.

הפרוטוקולים בעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות של נבחרת יאנג מינג אוניברסיטת.

1. הכנה של בעל הגורים Neonatal במנגנון Stereotaxic

1. להפוך את המגש בראש: לחתוך התחתון של שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL (15 מ מ אורך) לתוך הצורה שמתאימה לראש של הגורים neonatal על-ידי הסרת 1/5 של הקיר של הצינור.
2. קח קופסא עצה פיפטה עם הגודל הנכון שמתאים בעזרת המעמד של המנגנון stereotaxic, להסיר את המכסה העליון. מוספית את מגש ראש המבושלות שלב 1.1 וקלטת ההטבעה רקמות על גבי הבסיס של עצה מגש עם דבק חם נמס. הגובה בקלטת ההטבעה הרקמה הוא 7 מ מ, אשר נמצא בשימוש כדי לתמוך הצוואר וגוף של הכלבלב בתפקיד ראש-קבוע.
3. מקם את כל ההתארגנות מנגנון stereotaxic רגיל.

2. הכנת 30G מחטים הזרקת פלדת אל-חלד

1. מחטים נקיות מראש של מזרק 30 G בהשריה ב כלורופורם 3 ימים.
2. להשתמש מלקחיים לסגת לאט ובזהירות את המחט מ שלה רכזת פוליפרופילן ברדס כימי.
3. לשטוף את המחטים עם אתנול מוחלטת במשך 20 דקות ולאחריו שטיפות אתנול 70% 3 × 10 דקות על מטרף ב-50 סל ד. תנו לאוויר מחטים יבש, ולאחסן את המחטים נקי בתוך קופסה נקיים בטמפרטורת החדר (RT) עד השימוש.

3. מכינים את מתאם עבור צינורות Microinjection

1. לחבר את המזרק microliter מחט ההזרקה 30G עם צינור פוליאתילן PE10 (PE10 tube). היכונו גישור המחט הזרקת ואת המזרק microliter מתאם אבובים (PE20 tube) PE20 פוליאתילן. השימוש המתאם הכרחי, מכיוון הקוטר של הצינור PE10 הוא קטן בהרבה מזה של המחט של המזרק microliter 26 גרם.
2. להכין את הצנרור על המזרק microliter: לחבר את המחט הזרקת 30 G מראש נקי עם 5 ס מ PE20 צינור, ויסגור לצומת עם ודבק. מתאם אבובים הזה הוא לשימוש חוזר.
   הערה: אם המחט של מזרק microinjection 30 גרם, הכנה (שלב 3.1) והשימוש (שלב 3.3) מתאם זה אין צורך.
3. םאתמה תא אבובים (להכין בשלב 3.1) בעזרת מזרק microliter (10 µL).
4. חבר קצה אחד של הרכבת התחתית PE10 (לא יותר מ- 60 ס מ) על המחט 30 גרם של מתאם אבובים PE20. הר מחט ההזרקה 30G החדש אל הקצה השני של הצינור PE10.

4. לטעון את הצינור Microinjection עם מים מזוקקים בלוק, צבען ווירוסים

1. הסר את הבוכנה של המזרק microliter. השתמש מזרק 25 גרם כדי לטעון את המזרק microliter ושפופרת שלה מחובר PE עם מים מזוקקים בלוק להסיר את האוויר הצנרת.
2. מקם את הבוכנה בחזרה אל המזרק microliter ולאחר ללחוץ על הבוכנה עד µL 2 שרידי מים מזוקקים בקנה. אל תתנו הנפח של מים מזוקקים הפך נמוך יותר 2 µL.
3. הר בקפידה את המזרק microliter אל משאבת מזרק קצב זרימת מיקרו.
4. פיפטה כמויות קטנות של צבען 0.1% ירוק (מוכן ב- saline 0.9% וסינון במסנן מיקרומטר 0.22) ונוזלים וירוס בחתיכת עץ על מצלמות-מיקרוסקופים.
5. תיסוג כמות קטנה של אוויר לחשיפה בועת אוויר בצומת בין מחט הזריקה 30 גרם שפופרת PE10 ואחריה טעינה 0.7 µL של ירוק מהיר המסונן לאמבטיה כדי לבדוק את זרימת הנוזלים על הצנרת microinjection.
6. לסגת עוד כמות קטנה של אוויר כדי להפוך את בועת האוויר השני ואחריו העמסת נוזלים וירוס לתוך הצנרת microinjection.
7. לצרף ולאבטח את המחט microinjection 30G את הזרוע של המנגנון stereotaxic.

5. הרדמה של עכברים Neonatal מאת היפותרמיה

1. למקם את הכלבלב בשרוול כפפת לייטקס, לטבול אותו בקרח כתוש עד הצוואר למשך 5 דקות.
2. לצבוט הרגליים של הכלבלב עם מלקחיים כדי לוודא כי אין תגובה משיכה של הרגליים.
3. למקם את הגור עם כפפת לייטקס שרוול במגש הראשי, לשים קרח כתוש סביב שרוול גומי כדי לשמור אותה בקירור של היפותרמיה הרדמה.
4. הוטרינר משחה למרוח את העיניים של גור למניעת יובש תוך בהרדמה במידת האפשר.

6. microinjection

1. הכן ניתוח סטרילי על ידי ניגוב המכשיר stereotaxic ביסודיות עם 70% אתנול. לחטא את כלי כירורגי במועט אותם 70% אתנול.
2. לנקות את הראש של הכלבלב עם 70% אתנול. לאתר של למדא ציון על הגולגולת ולסמן את למבדה עם עט מרקר. לכוון את מחט למדא, והגדר את הקדמי-אחוריים (AP) והקואורדינטות המדיאלי-לרוחב (ML) כאפס.
3. להזיז את היד הזרקת לאתר היעד על פי הקואורדינטות X ו- Y של אתר היעד. עבור סטריאטום יום לאחר הלידה (P) 2 גורים, הקואורדינטות הן: AP, +2.4 מ מ, והשתרשה עמוק בלבה למדא; מל ', ±1.0 מ מ לרוחב מן האמצע; הגבי-הגחוני / (DV), −1.7 מ מ הגולגולת. לסמן את המיקום של צבע ירוק PE10 צינור עם עט.
4. להפיל את המחט הזרקת 30G לאט לחדור דרך העור הגולגולת ולאחר מכן להעלות קצה המחט עד לעצירתו על פני השטח של הגולגולת. הגדר הקואורדינטה DV כאפס.
5. להפיל את המחט הזרקת 30G באיטיות עד שהוא מגיע הקואורדינטה DV אתר היעד. המתן 1 דקות לאפשר parenchyma חידוש צורתו נורמלי. הפעל את התוכנית microinjection (nL 100 לדקה).
6. ודא כי הסימן של צבע ירוק הוא נע צינור PE כדי להבטיח שהנוזל הוירוס מוזרק לתוך המוח.
7. המתן 1 דקות םכסהה microinjection, ולאחר מכן לאט, בהדרגה להעלות את המחט לגובה 1/2 של DV עומק בתוך 30 s. לאחר 30 s, לאט לאט למשוך את המחט מהראש של הגורים.
8. חזור על שלב 6.2 ל 6.7 עד השלמת את microinjections של כל אתרי יישוב.

7. ההחלמה שלאחר הניתוח של הכלבלב

1. לחמם הגורים למשך 20 דקות בחממה 33 מעלות. בדוק את ההתאוששות של הכלבלב מהרדמה היפותרמיה כל 5 דקות עד הכלבלב שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
2. להחזיר את הכלבלב בחזרה אל הסכר אחרי הכלבלב הוא התאושש לחלוטין.

על הסט הראשון של הניסוי, אנחנו microinjected 200 nL של וירוסים AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (AAV-eGFP-Cre, 1/10 דילול בתוך תמיסת מלח של Dulbecco פוספט buffered) המבטאים את recombinase Cre DNA התמזגו עם GFP לתוך סטריאטום P2 של עכברים Ai14. העכברים Ai14 אקספרס tdTomato מדווח על בתיווך Cre מחיקה של מלון loxP (floxed) עצור קלטת (איור 2F). המוח נבצרו ב P14 עבור immunostaining של ה-GFP, tdTomato. AAV רבים transduced תאים GFP-חיוביות היו המתנה לאורך סטריאטום (איור 2 א, ג), המציין זיהום נרחב של תאים striatal על ידי וירוסים AAV-eGFP-Cre. ביטוי נרחב דומה של tdTomato נמצאה גם סטריאטום (איור 2B, ג). על בדיקה מיקרוסקופית בהגדלה, מצאנו כי כמעט כל התאים striatal GFP-חיובית משותפת הביע הגן כתב tdTomato (איור 2 א'-סי '). יתר על כן, tdTomato אותות אותרו מסופי האקסון ככל הנראה את globus pallidus (איור דו-ממדי) והאזורים של הסובסטנציה ניגרה pars reticulata (2E איור), את היעד של נוירונים הקרנה של striatonigral ו- striatopallidal- 13. תוצאות אלה מציעים מוצלחת Cre-loxP מתווכת רקומבינציה DNA הנגרם על ידי ביטוי בתיווך AAV Cre פעילות בנוירונים neonatal striatal.

על הסט השני של הניסוי, אנחנו microinjected 50 nL AAV-eGFP-Cre וירוסים לתוך סטריאטום של עכברים Foxp2חליל/חליל נושאים loxP מלון אללים Foxp2 -P2 (איור 3 א- ג, נ), וקצרו את המוח-P9. אין Foxp2+; GFP+ התווית על-ידי שני תאים נמצאו סטריאטום, כלומר., חלבון Foxp2 נעדר בתאים GFP-חיוביות (איור 3 א'-C'). בניסויים שליטה, Foxp2+; GFP+ התווית על-ידי שני תאים נכחו את סטריאטום של עכברים Foxp2חליל/חליל עם AAV-eGFP לשלוט וירוסים (דמות תלת-ממד), את סטריאטום של משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים Foxp2חליל / + עכברים עם AAV-eGFP-Cre וירוסים (איור 3E). תוצאות אלו מצביעות על ג'ין Foxp2 נמחקת באופן ספציפי בתאים AAV-eGFP-Cre transduced של סטריאטום neonatal.

יחדיו את התוצאות של AAV-eGFP-Cre; Ai14 , AAV-eGFP-Cre; Foxp2חליל/חליל עכברים, בטכניקה של ניתוח מוח neonatal stereotaxic שפיתחנו הוא לשכנוע מותנית מחק גנים באזורים ספציפיים של מוח העכבר neonatal.

איור 1. מכשיר stereotaxic, מחזיק את הראש-קבוע תוצרת בית עכברים neonatal. (א) מערכת הזרקת stereotaxic מורכב של ההתקנים הבאים: משאבת מזרק ט (בקר); ii. מזרק משאבה (יחידת הכונן); iii. microliter מזרק (10 µL); iv. PE20 אבובים מתאם; (פ') PE10 צינור; vi. 30G מחט הזריקה; מכשיר stereotaxic ז.; viii. תיבה טיפים פיפטה המרה פלטפורמה עבור הגורים neonatal; xi: קרח כתוש. (B) גובה הקלטת ההטבעה של הרקמה הוא בערך 7 מ מ. הלחצן 1.5 mL צנטריפוגה צינור הוא בערך 15 מ"מ. (ג) ראש עכבר מאובטח בבעל ראש-קבוע תוצרת בית. החץ מצביע על למדא ציון בראש של עכברים neonatal. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 2. הביטוי של tdTomato ב סטריאטום של עכברים P14 Ai14 לאחר AAV-eGFP-Cre מתווכת רקומבינציה Cre-loxP DNA- וירוסים AAV-eGFP-Cre היו sterotaxically מוזרק סטריאטום P2 של עכברים Ai14. המוח ניתחנו את P14. (א) תאים GFP-חיוביים רבים שנמצאים לאורך סטריאטום (Str). (B) תאים tdTomato-חיוביים רבים נמצאים גם סטריאטום. (ג) התמונות הממוזגות מראים על לוקליזציה שיתוף נרחב של ה-GFP, tdTomato סטריאטום. תמונות קונאפוקלית של האזורים מסגרת ב A-C מוצגים בהגדלה א' '-ג ', בהתאמה. כל התאים GFP-חיוביות (ירוק) מבטאים משותפת tdTomato (אדום) סטריאטום. (יח, E) אותות tdTomato מזוהים באזורי יעד striatal הקרנה הנוירונים, כולל את globus pallidus (GP; D) ו- reticulata pars על הסובסטנציה ניגרה (SNr; ה)- (נ) ציורים סכמטי של בונה הטרנסגניים AAV-eGFP-Cre ו- Ai14. אקס: קליפת; ספטמבר: מחצה; Hipp: ההיפוקמפוס; מגה: המוח האמצעי. סרגל קנה מידה A (for A-C), מיקרומטר 200; A' (עבור A'-ג' '), 10 מיקרומטר; D (עבור D ו- E), 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3. מחיקת מותנה Foxp2 ג'ין ב סטריאטום neonatal מאת intrastriatal injecions של וירוסים AAV-eGFP-Cre. Intrastriatal זריקות של וירוסים AAV-eGFP-Cre בוצעו P2 Foxp2חליל/חליל (A-C "), Foxp2חליל / +(E) עכברים. המוח נותחו-P9. (א-ג) GFP-חיוביות תאים (A, C, ירוק) חוסר immunoreactivity Foxp2 (B, C, אדום) ב- סטריאטום של עכברים Foxp2חליל/חליל עם וירוסים AAV-eGFP-Cre. האזורים מסגרת ב A-C מוצגים בהגדלה א' '-ג ', בהתאמה. (ד) תאים Striatal GFP שיתוף אקספרס ו- Foxp2 נמצאים סטריאטום זה הוזרק עם AAV-eGFP לשלוט וירוסים. (E) GFP-חיוביות תאים שותף אקספרס Foxp2 (חץ) הנמצאים סטריאטום של Foxp2חליל / + עכברים עם וירוסים AAV-eGFP-Cre. (נ) ציורים סכמטי של וירוס AAV-eGFP-Cre העכברים הטרנסגניים Foxp2חליל/חליל . סרגל קנה מידה A (for A-C), מיקרומטר 200; A' (עבור A'-ג ', D ו- E), 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.