הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

15.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57270

⸱

10 ביולי 2018

 ,  , 
1Institute of Neuroscience, National Yang-Ming University, 2Brain Research Center, National Yang-Ming University

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול של ניתוח stereotaxic עם מכשיר ביתי הראש-קבוע עבור ריאגנטים microinjecting לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית ב תאים עצביים של אזורים ספציפיים של מוח העכבר neonatal.

תקציר

גנים רבים באים לידי ביטוי מוח עובריים, חלק מהם מתבטאים באופן רציף במוח לאחר הלידה. עבור גנים ביטוי בהתמדה כאלה, הם עשויים לפעול כדי לווסת את תהליך התפתחותי ו/או תפקיד פיזיולוגי במוח neonatal. לחקור פונקציות הנוירוביולוגי של גנים ספציפיים במוח, זה חיוני כדי להשבית את הגנים במוח. כאן, אנו מתארים שיטה stereotaxic פשוטה כדי להשבית ביטוי גנים ב סטריאטום של העכברים הטרנסגניים ב windows בפעם neonatal. וירוסים AAV-eGFP-Cre היו microinjected לתוך סטריאטום Ai14 כתב ג'ין עכברים ביום כמחנכת (P) 2 באמצעות ניתוח מוח stereotaxic. בביטוי הגן כתב tdTomato זוהה סטריאטום P14, רומז ש-cre-loxP מוצלח מתווכת רקומבינציה DNA בתאים AAV transduced striatal. אנחנו עוד יותר תוקף טכניקה זו על-ידי microinjecting וירוסים AAV-eGFP-Cre לתוך P2Foxp2חליל/חליל עכברים. תיוג הכפול של ה-GFP, Foxp2 הראה כי תאים GFP-חיוביות חסרה Foxp2 immunoreactivity ב סטריאטום P9, רומז על אובדן Foxp2 החלבון בתאים striatal AAV-eGFP-Cre transduced. יחדיו, תוצאות אלו מדגימות של מחיקה גנטי אפקטיבי על ידי וירוסים stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre באוכלוסיות עצביים מסוימים במוחם neonatal של העכברים הטרנסגניים floxed. לסיכום, הטכניקה stereotaxic שלנו מספק פלטפורמה פשוטה וקלה עבור הנדסה גנטית במוח העכבר neonatal. הטכניקה לא ניתן להשתמש רק כדי למחוק גנים באזורים ספציפיים של המוח neonatal, אבל זה גם יכול לשמש כדי להזריק סמים תרופתי, המשדרים עצביים, optogenetics מהונדסים, chemogenetics חלבונים, אינדיקטורים פעילות. עצבית ו ריאגנטים אחרים לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal.

מבוא

מחקרים מודרניים של המבנה והתפקוד של המוח בדרך כלל דורשים מניפולציה גנטית של גנים ספציפיים בתוך תאים עצביים. כדי לחקור את הפונקציות של גנים שונים, העכברים הטרנסגניים נושאת אללים mutant, כולל נוק אאוט, טוק-in אללים באופן שגרתי נוצרו. ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים היא שיטה סטנדרטית מקומית לספק סמים, וירוסים, המשדרים, אחרים אזורים ספציפיים של המוח מכרסמים1,2. החלת ניתוח מוח stereotaxic את העכברים הטרנסגניים מתיר אחד גנטית לתפעל את תפקוד הגן ואת פעילות. עצבית באוכלוסיות ספציפיות עצביים במוח העכבר. המניפולציה ייחודיים לסוג התא מספקת גישה רב-עוצמה לפענח עצביים פונקציות מורכבות את המעגלים העצביים של המוח3,4,5.

התפתחות עצבית של מערכת העצבים מתחילה אצל בשלבים עובריים מוקדמים ולהמשיך התהליכים התפתחותית לאחר הלידה עד תקופת ילדותי. כמחנכת ההבשלה של מערכת העצבים כולל את החיווט סינפטית מדויק של המעגלים העצביים, שהוא חיוני עבור פונקציות פיזיולוגיים, קוגניטיביים של המוח6. לכן, לימוד התפתחותית אירועים שמתרחשים בחלונות זמן neonatal חשוב לא רק להבנת התפתחות עצבית רגילה, אך זה עשויים גם כן לספק תובנות בפתוגנזה של התפתחותיות והפרעות מנוטלי7 ,8. למרות שיטות ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים הם זמינים2,9, כמה פרוטוקולים זמינים באינטרנט עבור ניתוח מוח stereotaxic עכברים neonatal10,11. למעשה, microinjections stereotaxic של ריאגנטים לתוך מוחותיהם של העכבר neonatal הגורים קשים, כי ראשו של הגור neonatal חלש מכדי להיות קבוע במנגנון stereotaxic רגיל. עם זאת, היישום של ניתוח מוח stereotaxic העכברים הטרנסגניים הוא ריאלי עבור עכברים neonatal12. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה עם מלכודת תוצרת בית כדי לבצע ניתוח מוח stereotaxic ב העכבר היילוד הגורים. נדגים כי טכניקה זו מאפשרת למחיקת מותנית גנים floxed על ידי microinjecting recombinase לבטא AAV Cre DNA לתוך סטריאטום של הכתב ג'ין עכברים, מותנה העכברים הטרנסגניים floxed. טכניקה זו ישימה גם כדי לספק ריאגנטים לתוך סטריאטום neonatal של פראי-סוג עכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקולים בעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות של נבחרת יאנג מינג אוניברסיטת.

1. הכנה של בעל הגורים Neonatal במנגנון Stereotaxic

  1. להפוך את המגש בראש: לחתוך התחתון של שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL (15 מ מ אורך) לתוך הצורה שמתאימה לראש של הגורים neonatal על-ידי הסרת 1/5 של הקיר של הצינור.
  2. קח קופסא עצה פיפטה עם הגודל הנכון שמתאים בעזרת המעמד של המנגנון stereotaxic, להסיר את המכסה העליון. מוספית את מגש ראש המבושלות שלב 1.1 וקלטת ההטבעה רקמות על גבי הבסיס של עצה מגש עם דבק חם נמס. הגובה בקלטת ההטבעה הרקמה הוא 7 מ מ, אשר נמצא בשימוש כדי לתמוך הצוואר וגוף של הכלבלב בתפקיד ראש-קבוע.
  3. מקם את כל ההתארגנות מנגנון stereotaxic רגיל.

2. הכנת 30G מחטים הזרקת פלדת אל-חלד

  1. מחטים נקיות מראש של מזרק 30 G בהשריה ב כלורופורם 3 ימים.
  2. להשתמש מלקחיים לסגת לאט ובזהירות את המחט מ שלה רכזת פוליפרופילן ברדס כימי.
  3. לשטוף את המחטים עם אתנול מוחלטת במשך 20 דקות ולאחריו שטיפות אתנול 70% 3 × 10 דקות על מטרף ב-50 סל ד. תנו לאוויר מחטים יבש, ולאחסן את המחטים נקי בתוך קופסה נקיים בטמפרטורת החדר (RT) עד השימוש.

3. מכינים את מתאם עבור צינורות Microinjection

  1. לחבר את המזרק microliter מחט ההזרקה 30G עם צינור פוליאתילן PE10 (PE10 tube). היכונו גישור המחט הזרקת ואת המזרק microliter מתאם אבובים (PE20 tube) PE20 פוליאתילן. השימוש המתאם הכרחי, מכיוון הקוטר של הצינור PE10 הוא קטן בהרבה מזה של המחט של המזרק microliter 26 גרם.
  2. להכין את הצנרור על המזרק microliter: לחבר את המחט הזרקת 30 G מראש נקי עם 5 ס מ PE20 צינור, ויסגור לצומת עם ודבק. מתאם אבובים הזה הוא לשימוש חוזר.
    הערה: אם המחט של מזרק microinjection 30 גרם, הכנה (שלב 3.1) והשימוש (שלב 3.3) מתאם זה אין צורך.
  3. םאתמה תא אבובים (להכין בשלב 3.1) בעזרת מזרק microliter (10 µL).
  4. חבר קצה אחד של הרכבת התחתית PE10 (לא יותר מ- 60 ס מ) על המחט 30 גרם של מתאם אבובים PE20. הר מחט ההזרקה 30G החדש אל הקצה השני של הצינור PE10.

4. לטעון את הצינור Microinjection עם מים מזוקקים בלוק, צבען ווירוסים

  1. הסר את הבוכנה של המזרק microliter. השתמש מזרק 25 גרם כדי לטעון את המזרק microliter ושפופרת שלה מחובר PE עם מים מזוקקים בלוק להסיר את האוויר הצנרת.
  2. מקם את הבוכנה בחזרה אל המזרק microliter ולאחר ללחוץ על הבוכנה עד µL 2 שרידי מים מזוקקים בקנה. אל תתנו הנפח של מים מזוקקים הפך נמוך יותר 2 µL.
  3. הר בקפידה את המזרק microliter אל משאבת מזרק קצב זרימת מיקרו.
  4. פיפטה כמויות קטנות של צבען 0.1% ירוק (מוכן ב- saline 0.9% וסינון במסנן מיקרומטר 0.22) ונוזלים וירוס בחתיכת עץ על מצלמות-מיקרוסקופים.
  5. תיסוג כמות קטנה של אוויר לחשיפה בועת אוויר בצומת בין מחט הזריקה 30 גרם שפופרת PE10 ואחריה טעינה 0.7 µL של ירוק מהיר המסונן לאמבטיה כדי לבדוק את זרימת הנוזלים על הצנרת microinjection.
  6. לסגת עוד כמות קטנה של אוויר כדי להפוך את בועת האוויר השני ואחריו העמסת נוזלים וירוס לתוך הצנרת microinjection.
  7. לצרף ולאבטח את המחט microinjection 30G את הזרוע של המנגנון stereotaxic.

5. הרדמה של עכברים Neonatal מאת היפותרמיה

  1. למקם את הכלבלב בשרוול כפפת לייטקס, לטבול אותו בקרח כתוש עד הצוואר למשך 5 דקות.
  2. לצבוט הרגליים של הכלבלב עם מלקחיים כדי לוודא כי אין תגובה משיכה של הרגליים.
  3. למקם את הגור עם כפפת לייטקס שרוול במגש הראשי, לשים קרח כתוש סביב שרוול גומי כדי לשמור אותה בקירור של היפותרמיה הרדמה.
  4. הוטרינר משחה למרוח את העיניים של גור למניעת יובש תוך בהרדמה במידת האפשר.

6. microinjection

  1. הכן ניתוח סטרילי על ידי ניגוב המכשיר stereotaxic ביסודיות עם 70% אתנול. לחטא את כלי כירורגי במועט אותם 70% אתנול.
  2. לנקות את הראש של הכלבלב עם 70% אתנול. לאתר של למדא ציון על הגולגולת ולסמן את למבדה עם עט מרקר. לכוון את מחט למדא, והגדר את הקדמי-אחוריים (AP) והקואורדינטות המדיאלי-לרוחב (ML) כאפס.
  3. להזיז את היד הזרקת לאתר היעד על פי הקואורדינטות X ו- Y של אתר היעד. עבור סטריאטום יום לאחר הלידה (P) 2 גורים, הקואורדינטות הן: AP, +2.4 מ מ, והשתרשה עמוק בלבה למדא; מל ', ±1.0 מ מ לרוחב מן האמצע; הגבי-הגחוני / (DV), −1.7 מ מ הגולגולת. לסמן את המיקום של צבע ירוק PE10 צינור עם עט.
  4. להפיל את המחט הזרקת 30G לאט לחדור דרך העור הגולגולת ולאחר מכן להעלות קצה המחט עד לעצירתו על פני השטח של הגולגולת. הגדר הקואורדינטה DV כאפס.
  5. להפיל את המחט הזרקת 30G באיטיות עד שהוא מגיע הקואורדינטה DV אתר היעד. המתן 1 דקות לאפשר parenchyma חידוש צורתו נורמלי. הפעל את התוכנית microinjection (nL 100 לדקה).
  6. ודא כי הסימן של צבע ירוק הוא נע צינור PE כדי להבטיח שהנוזל הוירוס מוזרק לתוך המוח.
  7. המתן 1 דקות םכסהה microinjection, ולאחר מכן לאט, בהדרגה להעלות את המחט לגובה 1/2 של DV עומק בתוך 30 s. לאחר 30 s, לאט לאט למשוך את המחט מהראש של הגורים.
  8. חזור על שלב 6.2 ל 6.7 עד השלמת את microinjections של כל אתרי יישוב.

7. ההחלמה שלאחר הניתוח של הכלבלב

  1. לחמם הגורים למשך 20 דקות בחממה 33 מעלות. בדוק את ההתאוששות של הכלבלב מהרדמה היפותרמיה כל 5 דקות עד הכלבלב שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
  2. להחזיר את הכלבלב בחזרה אל הסכר אחרי הכלבלב הוא התאושש לחלוטין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על הסט הראשון של הניסוי, אנחנו microinjected 200 nL של וירוסים AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (AAV-eGFP-Cre, 1/10 דילול בתוך תמיסת מלח של Dulbecco פוספט buffered) המבטאים את recombinase Cre DNA התמזגו עם GFP לתוך סטריאטום P2 של עכברים Ai14. העכברים Ai14 אקספרס tdTomato מדווח על בתיווך Cre מחיקה של מלון loxP (floxed) עצור קלטת (איור 2F). המוח נבצרו ב P14 עבור immunostaining של ה-GFP, tdTomato. AAV רבים transduced תאים GFP-חיוביות היו המתנה לאורך סטריאטום...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר הנוכחי, נדגים שיטה פשוטה ואמינה stereotaxic עבור הזרקת AAV וירוסים לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. אנחנו microinjected AAV-eGFP-Cre וירוסים לתוך סטריאטום של עכברים כתב Ai14-P2 ולאחר מכן נותחו בביטוי הגן כתב ב P14. מצאנו ש-AAV transduced תאים GFP-חיובית לאורך כל סטריאטום ברמות rostrocaudal. יתר על כן, כמעט כל התאים GFP-חיובית משותפת הביע הגן כתב tdTomato בתאים striatal, רומז על רקומבינציה Cre-loxP DNA מוצלחת המושרה על ידי ביטוי בתיווך AAV Cre פעילות. אנחנו עוד יותר לאשר את היעילות של גישה זו microinjections של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע ולהעניק טכנולוגיה מעניקה MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, מכוני מחקר הבריאות הלאומי NHRI-EX106-10429NI, התוכנית מרכז מחקר אזורים נבחרים מענק משרד החינוך באמצעות מרכז מחקר המוח, האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג בטייוואן, ומענקים בתר MOST106-2811-B-010-031 (ס-ווי. סי), MOST105-2811-B-010-036, MOST106-2811-B-010-030 (ה-Y.K.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
30G מחט PrecisionGlideבקטון דיקינסוןREF 305106
כלורופורםJT Baker9180-03
המילטון מזרק מיקרוליטרהמילטון 8030030G מחט מתאימה לצינור PE10; מחט 26G זקוקה למתאם PE20
צינורות פוליאתילן PE20Becton Dickinson427406
צינורות פוליאתילן PE10Becton Dickinson427401
משאבת מזרק מיקרו קצב זרימהארוך יותר דיוק משאבת ושות'.TJ-2A (בקר) ו-L0107-2A (יחידת כונן)
מזרק 25Gבקטון דיקינסוןREF 302105
ירוק מהירסיגמא-אולדריץ'F-72520.1%
מכשירים סטריאוטקסיים סטנדרטייםRWD מדעי החיים68037ללא שימוש ב-68030 מתאם עכבר/חולדה יילודים
אנטי-FOXP2 נוגדןAbcamab16046ארנב פוליקלונלי ל-FOXP2, 1:4,000
נוגדן נגד RFPAbcamab65856עכבר חד שבטי ל-RFP, מיקרוסקופ 1:1,000
BX63אולימפוסBX63
LSM 880 מיקרוסקופ קונפוקליZeissLSM 880
עז נגד ארנב מצומד Alexa fluor594Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40פן וקטור ליבתAV-9-PV1848לוט # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFPAAV core, המכון למדעים ביו-רפואיים, אקדמיה סיניקה, טייוואןN/A1x1014 (GC/ml)
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/Jמעבדת ג'קסון 007914Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJמעבדת ג'קסון 026259Foxp2fl/fl
Dulbecco' s פוספט חוצץמלח קורנינג  סלגרו21-030-CVR

מקורות

  1. Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
  2. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
  4. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  5. Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
  6. Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
  7. Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
  8. Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
  9. Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600(2013).
  10. Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
  11. Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
  12. Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
  13. Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
  14. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  15. Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

AAV eGFP CreCre loxP
ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.