כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להשיג את השומנים droplet אינדקס (אינדקס LD) ללמוד את הדינמיקה של triacylglycerols בתאים בתרבית בניסויים תפוקה גבוהה. LD אינדקס וזמינותו היא שיטה קלה ומהימנה של המשתמשת BODIPY 493/503. Assay הזה אינו צריך שאיבת השומנים dispendious או ניתוח מיקרוסקופ.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השומנים נחישות אינדקס על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוזלי השחזור של פטריות פתוגניות זקן התירס פחמון
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
המאמר מראה כיצד ליישם את הבדיקה אינדקס LD, אשר הוא רגיש microplate assay כדי לקבוע את הצטברות triacylglycerols (TAGs) בטיפות השומנים (LDs). אינדקס LD מתקבל ללא חילוץ השומנים. היא מאפשרת מדידה התוכן LDs בניסויים תפוקה גבוהה בתנאים שונים כגון צמיחה עשיר או חנקן דלה מדיה. אף על פי השיטה שתוארה לראשונה לחקור את חילוף החומרים של השומנים droplet של האפייה, הוחל בהצלחה אל basidiomycete פחמון זקן התירס. מעניין לציין, כי LDs organelles phylogenetically שמור ב התאים האיקריוטים, השיטה וניתן להחילם למגוון גדול של תאים, מ שמרים בתרבית של תאים. מדד LD מבוססת על וזמינותו שחזור פלורסצנטיות נוזלי (LFR) של BODIPY 493/503 בתנאים שכבתה, על ידי התוספת של תאים קבוע עם פורמלין. יוד האשלגן משמש כ'חטיף זריחה. היחס בין זריחה על המדרונות צפיפות אופטית נקרא מדד LD. מדרונות מחושבים מתוך הקווים ישרים מתקבל כאשר BODIPY פלורסצנטיות, צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) מותוות נגד מדגם תוספת. איכות הנתונים אופטימלית משתקף על ידי מקדמי המתאם שווה או מעל 0.9 (r ≥ 0.9). מספר דוגמאות ניתן לקרוא בו זמנית כמו זה ניתן להטמיע את microplate. מאחר BODIPY 493/503 פלורסנט lipophilic לצבוע את המחיצות לתוך טיפות השומנים, ניתן להשתמש בסוגים רבים של תאים שנצברים LDs.
מבוא
השומנים טיפות (LDs) הינם גופים שומן תאיים בכל מקום מורכב גרעין של שומנים נייטרלי, בעיקר תגיות, סטרול אסטרים (SE). הליבה מוקף טפט של פוספוליפידים המקיימת אינטראקציה עם חלבונים כמו perilipin ואנזימים המעורבים הסינתזה של שומנים נייטרלי, כגון diacylglycerol ליפיד-טרנספראז, אצטיל קואנזים a קרבוקסילאז ו ליפיד-CoA סינתאז1. בשל התנהגות דינמית שלה, טפט פוספוליפיד מכיל גם lipases triacylglycerol זה hydrolyze תגיות ו- SE2. בהתאם לסוג התא באורגניזם, ליפידים נייטרלי מאוחסנות יכול לשמש כדי לייצר אנרגיה, או לסנתז phospholipids ו מולקולות איתות. שמרים ופטריות אחרים, התוכן של LDs משתנה בתגובה בווריאציות יחס פחמן/חנקן בתקשורת תרבות, המציי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מאגרי ופתרונות
- להכנת 1 ליטר של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS, pH 7), לפזר 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של אשלגן כלורי, 1.44 גר' נה2HPO4, 0.24 גר' ח'2PO4 ב- 800 מ ל מים distillated. להתאים את ה-pH אל 7.0 עם HCl, ולאחר מכן להוסיף מים עבור אמצעי אחסון הסופי של PBS ל' 1 ניתן בתפקיד 10 x פתרון מניות, בטמפרטורת החדר.
- כדי להכין 10 מ"ל של תיקון פתרון, להוסיף 1 מ"ל של 37% פורמלדהיד 9 מ של PBS להגיע ריכוז סופי של 3.7%. להכין פתרון זה רק לפני השימוש.
התראה: שימוש בכפפות כדי להתמודד עם הפתרון פורמלדהיד. - כדי להכין את שכבתה-הפתרון (500 מ מ), לפזר 8.3 g של קי ב- 100 מ של מים מזוקקים. להכין את הפתרון הזה ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
LFR, עם BODIPY 493/503 כמו החללית פלורסנט היא שיטה אמין וקל ללמוד הצטברות דינמי של זיהוי זקן התירס בארצות הברית, ללא קשר לתנאי הגידול. כאשר התאים היו תרבותי YPD-בינוני, חלה עלייה במדד LD במהלך שלב מעריכית, ולאחריו ירידה בשלב נייח (איור 2 א). לעומת זאת, בתאי גדל תחת חנקן הרעבה, הייתה עלייה קבועה באינדקס LD בשלבים שני מעריכי, נייח (איור 2B). כי שתי תרבויות הופעלו עם הצפיפות האופטית אותו (דומה מספר תאים), התוצאות מציגות את .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
LFR היא שיטה שהוחל בפעם הראשונה ללמוד מטבוליזם השומנים ב cerevisiae ס ומעלה זה היה בהצלחה מיושמת ב- U. זקן התירס20,21. למרות מדד LD אינו נותן בערכו המוחלט של תגי שהצטברו בתאים, הוא מספק רעיון מהיר של התוכן השומנים של תאים, הפרשנות של הנתונים היא פשוטה כאשר אינדקס LD מתנאי הניסוי שניים או יותר מושווים. BODIPY 493/503 הוא מאוד ספציפי שומנים נייטרלי, המרכיב העיקרי של תעודות זהות, ויש בו ספקטרום פליטה צר הקלת הגילוי סימולטני של אותות אחרים מגיעים צב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין שום גילוי
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים אינסטיטוטו Politécnico Secretaria נאסיונאל דה Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Apoyo דה פרוגרמה e Proyectos דה Investigación Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(אוניברסיטת נאסיונאל Autónoma de México UNAM), ו- y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Tecnología (CONACyT 254904-JPP ו- 256520-GGS). Fundação דה אמפרו Pesquisa לעשות את ריו דה ז'ניירו (FAPERJ-Cientistas לעשות Nosso Estado: E 26/103.353/2011). אנחנו הודות QFB. אוסקר Iván Luqueño Bocardo עבור סקירה סכמטי. אנו מודים ד ר מיגל Tapia רודריגס על העזרה יקר מיקרוסקופיה קונפוקלית של תעודות זהות. אנו מאחלים תודה ד ר ברונו Bozaquel Morais על עבודתו החלוצית בחקר פיתוח הטכניקה cer....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ספקטרופוטומטר | Varioskan Lux multimode microplate reade | D5879 | מסנן 493/503 או גלאי מונוכרומטור |
| צלחת costar | Corning Inc. | 3615 | 96 באר קיר שחור/תחתון שקוף |
| צלחת | כוכב קורנינג בע"מ | 3598 | 96 באר צלחת תרבית תאים כוכב |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen / Thermofisher | D3922 | 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene |
| תמיסת פורמלדהיד | סיגמא אולדריץ' | 252549 | מגיב ACS, 37% wt % ב-H2O, מכיל 10-15% מתנול למניעת פילמור |
| אשלגן יודיד | סיגמא אולדריץ' | 60399 | BioUltra, ≥ 99.5% (AT) |
| FB2 Ustilago maydis | ATCC | 201384 | שמרים בסיסיומיצטים |
| נתרן כלורי | סיגמא אולדריץ' | 746398 | מגיב ACS, מלח אנאורגני |
| אשלגן פוספט מונו-בסיסי | סיגמא אולדריץ' | P0662 | מגיב ACS |
| תמצית שמרים נבחרת | סיגמא אולדריץ' | Y100 | תערובת של חומצות מיני, פפטידים, מסיסים במים, ויטמינים ופחמימות למצע תרבית |
| מארז NZ בתוספת | סיגמא אולדריץ' | N4642 | קזאין הידרוליזט אנזימטי מחלב בקר |
| גלוקוז | סיגמא אולדריץ' | G-8270 | D (+) גלוקוז |
| בקבוק סקייקר | Pirex | CLS4450250-6EA | Borosiicate זכוכית |
| שייקר | SEV Mé xico | INO650V-7 | שייקר אורביטלי |
| שולחן צנטריפוגה | Eppendorf | 5415C | צנטריפוגה |
| מיקרו-צינורות | סיגמא אולדריץ' | Z606340 | טיפים לפיפט אפנדורף |
| Axygen scientific | T-200-Y | טיפים פיפט אוניברסלי עם קצה משופע, 200 מיקרוליטר, פיפטה mLine לא סטרילית | |
| Biohit | 725130 | 8 ערוצים, טווח עוצמת קול 5-100 uL |
מקורות
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
