מאמר שיטה

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

DOI:

10.3791/57281

⸱

28 בפברואר 2018

 , 
1Center for Infectious Diseases, Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המערכת החיסונית מעיים ממלא תפקיד חיוני בשמירה על המכשול את תפקוד מערכת העיכול על ידי יצירת סובלנית התגובות אנטיגנים תזונתיים וחיידקים commensal בעת טעינת תגובות חיסוניות יעילה כדי enteropathogenic מיקרובים. בנוסף, כבר ברור כי החסינות המקומית מעיים יש השפעה עמוקה על חסינות מרוחק ומערכתית. לכן, חשוב ללמוד איך תגובה חיסונית מעיים הוא המושרה ומהי התוצאה אוטואימונית של התגובה. . הנה, פרוטוקול מפורט מתואר על הבידוד של לימפוציטים מפני מהאתרים אינדוקטיבית המעי הדק של פייה רקמת הלימפה הקשורים בטן ותיקונים בלוטות לימפה mesenteric ניקוז ואתרי אפקטור כמו פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי. שיטה זו מבטיחה בידוד של מספר גדול של לימפוציטים רקמות במעיים קטן עם טוהר האופטימלי ואת הכדאיות מינימלי זיהום compartmental לחצות בתוך אילוצי זמן מקובל. היכולת הטכנית לבודד לימפוציטים ותאים חיסוניים אחרים רקמות מעיים מאפשר את הבנת התגובות החיסונית זיהומים במערכת העיכול, סרטן ומחלות דלקתיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העיכול (GI) יש הרבה קיפולים בליטות המייצג את הממשק הגדול המפריד בין הגוף הפנימיים ואת הסביבה החיצונית. המערכת החיסונית מעיים ממלא תפקיד חיוני בשמירה על הפונקציה מכשול של דרכי העיכול. הוא כל הזמן נחשף אנטיגנים תזונתיים commensal חיידקים, חיידקים פתוגניים. בתור שכזה, זה חייב להישאר סובלני כדי אנטיגנים מזון וחיידקים commensal תוך שמירה על יכולת לייצר במהירות תגובה חיסונית יעיל חיידקים enteropathogenic1. מערכת החיסון במעי יכול להיות מבחינה אנטומית מחולק אתרי אינדוקטיבית, איפה לימפוציטים נאיביים מופעלים על ידי אנטיגן הצגת תאים נושאת אנטיגנים של רירית המעי, ואתרי אפקטור, שבו מופעל לימפוציטים להפעיל ספציפי אפקטור פונקציות2. האתרים אינדוקטיבית מהווים את המבנה הלימפה מאורגן של טלאים של פייה (PP) זה סוקר לומן מעיים ישירות דרך הפעולה של תאים מיוחדים מ', את אזורי ניקוז בלוטות לימפה mesenteric (MLN). האתרים אפקטור מורכב מוסקולריס פרופריה (LP), אשר הוא רקמת החיבור שמתחת קרום המרתף, האפיתל במעי, שכבה תא בודד הממוקם מעל קרום המרתף המכיל intraepithelial הנרתיק לימפוציטים (אישור IEL). לימפוציטים הם השחקנים המרכזיים של חסינות מסתגלת לתווך הגנה מפני זיהומים, סרטן, עשוי גם לתרום immunopathology במחלות דלקתיות. חשוב ולהבין רלוונטיות גבוהה ללמוד לימפוציטים אלה ברורים אנטומי תאי הרירית טוב יותר שלהם אינדוקציה ופונקציות אפקטור.

פרוטוקול יחסית פשוטה ואחידה על הבידוד של לימפוציטים של תאים אלה יש צורך כפי ומאיצות מספר חוקרים חקר מערכת החיסון אירועים המתרחשים במעי. מספר קבוצות המחקר פורסמו הפרוטוקולים חולקים מספר תהליכים דומים עבור בידוד תאים חיסוניים העכבר קטן תאי המעי3,4,5,6,7 . עם זאת, ישנם מספר הבדלים טכניים בין השאר בהתאם המוקד של פרוטוקול בודדים. לדוגמה, תוך התמקדות לבודד את התאים החיסוניים מ אריך הנגן, פרוטוקול אחד בוחן את ההשפעה של digestions אנזימטיות שונות על הכדאיות התא, התא סמן משטח ביטוי ההרכב של תאים חיסוניים מבודד5. פרוטוקול אחר מדגיש שיטה לשחזור מהיר עבור בידוד של לימפוציטים ללא צפיפות צנטריפוגה6. לבסוף, פרוטוקולים מסוימים קיימים גם לצורך בידוד תאי phagocytes משכבות רקמות שונות של המעי הדק7. כאן מוצג מאוד לשחזור פרוטוקול המאפשר בידוד רציפה של לימפוציטים אוכלוסיות של תא MLN, PP, LP ו אישור IEL של המעי הדק.

אנו מתמקדים בידוד אוכלוסיות נקיים במיוחד מן LP ו אישור IEL מדורים, חופשיים במידה רבה של מזהמים של תאים מעיים אחרים. זה נעשה שימוש נרחב פרוטוקול מפיק תשואה גבוהה של לימפוציטים טהור מקסימאלית בר -קיימא תוך זמן מקובל אילוצים4,8,9,10,11,12. פרוטוקול זה גם מבטיח את הבידוד של לימפוציטים מן התא LP ו אישור IEL עם זיהום compartmental לחצות מינימלי, ומאפשר הזדמנות בתום ללמוד לימפוציטים בקרונות אלה ברורים. יכול להיות נתון לימפוציטים מבודד מניפולציות נוספות כמו ניתוח תזרים cytometric או אנליזה פונקציונלית. פרוטוקול זה יושם בהצלחה את בידודה של לימפוציטים העכבר המעי הדק, המעי הגס במהלך זיהומים חיידקיים כגון ליסטריה, סלמונלה typhimurium, Yersinia pseudotuberculosis זיהומים ובתנאים דלקתיות כמו קוליטיס כימית - ו פתוגן-induced. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבודד תאים חיסוניים מולדים כגון תאים דנדריטים, מקרופאגים, נויטרופילים ומונוציטים העכבר המעי הדק, המעי הגס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ניסויים בבעלי חיים היו לפי הנחיות המכון הלאומי לבריאות ואושר על ידי סטוני ברוק אוניברסיטת מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה.

הערה: ודא כי כל האישורים מוענקות לפני ביצוע הליכים.

1. פתרון הכנה

  1. HGPG (HEPES,-גלוטמין פניצילין/סטרפטומיצין, gentamycin), 100 ×
    1. לערבב 59.6 g HEPES (500 מ"מ הסופי), 14.6 g L-גלוטמין (200 מ"מ הסופי), 1 × 106 U פניצילין (2,000 U/mL הסופי), סטרפטומיצין 1 g (2 מ"ג/מ"ל הסופי) ו- 2.5 מ"ג גנטמיצין (5 µg/mL הסופי). להוסיף RPMI 1640 עד 500 מ"ל. להתאים את ה-pH 7.5 באמצעות NaOH (לפני ההתאמה, המאגר הוא צהוב/כתום עם pH בסביבות 6.0). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. Aliquot, חנות ב-20 ° C עד 1 שנה או ב 4 ° C עד כחודש.
  2. מאגר HEPES-ביקרבונט, 10 x
    1. לערבב 23.8 g HEPES (100 מ מ הסופי), 21 גרם NaHCO3 (250 מ מ הסופי) ומוסיפים מים עד 1000 מ"ל. להתאים את ה-pH ל 7.2 עם HCl. מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.45 μm. לאחסן בטמפרטורת החדר. ה-pH משתנה לאורך זמן. מחדש להתאים את ה-pH מעת לעת.
  3. הקציר מדיה (~ עכברים בקבוק 1/2)
    1. עד 500 מ"ל RPMI 1640, להוסיף 25 מ ל חום-לא פעיל העובר שור סרום (5% הסופי), 5 מ ל 100 × HGPG. לאחסן עד 6 חודשים ב 4 º C.
  4. Dithioerythritol (DTE) פתרון (40 מ ל/קטן המעי)
    1. מערבבים 50 מ ל 10 × תמיסת מלח מאוזנת הנקס, Ca2+- ומ ג2+-חינם, 50 מ ל 10 × HEPES-ביקרבונט מאגר ולאחר 50 מ ל חום-לא פעיל העובר שור סרום (10% הסופי). להוסיף 350 מ ל H2O ו- 15.4 מ"ג dithioerythritol/100 מ"ל (1 מ מ הסופי). להכין את זה טרי לפני השימוש.
  5. Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) פתרון (50 מ ל/קטן המעי)
    1. מערבבים 50 מ ל 10 × תמיסת מלח מאוזנת הנקס, Ca2+- ומ ג2+-חינם עם 5 מ ל 100 × HGPG. להוסיף 445 מ ל H2O. להוסיף 260 µL 0.5 M EDTA/100 מ ל (1.3 מ מ הסופי). להכין את זה טרי לפני השימוש.
  6. Collagenase פתרון (30 מ ל/LP)
    1. עד 500 מ"ל RPMI, להוסיף 50 מל FBS (10% FBS הסופי), 5 מ ל 100 × HPGP, 1 מ"ל 0.5 M MgCl2 (1 מ מ הסופי) ו 1 מ"ל 0.5 M CaCl2 (1 מ מ הסופי). הוסף collagenase, מסוג I (100 סופי U/mL). להכין את זה טרי לפני השימוש.
  7. דחיסות צבע (ג'י) פתרונות
    1. להכין 1 × DG פתרון מניות על ידי ערבוב פתרון מניות 90 מ ל די. ג'י (עיין טבלה של חומרים) עם 10 מ"ל של 10 × PBS. לשמור על סטריליות ב 4 º C.
    2. להכין פתרון די. ג'י 44% (8 מ ל/אישור IEL, 8 מ ל/LP) על ידי ערבוב 44 מ של פתרון מניות 1 × DG ו 56 mL RPMI 1640. להכין את זה טרי לפני השימוש.
    3. להכין פתרון די. ג'י 67% (5 מ ל/אישור IEL, 5 מ ל/LP) על ידי ערבוב 67 מ"ל של פתרון מניות 1 × DG ו- 33 mL RPMI 1640. להכין את זה טרי לפני השימוש.

2. בידוד של בלוטות לימפה Mesenteric, מעיים, ולא של Peyer טלאים

  1. המתת חסד העכבר באמצעות הרדמה פחמן דו-חמצני ונקע בצוואר הרחם משני. הנח את העכבר על גבו, לרסס עם 70% אתנול. להשתמש במספריים לעשות חתך קו האמצע, ופתח את העור, דופן הבטן לחשוף חלל הצפק.
  2. לאתר של caecum, להשתמש מלקחיים למשוך בעדינות את caecum למטה. להשתמש בזהירות. זוז ימינה, חשיפת הרשת MLN כולו, אשר מיושר עם המעי הגס המעי הדק מלקחיים.
    הערה: מפה של בלוטות לימפה mesenteric שרשרת וניקוז לימפטי של המעיים היה בעבר מתואר13.
  3. לזהות את הצומת התחתון של הרשת, ממוקם קרוב אל המעי. השתמש ערכה אחת של מלקחיים לאחוז השומן/מצע המעי סביבו ולהסיר בעדינות את השרשרת MLN מלמטה למעלה על-ידי tweezing את השומן סביב הצומת לימפה עם עוד זוג מלקחיים.
  4. הנח את השרשרת MLN על מגבת נייר לחלח עם מדיה הקציר. להסיר שומן/מצע המעי על ידי גלגול את השרשרת על המגדל נייר חליצה השומן עם שתי קבוצות של מלקחיים. מניחים את MLN בתקשורת קר הקציר עבור שלבים בידוד מאוחר יותר.
    הערה: טיפול ישיר (i) של הצמתים זו אינה מומלצת. במקום זאת, לאחוז השומן/מצע המעי סביבם. (ii) זה קריטי כדי להסיר כמה שיותר שומן/מצע המעי ככל האפשר כדי לשפר את יכולת הקיום תא
  5. חותכים המעי הדק מתחת את שריר הסוגר מולדת ומעל המעי באמצעות מספריים. המעי, צא מהחנייה באיטיות מ מעי אל התריסריון באמצעות ערכה אחת של מלקחיים תוך הסרת המצורפת מצע המעי/השומן באמצעות עוד זוג מלקחיים.
  6. במקום המעי על מגבת נייר לחלח עם מדיה הקציר, להקניט שומן/מצע המעי כל שנותר מחוץ עם שתי קבוצות של מלקחיים.
    הערה: (i) הקפד להסיר כמה שיותר שומן/מצע המעי ככל האפשר עבור תשואה אופטימלית התא ואת הכדאיות. (ii) לשמור את המעי לחלח לאורך כל זה, את הפעולות הבאות על-ידי החלת הקציר מדיה מעת לעת.
  7. לאסוף המדבקות של פייה על-ידי הסרתם מהמעי במספריים מעוגלים. להשתמש ויבתר היקף או זכוכית מגדלת במידת הצורך (למתחילים); התיקונים של פייה רוב צריך להיות גלוי לעין המיומנת. לאסוף המדבקות של פייה (אופייני) 5-11 המעי הדק. התיקונים של המקום Peyer בתקשורת קר הקציר עבור שלבים בידוד מאוחר יותר.
    הערה: של Peyer תיקונים קטנים, בעיקר סביב גבשושיות וזיזים הדקיקים שבדופן החיצוני מול הקו של מצע המעי המצורף.
  8. השתמש הצד השטוח של שקופית מלקחיים, בעדינות לכיוון מעי התריסריון לגרש את תוכן צואתי, ריר. אני חוזר פעם להסיר את רוב הליחה.
    הערה: הסרת לא שלם של ריר ניתן להקטין את הכדאיות תא, תשואות. ובכל זאת, יש להקפיד להחליק המעי בעדינות כדי למנוע בנוכחות אחר villi או פגיעה קרום המרתף.
  9. להשתמש במספריים בסדר עם קצה קהה על נקודה אחת, להוסיף הצד הקהה לתוך המעי, וחתך המעי longitudinally מן התריסריון אל מעי. רוחבית לחתוך המעי שנפתחו לחתיכות ~ 2-ס מ. מקם את החלקים במעיים צינור חרוטי 50-mL עם 25 מ ל מדיה קר הקציר עבור שלבים בידוד מאוחר יותר.
    הערה: לשמור את המספריים לחלח עם מדיה תסייע להם להחליק ללא מאמץ דרך המעי.

3. בידוד של לימפוציטים מן האתרים אינדוקטיבית

  1. לבודד לימפוציטים מ- MLN על-ידי בריא בעדינות דרך מסננת תא 70-מיקרומטר באמצעות הבוכנה של מזרק 3-mL. רחץ תא strainer עם 5 מ של קציר קר מדיה.
  2. צניפה MLN-תאים על-ידי צריך שתוציאו ב g × 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר תא בתקשורת הקציר קר 1 מ"ל. ספירת התאים קיימא באמצעות trypan blue הדרה.
    הערה: מאגר פירוק תאי הדם האדומים ניתן להסיר תאי דם אדומים אם הדימום אירעה במהלך ההסרה.
  3. לבודד לימפוציטים מ טלאים של פייה מאת המקננת טלאים של פייה 15-mL צינור חרוטי המכיל 5 מ"ל prewarmed collagenase פתרון 37 ° C ו- 220 סל"ד למשך 30 דקות.
  4. מערבולת 15 s בהגדרה המרבית ואת המסנן מתעכל רקמות, תגובת שיקוע לתוך צינור חרוטי 50-mL דרך מסננת תא 70-מיקרומטר. בעדינות מביצועם החלקים הנותרים רקמות באמצעות הבוכנה של מזרק 3-mL ולשטוף את מסננת תא 5 מ של קציר קר מדיה.
  5. גלולה תיקון התאים של פייה על ידי צריך שתוציאו ב g × 400 דקות 5-4 ° C, resuspend בגדר תא בתקשורת הקציר קר 1 מ"ל. ספירת התאים קיימא באמצעות trypan blue הדרה.
    הערה: Peyer של בידוד טלאים אולי יש לימפוציטים פרופריה. מוסקולריס מזהמים לימפוציטים intraepithelial הנרתיק.

4. בידוד של לימפוציטים intraepithelial הנרתיק של המעי הדק

  1. לשטוף את החלקים של המעי הדק שלוש פעמים עם 25 מ של קציר קר מדיה על ידי היפוך הצינור 10 פעמים, נותן את החלקים במעיים ליישב שנוטפת תגובת שיקוע.
    הערה: חתיכות רקמה להתפשר בקלות לתחתית של התחתית. אם הם לא, זה אינדיקציה כי מצע המעי/שמנה מדי נשאר צמוד או שהם קשורים בועת אוויר.
  2. להוסיף 20 מ של פתרון DTE prewarmed 50-mL צינור חרוטי המכילה חתיכות במעי ולהעביר ל 50-mL siliconized Erlenmeyer בקבוקון המכיל בר-מערבבים. מערבבים ב 37 מעלות צלזיוס ולהשתמש סל ד 220 על פגים במשך 20 דקות מגנט גדול מבחוץ + בקבוקי שתייה צידניות להחזיק את stir-בר ולהעביר את רקמת ואת הפתרון בחזרה אל הצינור חרוט 50-mL.
  3. מערבולת הצינור מקסימום הגדרת העברה ס' 10 את תגובת שיקוע לתוך צינור חרוטי 50-mL החדש דרך מסננת תא 70-מיקרומטר נזהר לשמור את חתיכות רקמה על הצינור המקורי. אל תמחק את תגובת שיקוע; תגובת שיקוע מכיל לימפוציטים intraepithelial הנרתיק. צניפה תאים על-ידי צריך שתוציאו ב g × 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר תא בתקשורת הקציר קר 10 מ"ל ולאחסן על קרח.
  4. להוסיף 20 מ של פתרון DTE prewarmed 50-mL צינור חרוטי המכילה חתיכות במעי ולהעביר חזרה ל 50-mL siliconized Erlenmeyer הבקבוק המכילה בר-מערבבים. מערבבים ב 37 מעלות צלזיוס ולהשתמש סל ד 220 על פגים במשך 20 דקות מגנט גדול מבחוץ + בקבוקי שתייה צידניות להחזיק את stir-בר ולהעביר את רקמת ואת הפתרון בחזרה אל הצינור חרוט 50-mL.
    הערה: DTE הוא סוכן צמצום המעשיר לימפוציטים intraepithelial הנרתיק.
  5. מערבולת הצינור מקסימום הגדרת העברה ס' 10 את תגובת שיקוע דרך מסננת תא 70-מיקרומטר לתוך הצינור הקודם המכיל תאים תגובת שיקוע של הטיפול DTE הראשון (מתוך שלב 4.3).
    הערה: מעיים החלקים הנותרים משמשים כדי לבודד לימפוציטים מ פרופריה. מוסקולריס. בקרת איכות: פיסת רקמה יכול להיות מוסר ובדק בהיסטולוגיה כדי להבטיח בתאי אפיתל נוכחים קרום המרתף לא נפגע.
  6. צניפה תאים על-ידי צריך שתוציאו את תגובת שיקוע ב g × 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר תא ב 8 מ של 44% פתרון די. ג'י בטמפרטורת החדר (RT).
  7. העברה מ ל 8 44% DG פתרון תא ההשעיה לתוך ø 17 מ"מ x 100 בסגנון מ מ 14-mL צינור עגול-התחתון פוליפרופילן. ביסוד 5 מ של RT 67% DG פתרון. צנטריפוגה ב 1600 × g למשך 20 דקות ב RT ללא שימוש בבלמים.
    הערה: ייתכן pretreated צינורות עם סרום שור כדי למנוע תאים נדבקות הקירות שפופרת.
  8. שימו לב כי התאים קיימא להקים להקה (באפי המעיל)-הממשק 44% 67%, תאים מתים כמה תאי האפיתל הם בסרט mucoid בחלק העליון של מעבר הצבע, כדוריות דם אדומות הם בגדר. להסיר את השכבה העליונה של המילוי ההדרגתי אל תוך ~ 2 ס מ של הממשק על ידי השאיפה ואקום. השתמש פיפטה פסטר כדי לקצור את המעיל באפי-הממשק ומעבירים אותם אל צינור חרוטי 50-mL המכיל 40 מ"ל הקציר קר מדיה.
  9. צניפה תאים על-ידי צריך שתוציאו ב g × 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר תא בתקשורת הקציר קר 1 מ"ל. ספירת התאים קיימא באמצעות trypan blue הדרה.

5. בידוד של לימפוציטים פרופריה. מוסקולריס מן המעי הדק

  1. להסיר תאים אפיתל רקמת המעי חתיכות על-ידי הוספת 25 מ של פתרון EDTA prewarmed הבקבוקון המכיל את החלקים הנותרים מעיים. מערבבים את הבקבוק ב 37 ° C ו סל ד 220 על פגים במשך 30 דקות להשתמש מגנט גדול מבחוץ + בקבוקי שתייה צידניות כדי להחזיק את stir-בר ולמחוק את תגובת שיקוע בקפידה תוך שמירה על חתיכות מעיים בתוך הבקבוק.
    הערה: (i) EDTA היא chelator סידן מטרות סידן תלוית צמתי ומקדם הניתוק של תאי אפיתל המעי. (ii תגובת שיקוע) צריך להיות מעונן, עשוי לשמש כדי לבודד את חברת החשמל אם רצוי באוסף שלהם.
  2. חזור על שלב 5.1.
    הערה: תגובת שיקוע צריך להיות פחות מעונן בעקבות זה הדגירה. בקרת איכות: פיסת רקמה יכול להיות מוסר ובדק בהיסטולוגיה כדי להבטיח בתאי אפיתל המעי הוסרו קרום המרתף לא נפגע. מדגם תגובת שיקוע, גם יכול להיות מוערך על ידי cytometry זרימה כדי לאשר את לויקוציטים (CD45+ תאים) נעדרים.
  3. להוסיף 50 מ של RT הקציר מדיה הבקבוקון. מערבבים בקצרה עם מגנט. תנו חתיכות מעיים ליישב ולמחוק בקפידה את תגובת שיקוע.
    הערה: שלב זה מבטיח את ההסרה של EDTA לפני collagenase עיכול כמו EDTA חלבונית collagenase על ידי chelating הסידן שהוא קריטי לתפקוד collagenase.
  4. להוסיף 30 מ של פתרון prewarmed collagenase הבקבוקון ומערבבים חתיכות מעיים 37 ° C ו סל ד 220 על פגים למשך 45 דקות.
  5. העברת רקמות מתעכל ואת תגובת שיקוע צינור חרוטי 50-mL על-ידי סינון דרך מסננת תא 70-מיקרומטר. בעדינות מביצועם הנותרים חתיכות רקמה באמצעות הבוכנה של מזרק 3-מ ל מחית דרך המסנן. לשטוף את המסנן עם 10 מ"ל של קציר קר מדיה.
  6. צניפה תאים על-ידי צריך שתוציאו ב g × 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר תא ב 8 מ של טמפרטורת הסביבה 44% DG פתרון.
  7. העברה מ ל 8 44% DG פתרון תא ההשעיה לתוך ø 17 מ"מ x 100 בסגנון מ מ 14-mL צינור עגול-התחתון פוליפרופילן. ביסוד 5 מ של טמפרטורת הסביבה 67% DG פתרון. Centrifuge את מעברי צבע בטמפרטורת החדר ו g × 1600 עבור 20 דקות עם בלי בלמים.
  8. להסיר את שכבת השומן למעלה על ידי השאיפה ואקום. השתמש פיפטה פסטר לקצור את המעיל באפי ממשק, העברת צינור חרוטי 50-mL המכיל 40 מ"ל הקציר קר מדיה.
  9. צניפה תאים על-ידי צריך שתוציאו ב g × 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר תא בתקשורת הקציר קר 1 מ"ל. ספירת התאים קיימא באמצעות trypan blue הדרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מתואר (איור 1). לימפוציטים בתוך mucosa מעיים אינדוקטיבית, אתרי אפקטור מאורגנים במובהק. Peyer של ותיקונים (PP) בלוטות לימפה mesenteric (MLN) מכילים לימפוציטים מאורגן היטב באזורים תא T, B-cell זקיקים, ואילו האפיתל במעי כוללת לימפוציטים המופצים יותר diffusely. פרופריה. מוסקולריס (LP) מכיל הן לימפוציטים diffusely מבוזרת והן לימפוציטים הכלול בתוך מבנים הלימפה מאורגן כמו זקיקי הלימפה מבודד (איי) ו- cryptopatches. כל תא החיסון מעיים מאופיין ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מפורט מוצג עבור הבידוד של לימפוציטים מן המעי הרירית אינדוקטיביים (MLN ו- PP) ואתרים אפקטור (LP ו אישור IEL תא). הפרוטוקול פותח כדי לאזן הקלט (זמן) והפלט (הכדאיות ואת התשואה) להגדיל את הפרודוקטיביות ואת תוצאות. הפרוטוקול מבטיח גם זיהום compartmental לחצות מינימלי בין תאים LP ו אישור IEL.

מספר פרוטוקולים עבור הבידוד של תאים חיסוניים מן המעי הדק העכבר היה שפורסמו3,4,5,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.S.S. נתמך על ידי מענק-NIH (R01 AI076457) וקרנות הניתנים על ידי האוניברסיטה בסטוני ברוק. Z.Q. נתמך על-ידי NIH הענק (K12 GM102778).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
HEPESFisher ScientificBP310-500
L-גלוטמין סיגמא-אולדריץ'G3126-100G
פניצילין-סטרפטומיציןטכנולוגיות חיים15140-122
GentamicinLife Technologies15710-072
נתרן הידרוקסידפישר סיינטיפיקS318-500
RPMI 1640Life Technologies21870-076
נתרן ביקרבונטפישר סיינטיפיקS233-500
סרום בקר עובריLife Technologies26140-079
תמיסת מלח מאוזנת 10x של הנקססיגמא-אולדריץH4641-500ML
1,4-דיתיואריתריטולסיגמא-אולדריץ'D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575-020
קלסיום כלוריד הקסהידראטסיגמא-אולדריץ'21108-500G
מגנזיום כלוריד הקסהידרטסיגמא-אולדריץ'M2670-100G
קולגנאז, Type ILife Technologies17100-017
תמיסת מלאי שיפוע DG (פרקול) GE Healthcare17-0891-01
מאגר ליזה של תאי דם אדומיםBiolegend420301
70-µ מסננת תאים M קורנינג352350
14 מ"ל פוליפרופילן צינור תחתון עגול352059
בקבוק Erlenmeyer Kimble26500R-50mL
מערבל מגנטיתרמו פישר50094596
לערבב ברפישר סיינטיפיק14-512-148
'

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
  2. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
  3. Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19(2001).
  4. Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19(2012).
  5. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  6. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
  7. Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
  8. Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
  9. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
  10. Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
  11. Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
  12. Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
  13. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  14. Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
  15. Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
  16. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Peyer PatchesLamina Propria

מאמרים קשורים