פרוטוקול זה מתאר שיטה photoconversion של חלבון פלואורסצנטי קאךה בתאים endocardial של החיים העובר דג זברה המאפשרת המעקב של תאים endocardial במהלך תעלת atrioventricular ופיתוח שסתום הלב atrioventricular .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
במהלך מופרה, התאים עוברים שינויים דינמיים בהתנהגות התא, פיענוח הסלולר ההיגיון מאחורי שינויים אלה היא מטרה היסוד בתחום ביולוגיה התפתחותית. בגילוי ופיתוח של חלבונים photoconvertible במידה רבה כאילו סייע ההבנה שלנו של שינויים דינמיים אלה על-ידי מתן שיטה לסימון שטיחות תאים ורקמות. עם זאת, בעוד photoconversion, מיקרוסקופיה זמן לשגות, ניתוח תמונות עוקבות הוכיחו להיות מאוד מוצלח שיגורי דינמיקה סלולר באיברים כמו המוח או את העין, גישה זו משמשת בדרך כלל לא בלב המתפתח עקב לאתגרים שמציב את התנועה המהירה של הלב במהלך מחזור הלב. פרוטוקול זה מורכב משני חלקים. החלק הראשון מתאר שיטה photoconverting ומעקב לאחר מכן תאים endocardial (והריון) במהלך דג זברה תעלת atrioventricular (AVC) ופיתוח שסתום הלב atrioventricular. השיטה כוללת חנותם עוצר את הלב עם סמים על מנת photoconversion מדויק להתקיים. לבבות מותר לחדש את המכות על הסרת התרופה ואת התפתחות נמשכת בדרך כלל עד הלב הוא נעצר שוב עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של photoconverted והריון בשלב מאוחר יותר זמן התפתחותית. החלק השני של הפרוטוקול מתאר שיטת ניתוח התמונה כדי לכמת את האורך של אזור photoconverted או אי-photoconverted AVC ב צעירים העוברים על-ידי מיפוי האות פלורסנט מתוך מבנה תלת-ממדי על גבי מפה דו-ממדית . יחד, שני חלקי הפרוטוקול מאפשר לבחון את מקור וההתנהגות של תאים המרכיבים את דג זברה AVC ואת מסתמי הלב atrioventricular ולאחר פוטנציאלי יכול להיות מיושם עבור לומד מוטציות, morphants או עוברי שטופלו עם ריאגנטים לשבש את התפתחות AVC ו/או שסתום.
מבוא
דג זברה נחשב כיום לאחד הדגמים חוליות החשוב ביותר ללמוד הסלולר תהליכים התפתחותיים ויוו. זה נובע במידה רבה שקיפות אופטית של דג זברה ולקודדו amenability על גנטיקה, מה שהופך אותו במודל רב עוצמה על יישום טכניקות אופטי מעורבים גנטית photoresponsive חלבון טכנולוגיות1. ספציפיים בחקר התפתחות הלב, דג זברה מקבלים מספיק חמצן באמצעות דיפוזיה כזה כי מוטציות אפילו ללא דופק יכולים לשרוד עד השבוע הראשון של פיתוח, התרת ניתוחים על ההשפעות של גנים התפתחותית, מודאג זרימת הדם על הלב מורפוגנזה לא אפשרי חולייתנים רוב2.
הצינור הלב דג זברה נוצר על ידי הפריה פוסט 24 שעות (hpf). זמן קצר לאחר הקמתו, הצינור הלב מת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת תבניות והרכבה agarose
- צור תבנית עם מידות איור 1 באמצעות מדפסת תלת-ממד או כלים מסורתיים וטכני.
- פיפטה בערך 1.5 מ של agarose 1% מומסת לתוך תבשיל הרכבה פלסטיק 35 מ מ. מקום כייר פלסטיק agarose נוזלי, מקפיד להימנע השמנה אוויר בין כייר את agarose. מקם את המנה ב 4 ° C, חכה עד agarose מתקשה (זה לוקח בערך 5 דקות) ולאחר מכן להסיר את כייר פלסטיק.
- כדי לאחסן את המנה הרכבה לשימוש מאוחר יותר, מכסים את המכסה שלה, ואז לעטוף את המנה וגם את המכסה בצורה הדוקה עם מצלמות-מיקרוסקופים. לאחר מכן ניתן לאחסן את המנה הרכבה המכסה פונה כלפי מטה עד 5 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס.
- להכין מראש 1 מ"ל aliquots כ- 0.7% agarose נקודת ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
דוגמא photoconverted העובר ב 48 hpf, עם תמונה שוב 80 hpf מוצג באיור 2, סרטים 1 ו- 2. חשיפת קאךה 405 ננומטר לאור בלתי הפיך ממיר מ החלבון שלו בטופס ירוק ניאון לטופס אדום פלואורסצנטי, המאפשר את אופן הפעולה של תאים עם הירוק או את הטופס אדום שלהם להיות בעקבות עם תוויות הכבוד שלהם באופן שונה בצבע השכנים במהלך היווצרות שסתום. ניתן לראות כי מספר תאי photoconverted AVC hpf 48 התרבו מאוחר יותר, לאחר מכן התגורר בעיקר בצד אחד של העלעל שס.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
העיתוי של photoconversion: קאךה למרות נשאר במאור פנים מתבטאות והריון אפילו ב 96 hpf, יצוין כי ככל שהעובר גדל, אור לייזר מפזרת עוד לפני שהוא מגיע את AVC, יצירת photoconversion מוגבלת של קאךה קשה יותר. At עובריים שלבים מאוחר יותר 55 hpf, שהתנפח של הנוזלים, האטריום גם אומר כי קרן לייזר סגול משמש photoconversion לא יכול להגיע AVC תאים ללא הראשון העוברים דרך אטריום או החדר. משמעות הדבר מעבר 55 hpf, על מנת photoconvert והריון של AVC, אדם חייב גם photoconvert והריון נוסף אטריום, החדר.
BD.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד אינטרסים הכריז.
תודות
ברצוננו להודות Duchemin הולץ, דניס Duchemin, נטלי Faggianelli, באזיל Gurchenkov שעזרת לתכנן ולבצע כייר שמתואר פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי עקרות (DEQ20140329553), את ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), התוכנית של חוקר צעיר EMBO, הקהילה האירופית, ERC קוג N ° 682938 Evalve ומנוהל על ידי המענק ANR-10-LABX-0030-INRT, קרן צרפתית המדינה על ידי סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש תחת d'Avenir Investissements תוכנית מסגרת בתווית ANR-10-IDEX-0002-02.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומרים | |||
| ציוד הכרחי לגידול דגים ואיסוף ביצים (ראה ספר דג הזברה 22 לפרטים). | |||
| סטריאומיקרוסקופ מיקרוסקופ | |||
| קונפוקלי זקוף (מצויד בלייזרים הפועלים ב-488 ננומטר, 561 ננומטר ו-405 ננומטר, לייזר מולטיפוטון מתכוונן, ו-Leica HCX IRAPO L, 25 & times;, NA 0.95 אובייקטיבי) | Leica | Leica SP8 | |
| בלוק חום | ThermoScientific | 88870001 | |
| צלחת תרבית רקמות 35 מ"מ x 10 מ"מ | Falcon | 353001 | |
| צלחת 6 באר | פלקון | 353046 | |
| צלחת | |||
| מלקחיים | |||
| פיפטה | |||
| עובש | |||
| <חזק>ריאגנטים | |||
| 8 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי טריקאין | |||
| 1 M BDM פתרון | |||
| UltraPure נקודת התכה נמוכה agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| עובר בינוני: 30x תמיסת | |||
| תוכנה | |||
| Matlab מצויד בארגזי הכלים של ניתוח תמונה, התאמת עקומה, ביו-פורמטים | MathWorks | ||
| <חזק>8 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי טריקאין | |||
| 200 מ"ג של אבקת טריקאין (חומצה אתיל 3-אמינובנזואט מתאן-סולפונית) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 מ"ל Danieau | |||
| יש להתאים ל-pH 7, לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C | |||
| <חזק>1 מיליון תמיסת מלאי BDM | |||
| 1 גרם BDM | סיגמא-אולדריץ' | 112135 | |
| 10 מ"ל ddH2O | |||
| Aliquot ולאחסן ב-20 מעלות; C | |||
| <חזק>מדיום עוברי: תמיסת מלאי 30x | |||
| 50.7 גרם NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 גרם KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 גרם מגנזיום גופרתי | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 גרם סידן ניטריט טטרה-הידראט | סיגמא-אולדריץ' | 13477-34-4 | |
| 19.52 גרם HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-חומצה סולפונית) | סיגמא-אולדריץ' | 7365-45-9 | |
| התאם ל-pH 7.2 ואחסן בטמפרטורת | |||
| <חזק>עובש | |||
| שרף | PlasCLEARאסיגה | ||
| פלוס 39 מדפסת תלת מימד Freeform Pico | Asiga |
מקורות
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essenti....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
