Method Article

שיטת ואיכותני ספינגומיילין מאת LC-MS באמצעות שני אורווה Isotopically שכותרתו מינים ספינגומיילין

DOI:

10.3791/57293

⸱

May 7th, 2018

 ,  , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים בפרוטוקול כדי לכמת ויגדיר לכל מין ספינגומיילין באמצעות ניטור התגובה מרובים ומצב MS/MS/MS, בהתאמה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטה של ניתוח ספינגומיילין (SM) איכותית, באופן כמותי באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (LC-ESI-MS/MS). SM הוא ספינגוליפיד משותף מורכב של phosphorylcholine של ceramide כרכיב הידרופיליות, הידרופוביות, בהתאמה. מספר מינים SM נמצאים בתאי יונקים בשל מגוון רחב של sphingoid ארוך רשת בסיס (LCB) N-moiety ליפיד ב- ceramide. בדו ח זה, אנו מציגים שיטה להערכת המספר של פחמן קשרים כפולים LCB, N-moiety ליפיד המבוסס על יונים המוצר המקביל שלהם בניסויים MS/MS/MS (MS3). בנוסף, אנו מציגים שיטת ניתוח כמותי ס באמצעות שני יציב isotopically שכותרתו SM מינים, אשר מקלה על קביעת הטווח בשימוש SM כימות. השיטה הנוכחית יהיה מועיל באפיון מגוון מינים SM דגימות ביולוגיות ומוצרים תעשייתיים כגון מוצרי קוסמטיקה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספינגומיילין (SM) הוא ספינגוליפיד נפוצות בתאים בתרבית. SM היא מסונתז intracellularly1 ומתנת כמבשר sphingolipids אחרים כגון sphingosine-1-פוספט ו- ceramide של, אשר יש תפקיד מכריע החיסון תא סחר ועור מכשול הומאוסטזיס, בהתאמה2, 3. לפיכך, ניתוח מדויק של החומרים SM חשוב שחקרתי את התפקידים פיזיולוגיים ופתולוגיים של sphingolipids.

SM מורכבת של ceramide phosphorylcholine מקושרת קבוצת ceramide, אשר מורכב עוד יותר sphingosine Nהידרוקסי 1-acyl השומן moiety. מגוון את המספרים פחמן, הקשר הכפול הן sphingosine והן N-moiety ליפיד מתבטא המין מספר ceramide (SM....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להתייעץ עם כל גליונות נתונים גשמי בטיחות (MSDS) לפני השימוש. ללבוש כפפות כדי לצמצם זיהום הדגימה מאת SM נגזר העור. בפרוטוקול הנוכחי היה המוחלים על תאים הלה גדל בינוני חיוני המינימלי של נשר, בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 2 מ מ L-גלוטמין 1000 פניצילין U/L, סטרפטומיצין 100 מ ג/ליטר.

1. הכנת דוגמאות השומנים

הערה: חשוב כי כל כלי זכוכית כולל מבחנות עם מצופה טפלון מזרקי להיות ללא חומרי ניקוי.

  1. מיצוי של השומנים הכולל שבר מ תא homogenate באמצעות את בליי & דייר שיטה7
    1. הסר את התרבות (או ממוזגים) מדיה מן המנה תרביות רקמה ס מ-10 יש לשטוף פעמיים עם 6 מ של PBS קר כקרח.
      2. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מסונתז כימית d18:1 / 24:0 SM (איור 1א') ו- d18:1 / 24:0 SM בדגימות השומנים שחולצו מן התאים הלה (איור 1B) נותחו על ידי LC-ESI-MS3 העסקת [M + HCOO]– [M-CH3]- כמו יונים קודמן הראשון והשני, בהתאמה. שים לב האינטנסיביות ספקטרום של demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (מ/z 449) הוא גדול מזה של SM N-moiety ליפיד (מ/z 378). ב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשיטה איכותית נוכח, השגנו MS3 המוצר יונים SPC, N-moiety ליפיד. זה קריטי להקצות כראוי SPC והן N-acyl השומן moiety. לשם כך, יצוין כי מולקולות אחרות המכילות phosphorylcholine ניתן לזהות גם כמו MS3 המוצר יונים. פלסמלוגן-PC ו- Diacyl-phosphatidylcholine (PC) נמצאים בשפע בתרבית של תאים, hydrophobicity שלהם דומה לזה של SM. לכן, diacyl-PC ופלסמלוגן-PC עם איזוטופ (בדרך כלל 13ג) יכול תיאורטית יזוהו בו זמנית עם מפקד חיל האוויר. בניסויים שלנו, היונים מוצר3 MS של פלסמלוגן-.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של משרד החינוך, תרבות, ספורט, המדע, הטכנולוגיה של יפן (KAKENHI) כדי בעדותה (#15 K 01691), שפורחים (#15 K 08625), K.Y. (#26461532), מענק לצורך המחקר של פרוייקט סורר המחלה של משרד בריאות, העבודה והרווחה (K.Y. #201510032A). אנו מודים קבוצת Edanz (www.edanzediting.com/ac) על עריכת טיוטה של כתב היד הזה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSThermoFisher10010023
צלחת תרבית רקמות 100 מ"מIWAKI3020-100
מגרד תאיםIWAKI9000-220
צינור סיליקון 2.0 מ"לפישר סיינטיפיק02-681-321
מבחנהIWAKITST SCR 16-100
מכסה בורג מרופד טפלוןIWAKI9998CAP415-15
צינור זכוכית חד פעמיIWAKI9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 ומיקרו; m 1.5 מ"מ מזהה x 100 מ"מShiseido92223מחסנית Guard מוכנסת למחזיק המחסנית, ומקושרת לעמודת C18
CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 מ"מ x 10 מ"מ GUARD CARTRIDGEShiseido12197
מחזיק מחסניתShiseido12415
אצטוניטרילWako018-19853
2-פרופנול (איזופרופיל אלכוהול)Wako161-09163
מתנולWako134-14523
חומצה פורמיתWako066-00466
28% מי אמוניהWako016-03146
Sonicator (סוג אמבטיה)SHARPUT-206H
מערבל מערבולת למבחנה מזכוכיתTAITECMix-EVR
1.4 מ"ל בקבוקון זכוכיתTomsic500-1982הדגימות מאוחסנות בבקבוקון זכוכית של 1.4 מ"ל אטום עם מכסה בורג ומחיצה של 8 מ"מ ב-20° C
8 מ"מ מחיצהTomsic200-3322כאשר מנתחים דגימות, מכסי הברגים מוחלפים במכסי בורג עם מחיצת חריץ
מכסה בורג לבקבוקון זכוכית 1.4 מ"מTomsic500-2762
מכסה בורג עם מחיצת חריץShimadzu GLCGLCTV-803
PVDF 0.22 & מיקרו; m filterMilliporeSLGVR04NL
ספקטרומטריית מסה משולשת של מלכודת יונים ליניארית מרובעת ומרובעתSCIEXQTRAP4500
התוכנה לרכישת נתונים וניתוח ספקטרום יונים של מוצרSCIEXאנליסט
התוכנה לשילוב נתונים בניתוח כמותימערכת SCIEXMultiQuant
HPLCShimadzuבקבוק זכוכית Nexera
Sansyo85-0002
d18:1/24:0 sphingomyelinAvanti Polar Lipids860592P
SphingosylphosphorylcholineMerck567735
סרום בקר עובריThermoFisher 
L-גלוטמיןThermoFisher 
פניצילין וסטרפטומיציןסיגמאP4333
Eagle' מדיום חיוני מינימליסיגמאM4655
2614007925030081

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
  2. Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
  3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sphingomyelin AnalysisLC MS MS MethodStable Isotope LabelingLipid ExtractionMobile Phase PreparationTriple Quadrupole MSProduct Ion SpectraStandard Curve ConstructionHeLa Cell SamplesCosmetic Lipid Characterization

Related Articles