Method Article

בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין

DOI:

10.3791/57311

⸱

June 9th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Molecular Neurogenetics, German Cancer Research Center (DKFZ), DKFZ-ZMBH Alliance, 2Division of Molecular Genetics, German Cancer Research Center (DKFZ), and German Cancer Consortium (DKTK), 3Hopp-Children's Cancer Center at the NCT Heidelberg (KiTZ), 4Division of Pediatric Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), and German Cancer Consortium (DKTK), 5Department of Pediatric Hematology and Oncology, Heidelberg University Hospital

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים אובדן-של-הפונקציה המקובלת של גנים באמצעות ההסתרה חיות לעתים קרובות היו יקרים ולגזול. מבוסס-אלקטרופורציה בתיווך CRISPR סומאטית מוטגנזה מכוונת הוא כלי רב עוצמה כדי להבין ג'ין פונקציות בתוך vivo. כאן, אנחנו מדווחים על שיטה לנתח נוקאאוט פנוטיפים מתרבים תאים של הצרבלום.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מום מוחי לעיתים קרובות נגרמת על ידי מוטציות גנטיות. פיענוח מוטציות ברקמות נגזר החולה זיהה פוטנציאל הגורמים הסיבתיים של המחלות. כדי לאמת את התרומה של תפקוד של גנים שעברו מוטציה להתפתחות המחלה, הדור של מודלים נשיאת מוטציות היא הגישה ברור אחד. בעוד מהונדסים גנטית germline העכבר מודלים (GEMMs) הם כלים ביולוגי פופולרי ולהציג תוצאות לשחזור, הוא מוגבל על-ידי זמן ועלויות. בינתיים, שאינם germline GEMMs לעיתים קרובות להפעיל פונקציה ג'ין לחקר באופן יותר ריאלי. מאז כמה המוח מחלות (למשל, גידולים במוח) מופיעים כתוצאה סומאטית אך לא germline מוטציות, שאינם germline chimeric העכבר מודלים, שבו תאים תקינה ולא תקינה לדור בכפיפה אחת, יכול להיות מועיל עבור ניתוח מחלות רלוונטיות. במחקר זה, אנו מדווחים על שיטה אינדוקציה של מוטציות סומאטית בתיווך CRISPR המוח הקטן. באופן ספציפי, אנחנו מנוצל מותנה בטוק עכברים, שבו Cas9 ו- GFP כרוני מופעלים על ידי האמרגן חטיבתי (CMV משפר/עוף ß-אקטין) לאחר Cre-מתווכת רקומבינציה של הגנום. בעיצוב עצמי יחיד-מדריך RNAs (sgRNAs) ואת הרצף recombinase Cre, שניהם המקודדת בונה פלסמיד יחיד, נשלחו לתוך גזע אסטרוציטומה/ובתאים בשלב העוברי באמצעות אלקטרופורציה בתוך הרחם . כתוצאה מכך, תאים transfected ותאי הבת שלהם הודבקו תוויות עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), למוצא פנוטיפי ניתוחים נוספים. ומכאן, שיטה זו היא לא רק מציג המסירה הגן מבוססת-אלקטרופורציה לתוך תאים עובריים אסטרוציטומה אלא גם מציע גישה כמותית מוזרה להעריך בתיווך CRISPR פנוטיפים אובדן-של-פונקציה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוח המחלות הן אחת ממחלות איומות ביותר בן תמותה. הם לעתים קרובות תוצאה של מוטציות גנטיות, dysregulation עוקבות. כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של מחלות המוח, נצחית מאמצים כדי לפענח את הגנום של בני אדם חולים גילו מספר גנים סיבתי פוטנציאליים. עד כה, חייתיים germline מהונדסים גנטית כבר נעזרו ויוו רווח-של-פונקציה (GOF) וניתוחים אובדן-של-פונקציה (LOF) של גנים כאלה המועמד. עקב התפתחות מואצת של לימודי אימות פונקציונלי, רצוי ריאלי וגמישה יותר ויוו ג'ין assay מערכת לימוד ג'ין פונקציה.

היישום של מערכת העברת גנים מבוססת-אלקטרופורציה ויוו למוח המתפתח העכבר מתאים למטרה זו. למעשה, מספר מחקרים באמצעות בתוך הרחם אלקטרופורציה הראו את הפוטנציאל שלהם לערוך ניתוחים פונקציונליים לפיתוח המוח1,2,3. למעשה, במספר אזורים במוח העכבר, כגון קליפת המוח4, רשתית העין5, diencephalon6, hindbrain7, מוח מאורך8וכן השדרה9 סומנו על ידי המסירה הגן סומאטית . מתקרב, עד כה.

אכן, ביטוי גנים ארעי על-ידי ויוו אלקטרופורציה על מוח העכבר מתחלקים שימש זמן לניתוח GOF. טכנולוגיות מבוססות transposon אינטגרציה הגנומי האחרונות נוסף זמין לטווח ארוך ו/או תנאי ביטוי של גנים של ריבית10,11, אשר מהווה יתרון לנתח ג'ין פונקציה בצורה מרחבית טמפורלית במהלך פיתוח. בניגוד GOF ניתוח, ניתוח LOF כבר יותר מאתגר. בזמן ארעי תרביות תאים של siRNAs, נושא shRNA פלסמידים בוצעה, השפעות ארוכות טווח של LOF של גנים לא מובטח בשל ההשפלה בסופו של דבר exogenously הציג חומצות גרעין, כגון פלסמידים ו- dsRNAs. עם זאת, הטכנולוגיה CRISPR/רשויות אישורים מספק של פריצת דרך LOF בניתוח. גנים קידוד חלבונים פלורסנט (למשל, ה-GFP) או חלבונים מייצרים אור (למשל, גחלילית לוציפראז) יש כבר transfected במשותף עם CRISPR-Cas9 sgRNAs כדי לסמן את התאים חשופים CRISPR Cas9-בתיווך מוטציות סומאטית. יחד עם זאת, גישה זו אולי יש מגבלות במחקרים פונקציונלי על תאים מתרבים מאז סמן אקסוגני גנים מדולל והשפילו לאחר התפשטות לטווח ארוך. בעוד התאים transfected ותאי הבת שלהם לעבור מוטציות CRISPR-induced הגנום שלהם, טביעות הרגליים שלהם אולי תלך לאיבוד לאורך זמן. לפיכך, גישות תיוג גנטי יהיה מתאים להתגבר על בעיה זו.

לאחרונה פיתחנו שיטה המבוססת על CRISPR LOF בתאים גרגר אסטרוציטומה עוברים התפשטות לטווח ארוך במהלך שלהם בידול12. להוספת תווית גנטית התאים transfected, אנו נבנה על פלסמיד נושא של sgRNA יחד עם Cre , מוחדרים פלסמיד את cerebella של עכברים Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP13 באמצעות אלקטרופורציה בתוך הרחם . בניגוד וקטורים פלסמיד רגיל קידוד EGFP, גישה זו בהצלחה עם התווית גרגר transfected נוירון מבשרי (GNPs) ותאי הבת שלהם. שיטה זו מספקת תמיכה גדולה בהבנת ויוו התפקוד של הגנים של עניין מתרבים תאים המוח נורמלי ופיתוח רקע הגידול נוטה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים נערכו לפי תקנות רווחת בעלי חיים, אושרו על ידי רשויות אחראי (Regierungspräsidium קרלסרוהה, אישור מספרים: G90/13 G176/13, G32/14, G48/14, G133/14).

1. ליצור pU6-sgRNA-Cbh-Cre פלסמידים

  1. לעצב את sgRNA למטרה ג'ין-של-עניין על פי פרוטוקול שפורסמו בעבר14.
    הערה: בניסוי זה, שני sgRNAs נועדו לכוון את הגן Top2b עכבר ו- sgRNA של שליטה שאינן ממוקדות (טבלה 1). כדי gene (s) נוקאאוט בטכנולוגיה CRISPR, sgRNAs צריך להיות מתוכנן כדי למקד את רצף קידוד של אזור 5' או תחום פונקציונלי חיוני של החלבון. אחד נקודת מוצא נוחה היא לבחון רצפים sgRNA מעוצב מראש זמין לציבור, כמו השממית v2 העכבר נוקאאוט בריכה ספריית15 מהמעבדה ג'אנג. לחלופין, sgRNAs יכול להיות מעוצב באמצעות ציבורי זמינים תוכנה כגון באתר האינטרנט הבא: crispr.mit.edu.
  2. לשכפל את sgRNAs לתוך וקטור pU6-sgRNA-Cbh-Cre.
    הערה: pU6-sgRNA-Cbh-Cre וקטור12 השתמשו במחקר זה נגזר מן ה פלסמיד מקוריים pX33016 על-ידי החלפת את רצף קידוד של SpCas9 recombinase Cre .
    1. לסנתז את שני ה-DNA oligos כדלקמן. תחושה: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3 אינץ '; Antisense: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
      הערה: ה-20 N הראתה מעל דוכן העדים את הרצף sgRNA.
    2. לעכל pU6-sgRNA-Cbh-Cre עם BbsI למשך 30 דקות ב 37 ° C בעזרת ריאגנטים הבאים את לטעון את הדגימה מתעכל כדי 1% agarose ג'ל, לטהר אותם באמצעות ערכת ג'ל-חילוץ. השתמש פלסמיד µg 3; 3 µL Bbs; 1 µL FastAP; µL 5 10 X עיכול המאגר; הוסף ddH2O כדי להביא את הנפח הכולל 50 µL.
    3. Phosphorylate ו anneal כל זוג oligos sgRNA שימוש של ריאגנטים הבאים (10 הנפח הכולל µL): 1 µL מותאם אישית חוש oligo (100 מ מ); 1 µL אישית antisense oligo (100 מ מ); 1 µL 10 X T4 מצדו המאגר; 6.5 µL ddH2O; 0.5 ΜL T4 PNK. דגירה של התרמו-הצנטרפוגה למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, ו 5 דקות ב 95 ° C, ולאחר מכן כבש עד 25 ° C-5 ° C/min.
    4. להגדיר את התגובה הבאה מצדו ולאחר תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר (10 הנפח הכולל µL): X µL Bbsעיכלתי פלסמיד (50 ng); 1 µL phosphorylated ו annealed, oligo דופלקס (דילול 1:200); 5 µL 2 X המאגר מצדו; X µL ddH2O; 1 µL מהירה ליגאז.
    5. להוסיף 2 µL של המוצר מצדו µL 50 של תאים DH5α Escherichia coli כשיר מבחינה כימית. לאחר 30 דקות של דגירה על קרח, חום לזעזע את הדגימה עבור 90 s-42 ° C, דגירה למשך 2 דקות על קרח. להוסיף 100 µL ליברות בינוני, צלחת אותו לצלחת LB המכיל אמפיצילין µg/mL 100.
      הערה: השילוב של הרצף sgRNA לתוך פלסמיד pU6-sgRNA-Cbh-Cre מבוצע על-פי השלבים שיבוט פלסמיד pX33014.
    6. לחסן שתי מושבות, שכל אחת ב- 2 מ ל LB בינוני ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 6 שעות, ולבצע בידוד ה-DNA של הכנה מיני באמצעות ערכת.
    7. סאנגר רצף ה-DNA הכנה מיני באמצעות פריימר hU6-קדימה את וזהה מושבות עם הכניסה הנכון של sgRNAs על ידי יישור עם הרצף המוצגים בשלב 1.2.1. הרצף פריימר מוצג בטבלה 1. פלסמידים השתמשו במחקר זה היו בשם pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre ו- pU6-sgControl-Cbh-Cre.
    8. לחסן את המושבות מזוהים כראוי, לטהר את נטולת אנדוטוקסין פלסמיד DNA בתוך הרחם אלקטרופורציה באמצעות ערכת, למשל, מ- Qiagen. Elute ה-DNA עם נטול אנדוטוקסין טה-מאגר מדולל ב- ddH2O ב- 1:10 (10% טה מאגר). ריכוז הדנ א פלסמיד צריך להיות גבוה יותר מאשר 2 מ"ג/מ"ל.
      הערה: אין להשתמש ערכת מקסי-הכנה רגילים להכנה הדנ א. לאחסן פלסמיד-פתרונות ב 4 ° C עבור שימוש קבוע לטווח קצר (עד 4 שבועות), או aliquot אמצעי אחסון המתאים של µL כ-25 ולשמור ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.

2. לבחון את היעילות של sgRNAs באמצעות מערכת פלסמיד EGxxFP

הערה: היעילות של sgRNAs כלל נבדק על ידי מודד או T7E1 (T7 endonuclease אני) מבחני. ב פרוטוקול זה, משמש גישה חלופית קל ויעיל. המפתח של גישה זו היא להשתמש את פלסמיד pCAG-EGxxFP אשר מכיל קטעים EGFP חופפים המופרדות על-ידי רצף ה-DNA המכיל את sgRNA מיקוד באתר17. על הביטוי של pCAG-EGxxFP יחד עם sgRNA ו Cas9 בתאים transfected, מעבר בתיווך Cas9 סטרנד כפול (DSB) ברצף היעד יתוקן על ידי מנגנונים תלויי-הומולוגיה אנדוגני, אשר reconstitutes את הביטוי EGFP קלטת.

  1. עיצוב תחל כדי להגביר את האזור גנומית ממורכז עם sgRNA מיקוד רצפים. אמפליקון PCR זה 500 בקירוב bp. בניסוי זה, הוחל אסיפה DNA לשבט קטע מוגבר-PCR לתוך פלסמיד pCAG-EGxxFP.
    הערה: לחלופין, הגבלה מתאימה ניתן להוסיף אתרים לסוף 5' תחל ה-PCR. אתרים הגבלת הזמינות בוקטור pCAG-EGxxFP הם BamHI, NheI, PstI, סאלי, EcoRI ו- EcoRV.
  2. להגביר את ה-DNA גנומי עם תחל מעוצב באמצעות טופס PCR הפרמטרים שלהלן. לטעון את הדגימה (19.7 µL H2O; 0.3 µL של 10 ng/µL העכבר הדנ א; 2.5 מיקרומטר µL 10 EGxxFP-Top2b-F; 2.5 מיקרומטר µL 10 EGxxFP-Top2b-R; 25 µL 2 X מיקס מאסטר PCR הנפח הכולל של 50 µL) על agarose 1% ג'ל ולטהר ג'ל-שברי PCR באמצעות ערכת ג'ל-חילוץ. השתמש הבאים התגובה תנאים: 95 ° C למשך 3 דקות; אז 35 x מחזורים של 98 ° C עבור 20 s, 60 ° C 15 s, 72 ° C עבור 20 s, ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה; 4 ° C, ללא הגבלת זמן.
    הערה: בניסוי זה, אזור אחד ב Top2b אקסון 1 היה מוגבר; למצוא את רצפי תחל בטבלה 1.
  3. תקציר וקטור pCAG-EGxxFP עם אנזימי הגבלה BamHI, EcoRI עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס, ואז לטעון את הדגימה אל agarose 1% ג'ל ולטהר ג'ל-עמוד השדרה וקטוריות באמצעות ערכת ג'ל-חילוץ. להשתמש את הבאים ריאגנטים (50 הנפח הכולל µL): X µL פלסמיד (3 µg); BamHI 2 µL; EcoRI 2 µL; 5 µL 10 X המאגר; X µL ddH2O.
  4. להגדיר את ה-DNA הרכבה תגובה18 על פי הוראות היצרן, להפוך DH5α המוסמכת e. coli.
  5. לחסן אוחדו שתי המושבות, כל מ 2 בתוך ל LB בינוני ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 6 שעות, לבצע בידוד ה-DNA של הכנה מיני באמצעות ערכת, למשל, מ- Qiagen, ולזהות מושבות עם הכניסה הנכון (ןלהל pCAG-למשל-Top2b-FP) באמצעות סנגר רצף עם הראשיים. EGxxFP-Top2b-F.
  6. Transfect תאים HEK293T.
    1. תאי זרע HEK293T לתוך צלחת 24-ובכן 24 שעות לפני תרביות תאים.
      הערה: תאים היו תרבותי בתוך חממה תא 37 ° C עם 5% CO2, ב- DMEM עם תוספת גלוטמין המכילה 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. ודא כי התאים נמצאים confluent 60% ביום של תרביות תאים. בניסוי זה, השתמשנו מתוצרת עצמית תאים HEK293T stably לבטא SpCas9 כדי לבדוק את pU6-sgRNA-Cbh-Cre. עם זאת, תאים HEK293T wildtype יכול לשמש אם וקטור ביטוי SpCas9 מסופק.
    2. Transfect התאים HEK293T באמצעות הכימית polyethylenimine (פיי). Transfect התאים עם 120 ng/טוב של pCAG-למשל-Top2b-FP פלסמיד12 וכל 120 ng/pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre או pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre ב צלחת 24-. טוב. לערבב את פלסמיד DNAs, µL 1.8 של פיי ריאגנט ב- 80 µL unsupplemented בינוני DMEM עם גלוטמין להשלים תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר לאחר vortexing.
    3. 6 שעות לאחר תרביות תאים, להסיר את המדיום והחלף בינוני טריים.
    4. לפקח על הנוכחות של תאים חיים GFP+ 48 שעות לאחר תרביות תאים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות בהגדלה x 20.
      הערה: מספר התאים GFP+ מציינת את יעילות מיקוד sgRNA. התוצאות של אפקטיבית ויעילה ללא sgRNAs (sgTop2b-1 ו- sgTop2b-2, בהתאמה) מוצגות באיור איור 2A.

3. לבצע בתוך הרחם אלקטרופורציה

  1. מתרבים 6 בן שבוע 8 לעכברים ולהכין את הכלים אלקטרופורציה בתוך הרחם . לחצות את זכר homozygous Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP עכברים עם עכברים CD-1 נקבה. זמן ההריון של העכברים CD-1 מיום שהתקע הנרתיק הוא זוהה (E0.5). העוברים נמצאים electroporated יום E13.5.
    1. משוך נימים זכוכית בורוסיליקט (בתוך קוטר: 0.6-0.8 מ"מ) עם פולר micropipette. השתמש בהגדרות הבאות: P = 500, חום = 560, משיכה = 150, ול = 75, זמן = 250. תווית הטיפ נימי בדיו שחור עבור כאחראית במהלך ההזרקה. לקצץ את להתחדד נימי תחת stereomicroscope בעזרת סרגל חדים המחט פינצטה, לקצץ את הטיפ-באורך של-6 מ מ.
    2. לשמור על האחדות של הנימים לשמור את הניסוי לשחזור. ליצור קצה שקוע חד צדדית במהלך הגזם. הטיפ צריך להיות חד ככל האפשר לחדירה קלה של קיר הרחם וכדי למנוע נזק לרקמות של העובר.
      הערה: לחלופין, להשתמש מטחנה מיקרו כדי להתאים את הזווית 35°19. הנימים ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ב- 10 ס מ פטרי בתנאים ללא הפתוגן.
    3. אוטוקלב מכשירי הניתוח.
    4. מערבבים sgRNA-פלסמידים בחלקים שווים עם pT2K-IRES-לוק כדי ריכוז סופי לפחות 1 µg/µL כל פלסמיד וצבע הפתרון פלסמיד עם ירוק מהיר (הריכוז הסופי של 0.05%). להכין פתרון מניות 1% ירוק עם מים מזוקקים ללא אנדוטוקסין ו מסנן דרך מסנן מיקרומטר 0.22 להסיר חלקיקים לצבוע את הפתרון.
      הערה: שיתוף תרביות תאים של pT2K IRES-לוק הוא אופציונלי, אך מאפשר זיהוי של חיות בר קיימא electroporated לאחר הלידה באמצעות ביולומינסנציה הדמיה. אנא ראה שלב 3.5. להכין כמות מספקת של פלסמיד-מיקס המספר הכולל של עכברים בהריון צריכה לעבור ניתוח. להשתמש על 15-20 µL לערבב לכל העכבר (~ 12 העוברים). המשך מיד עם הניתוח.
  2. להכין עכברים לניתוח.
    1. עזים ומתנגד בהריון עכברים CD-1 עם איזופלוריין. לגרום הרדמה בתיבת עם 3-4 vol-% איזופלוריין (קצב הזרימה חמצן: 1.5 ליטר/דקה) ולשמור אותו עם vol 2-% במהלך הניתוח דרך האף חרוט.
      הערה: הניתוח המלא לא צריך לקחת יותר זמן מאשר 30 דקות להפחית את המספר מוזרק, electroporated עוברי, במידת הצורך. השתמש בכפפות סטריליות לניתוח.
    2. הנח את העכבר על גבו על כרית החימום ולהתאים הרדמה.
    3. להזריק שיכוך כאב (Metamizol, 800 מ"ג/ק"ג משקל גוף, subcutaneously (ש), 24 שעות ביממה דיפו).
      הערה: ניתן להשתמש משככי כאבים מורשים אחרים מאשר Metamizol.
    4. להחיל משחה העין כדי למנוע יובש בעין במהלך הניתוח.
    5. לתקן את הגפיים עם קלטת ולחטא את הבטן עם חומר מחטא. מכסים את העכבר עם גזה, להשאיר רק את האזור הכירורגי חשוף. התפשטה אתנול 70% מעל האזור הכירורגי, גזה.
    6. עושים חתך בעור של כ 2 ס מ אורך, להרחיב את הפער בעדינות עם מספריים אזמל. לאתר את linea alba ולעשות חתך השנייה מעט קטן יותר דרך הצפק באמצעות רקמות מספריים עם קצה קהה.
    7. להרטיב את חלל הבטן נפתח עם 1 עקר מראש ומחוממת x PBS.
    8. בזהירות לחלץ את הקרניים הרחם חלל הבטן בעזרת מלקחיים טבעת. משוך בעדינות על ידי גרירה בקיר הרחם אך ורק על הפער בין שקי חלמון של שני העוברים שכנות. למנוע לחץ על העובר בעת משיכתו דרך החתך. להגדיל את החתך במידת הצורך, תשמרי תוספת כדי למקם את הקרניים הרחם אל הבטן תוך דחיסה זרימת הדם דרך עורק הרחם.
      הערה: במקרים מסוימים, מומלץ לחלץ קרן הרחם אחד בכל פעם ולהחליף אותו לפני שתמשיך עם קרן הרחם השני.
  3. הזרקת ואלקטרופורציה של פלסמיד DNAs
    1. האחות כ 15 µL של פלסמיד-הפתרון צבעוניות עם הזכוכית מוכן נימי. הימנע כל בועות האוויר בתהליך זה.
      הערה: הפתרון פלסמיד יכולים להיסתם הטיפ בקלות אם הריכוז שלו הוא גבוה. בדוק את נימי על ידי שחרור אנ בדיוק לפני הזריקה.
    2. בעדינות להחזיק את העובר עם טבעת מלקחיים ואתר את אזור הצוואר.
      הערה: אם העובר נמצא בעמדה קשה להזריק, לדלג על זה וללכת על העובר הבא. שינוי מיקום מוגברת של העובר עשוי להגדיל את הסיכויים נזק להם.
    3. לאט לאט פירס עם קצה הזכוכית בעבר מוכן נימי לתוך הנוזלים הרביעי בחדירה דרך hindbrain הגבי של ולאחר מכן מזריקים µL בערך של פלסמיד-לערבב. ודא כי ה-DNA צבוע לא דלף מהמוח והיא גלויה כמו יהלום בצורת מבנה.
      הערה: כאופציה, להשתמש 2.5-fold זכוכית מגדלת כאחראית הנוזלים הרביעי, המקיפים את כלי הדם. מספקים פולסים חשמליים מיד לאחר ההזרקה כדי למנוע דיפוזיה של הפתרון פלסמיד החדרים האחרים.
    4. החלת פולסים מרובע חשמלי (5 פולסים, 32 mV, 50 ms-און, 950 ms-off) עם מלקחיים דמויי פינצטה פלטינה (ראה טבלה של חומרים). מקם את האלקטרודות רוחבית עם הקוטב השלילי מכסה את האוזן, את הקוטב החיובי מוצב על ראשית אסטרוציטומה מעל החומה הרחם. השתמש 5 מ מ קוטר אלקטרודה צלחות אלקטרופורציה יעיל של העוברים E13.5.
      הערה: להגדיל את שיעור ההישרדות של הגורים על-ידי מניפולציה פחות מ 2/3rd של המספר הכולל של העוברים לכל סכר. הימנע עוברי קרוב מדי אל הרחם. אם מניפולציה, הם עשויים לגרום לסיבוכים במהלך העבודה ולא לסכן את כל הגורים. אם אלקטרודות נמצאים גם בקרבת הלב של העובר, זה עלול לגרום לדום לב.
  4. פוסט-אלקטרופורציה וטיפול לאחר הניתוח
    1. בזהירות המקום קרניים הרחם לתוך חלל הבטן, ואז מתמלאים מראש עקר 1 x PBS. להחליק את הקרניים הרחם לתנוחה הטבעית.
    2. סגור את צפק ואת העור בנפרד עם תפר רצוף פשוטה.
      הערה: תשמרי תוספת לא לחדור דרך דופן הרחם כאשר תפירה של הצפק.
    3. הכיבוי ההרדמה, למקם את החיה הבטן כלפי מטה לתוך כלוב חדש.
    4. נטר את החיה במהלך שלב בהקיץ, שוב 24 שעות לאחר הניתוח. למקם את הכלוב תחת מנורת חימום, אם הרעד לא ישתפרו תוך 15 דקות-מסגרת זמן, החיה לא להתחיל לטפח.
    5. לאשר אלקטרופורציה מוצלחת על ידי לוציפראז הדמיה.
      1. ודא כי הסכרים המופעלים להפיל עוברי על הזמן (ב E19.5).
        הערה: תאריך לידה עשויות להתעכב ליום הבא כנראה בגלל הניתוח.
      2. עזים ומתנגד הגורים electroporated (P5-P7) עם 2.5% איזופלוריין ולהזריק (בקרום הבטן (i.p.)) עם D-Luciferin (3 מ"ג/ק"ג משקל גוף) 5 דקות לפני הדמיה.
      3. לזהות אותות לוציפראז הגורים electroporated באמצעות םלצה ביולומינסנציה.
        הערה: זמן חשיפה 1 דקות מספיקה לזהות את האות לוציפראז. Radiance (p/s/ס מ2/sr) הוא כ > עונה 1 פרק 106.

4. מכינים את Cryosections מ Cerebella Electroporated

  1. המתת חסד הגורים P7 electroporated ומנתחים את המוח הקטן.
    הערה: האות ה-GFP ניתן לצפות באמצעות סטריאוסקופ פלורסנטי.
  2. לתקן את cerebella בין לילה ב 5 מ לכל המוח של 4% מחברים ב- PBS ב 4 º C.
  3. להעביר את cerebella קבוע לילה ב- 10 מ"ל לכל המוח של 30% סוכרוז ב- PBS ב 4 º C.
    הערה: הרקמה צריך להגיע התחתון של צינור 15-mL לאחר דגירה תמיסת סוכרוז.
  4. לאחר הפינוק הפתרון סוכרוז הנותרים עם חתיכת נייר סינון תאית, לטבול המוח הקטן האופטימלית חיתוך טמפרטורה (אוקטובר) במתחם תבנית פלסטיק חד פעמיות, תקפיא את זה בקרח יבש. ניתן לאחסן את הבלוק קריוגני ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
  5. לחתוך את הבלוק קריוגני למקטעים עם 10 מיקרומטר עובי באמצעות cryostat ולשמור את הסעיפים ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
    הערה: אחד יכול לאשר GFP ביטוי בסעיפים, לאחר כביסה את OCT הרכב עם PBS.

5. Immunostaining של Cryosections

  1. יבש את השקופיות room temperature במשך 30 דקות, לשטוף פעמיים במשך 10 דקות ב- PBS.
  2. מעגל הסעיפים עם עט חוסם נוזלי, דגירה בסעיפים פתרון חסימה (10% סרום חמור רגיל ב- PBS המכיל 0.1% טריטון-X100) לשעה בטמפרטורת החדר.
  3. להוסיף ראשי נוגדנים נגד המולקולות של עניין (למשל, ה-GFP, טופואיזומראז II בטא (Top2B) במחקר זה) הפתרון חסימה, דגירה בין לילה ב 4 º C.
    הערה: השמות ואת ריכוזים של נוגדנים שימוש מפורטים בטבלה של חומרים. על מנת להגביר אותות ה-GFP, נוגדן anti-GFP ניתן לחלופין יחד עם נוגדנים אחרים.
  4. לשטוף השקופיות עם 0.1% המכיל טריטון PBST 3 X עבור 10 דקות Incubate הסעיפים לשעה בטמפרטורת החדר עם fluorophore מצומדת נוגדנים משניים מעורבבת עם הפתרון חסימה המכיל דאפי.
  5. לשטוף השקופיות ב- PBS 3 X עבור 10 דקות הר השקופיות ולשמור ב 4 ° C עד הדמיה.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

6. הדמיה וניתוח

  1. תמונה הסעיפים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה x 20.
  2. לספור את מספר התאים חיובי GFP מאבד את הביטוי של החלבון היעד. תמונת הנציגה מוצג באיור 2B.
  3. בדוק את פנוטיפ מולקולרית על אבלציה של גנים היעד ב GNPs ו progenies שלהם על ידי immuostaining12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ויוו אנליזה פונקציונלית, זה קריטי כדי לזהות את התאים שלתוכו הוכנסו אקסוגני gene (s). בעוד הביטוי של סמן, כגון ה-GFP בתאים שאינם מתרבים יכול להיות כוללים את במשך תקופה ארוכה של זמן, האות ירד ברצף לתוך תאים מתרבים. המחשה של אפקט זה הוא הפגין באיור1. כדי לעקוף מאבד את טביעת רגלו של תאים transfected LOF ניתוחים, פיתחנו גישה מוזרה על ידי שילוב המסירה הגן מבוססת-אלקטרופורציה עם הטכנולוגיה CRISPR/Cas9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות אלקטרופורציה exo הרחם , בעבר דיווחנו מבוסס-siRNA ויוו פונקציונלי ניתוחים של Atoh1 בשלב מוקדם של גרגר אסטרוציטומה תא בידול8. הודות siRNA דילול/השפלה של חשיפה של עוברי מחוץ לחומה הרחם, ניתוח פנוטיפי של התאים גרגר electroporated היה מוגבל העובריים. עם זאת, השיטה הנוכחית איפשרה ניתוח פנוטיפ של חיות כמחנכת.

המחקר הקודם שלנו הפגינו מהממת בתיווך Cas9 של מדכאי Ptch1 via בתוך הרחם אלקטרופורציה בהצלחה המושרה medulloblastoma

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מעריכים את לורה Sieber, אנה Neuerburg, יאסין הרים, פטרה Schroeter לקבלת סיוע טכני. אנו מודים גם ד"ר ק' Reifenberg, ק' Dell ועמ' Prückl לקבלת סיוע מועיל עבור ניסויים בבעלי חיים-DKFZ; הדמיה הליבה במתקני את DKFZ ו קרל Zeiss במרכז DKFZ עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי פתוח, קה 4472/1-1 (כדי D.K.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa 488 עיזים נגד עוףThermoFisherA110391:400 דילול
Alexa 568 חמור נגד עכברLife TechnologiesA-100371:400 דילול
Alexa 594 חמור נגד ארנבThermoFisherA212071:400 דילול
Alexa 647 חמור נגד ארנבLife TechnologiesA315731:400 דילול
אלקליין פוספטאז (FastAP)ThermoFisherEF0654
אוטוקלאב להקהKisker Biotech150262
BamHI (HF)NEBR3136S
BbsI (FastDigest)ThermoFisherFD1014
נייר סינון תאית (Whatman)Sigma-AldrichWHA10347525
בדTork530378
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליZeissLSM800
D-Luciferinbiovision7903-1
DAPISigma-AldrichD95421:1000 דילול
תבניות פלסטיק חד פעמיות (Tissue-Tek Cyromold)VWR4566
DMEM GlutamaxThermoFisher31966047
סרוםחמורSigma-AldrichD9663
EcoRI (HF)NEBR3101S
Electro Square PoratorBTXECM830
Endofree Maxi KitQiagen12362
אתנולMerck107017
משחת עיניים (Bepanthen)Bayer81552983
Fast GreenMerck104022
מסנן FBSThermoFisher10270-016
(0.22 ומיקרו; m)MerckF8148
צילום תאים פלואורסצנטיים (ZOE)Biorad1450031
מלקחיים ישריםFine Science Tools91150-20
גזה (X100 ES-pads 8f 10 x 10 ס"מ)Fisher Scientific15387311
GFP נוגדןAbcamab139701:1000 דילול
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
נימי זכוכית עם נימהNarishigeGD1-2
כרית חימוםThermoLux463265 / -67
תוכנת עיבוד תמונה (ImageJ ופיג'י)מזרק אינסולין NIH
(B. Braun OMNICAN U-100)Carl RothAKP0.1
IsofluraneZoetisTU061219
IVIS לומינה LT סדרה III קליפרפרקין אלמרCLS136331
Kalt תפר מחטיםFine Science Tools12050-02
KAPA HIFI HOTSTART מוכן לערבבKapa BiosystemsKK2601
Ki67 נוגדןAbcamab155801:500 דילול
אור מצביעפוטוניPL3000
חוסם נוזלים עטKisker BiotechMKP-1
MetamizolWDT-Microgrinder
NarishigeEG-45
MicroinjectorNarishigeIM300
MicropipettePuller Sutter Instrument Co.P-97
תפר משי לא סטרילי ZEN Zeiss (0.12 מ"מ)Fine Science Tools18020-50
O.C.T. Compound (Tissue-Tek)VWR4583
p27 נוגדןBD bioscience6102411:200 דילול
ParaformaldehydeRoth335.3
1x)Life Technologies14190169
pCAG-EGxxFPAddgene50716
פוליאתילנימיןסיגמא-אולדריץ'408727
pX330 פלסמידAddgene42230
QIAprep ספין מיני-פרפ ערכתQiagen27104
QIAquick ערכת מיצוי ג'לQiagen28704
ערכת קשירה מהירהNEBM2200S
טבעת מלקחייםFine Science Tools11103-09
שקופיות (SuperFrost)ThermoFisher10417002
תוכנה לביוסטטיסטיקה (פריזמה 7)תוכנת GraphPad,Inc-Spitacid
EcoLab3003840
סטריאומיקרוסקופNikonC-PS
SucroseSigma-AldrichS5016
מספריים כירורגייםFine Science Tools91460-11
מספריים כירורגיים עם קצה קההFine Science Tools14072-10
תפר (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)))SMI220340
T4 מאגר קשירת DNANEBB0202S
T4 PNKNEBM0201S
מספריים לרקמות קהות (11.5 ס"מ)Fine Science Tools14072-10
TOP2B נוגדןSanta Cruzsc130591:200 דילול
טריפסין (2.5%)ThermoFisher15090046
פינצטה עם 5 מ"מ Ø אלקטרודות דיסק PlatinumXceltis GmbHCUY650P5
וופורייזרDrä גרוורק AGGS186
תוכנת מיקרוסקופ חוט PBS (

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
  2. Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391(2015).
  3. Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
  4. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  5. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
  6. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
  7. Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
  8. Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
  9. Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
  10. Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
  11. Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
  12. Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758(2017).
  13. Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  14. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  15. Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  16. Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  17. Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355(2013).
  18. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
  19. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303(2016).
  20. Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Loss Of FunctionIn Utero ElectroporationCerebellar Granule CellsGene Transfer MethodCas9 GFP ReporterPlasmid Construct DeliveryImmunohistochemistry AnalysisFluorescent Cell ImagingCryosection PreparationBrain Tumor Modeling

Related Articles