הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

התרבות תאי גזע Pluripotent אנושי על פוליויניל אלכוהול-Co-Itaconic Hydrogels חומצה עם קשיות שונות בתנאים קסנו-חופשית

8.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57314

⸱

3 בפברואר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול מוצג להכין hydrogels אסיד פוליוויניל אלכוהול-co-itaconic עם נוקשות בדרגות שונות, אשר היו הושתל עם ובלי oligopeptides, לחקור את השפעת הנוקשות של biomaterials על בידול והתפשטות תאי גזע. הנוקשות של hydrogels היה בשליטת הזמן crosslinking.

תקציר

ההשפעה של סימנים פיזיים, כגון את הנוקשות של biomaterials על התפשטות התמיינות של תאי גזע, נחקר על ידי מספר חוקרים. עם זאת, רוב החוקרים הללו השתמשו לזיהוי hydrogels לתרבות תאי גזע בלימודיהם. לכן, התוצאות שלהם הם שנויים במחלוקת כי תוצאות אלה עשוי לנבוע המאפיינים הספציפיים של לזיהוי ולא הסימן הפיזי (קשיות) של biomaterials. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להכנת hydrogels, אשר אינם מבוססים על לזיהוי, איפה שונים גזע תאים כולל תאי גזע עובריים אנושיים (ES), תאי גזע (iPS) pluripotent המושרה האנושית, יכול להיות תרבותי. Hydrogels עם קשיות שונות הוכנו פוליוויניל bioinert אלכוהול-co-itaconic חומצה (P-IA), עם נוקשות בשליטת crosslinking תואר על-ידי שינוי crosslinking זמן. Hydrogels P-IA הושתל עם ובלי oligopeptides נגזר מטריצה חוץ-תאית נחקרו כפלטפורמה בעתיד ליצירת תאי גזע תרבות ובידול. התרבות ועל מעבר של תאי גזע נוזל מי השפיר, נגזר שומן בתאי גזע, התאים של ES האדם ותאים iPS האנושי מתואר באופן מפורט כאן. Hydrogels oligopeptide P-IA הראה הופעות מעולה, אשר היו המושרה על ידי תכונותיהם נוקשות. פרוטוקול זה מדווח הסינתזה של biomaterial, מניפולציה השטח שלהם, יחד עם שליטה המאפיינים נוקשות, ולבסוף, שלהם השפעה על גורל תאי הגזע באמצעות תרבות קסנו ללא תנאים. בהתבסס על מחקרים שנעשו לאחרונה, סובסטרטים ששונו כזה יכול להתנהג כמו פלטפורמות בעתיד לתמוך ולהנחות את גורלו של תאי גזע שונות, לקו קישורים שונים; ואני עוד יותר, להתחדש ולשחזר את הפונקציות של לאיבוד האיבר או הרקמה.

מבוא

גורלו של התמיינות תאי גזע לתוך שושלת ספציפי של תאים והתפשטות לטווח ארוך של תאי גזע, תאים pluripotent המושרה אנושי במיוחד (iPS), תאי גזע עובריים אנושיים (ES), ידוע ולהיות מוסדר על ידי מעכבי, גורמי גדילה, ו / או מולקולות קטנות ביואקטיביות בתקשורת תרבות. לאחרונה, הותאם הפיזי של biomaterials, במיוחד את הנוקשות של התא תרבות biomaterials, הוכרו להיות גורם חשוב להדריך את גורלו של תאי גזע התפשטות ובידול1,2, 3,-4,-5,-6. לכן, מספר חוקרים החלו לחקור את גורלו של תאי גזע, אשר מתורבתים על hydrogels, על בידול, בעיקר באמצעות לזיהוי hydrogels עם נוקשות בדרגות שונות.

הנוקשות של biomaterials ניתן לשלוט הדבקויות מוקד, מורפולוגיה תאים, תא פנוטיפ, אדהזיה לתאי גזע, בפרט דו-ממדית (2-D) טיפוח1,2,3,5. Mechano חישה של biomaterials על ידי תאי גזע נשלטת בדרך כלל על ידי מוקד אדהזיה איתות באמצעות קולטנים אינטגרין. NMMIIA, nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן contractility תלויי-IIA של שלד התא של אקטין משחק תפקיד קריטי בתהליך mechanosensing של תאי גזע תא 2-D טיפוח מערכות3,4,5, 7,8,9,10,11.

אנגלר ועמיתיו פיתחו רעיון מעניין כי תאי גזע בוגרים, כגון תאי גזע (BMS) מח עצם מעובדות על התא תרבות biomaterials עם מנדנד דומה לזה של רקמות ספציפיות, נוטים להבדיל לתוך תאים שמקורם רקמות ספציפיות5. עב מ תאים מתפשט על hydrogels בדו-ממד לזיהוי רך מצופה קולגן סוג אני (עם מנדנד לזו של רקמות המוח) במדיה הרחבה היו באופן ספונטני המושרה להבדיל לתוך שושלות נוירון מוקדם, ואילו תאים BMS תרבותי- hydrogels עם מנדנד דומה לזה של שרירים או עצמות סילוק רקמות נמצאו לזירוז בידול לתוך שושלות מוקדם של תאי שריר, תאי העצם, בהתאמה, בדו-ממד לזיהוי hydrogels3,5. חוקרים רבים חקרו את גורלו תאי גזע של בידול תרבותי על לזיהוי hydrogels מרותק למיטה עם קולגן מסוג I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. עם זאת, יצוין כי קצת סותרות מדווח1,18,22,23,24 קיים הרעיון של ידועים שהציע אנגלר et al. 5 זה כי הרעיון של אנגלר5 פותחה אך ורק על לזיהוי hydrogels התוצאות שלהם להיות שמקורם מן המאפיינים הספציפיים של biomaterial (לזיהוי), לא אך ורק מתוך הסימן הפיזי (קשיות) של biomaterial. לכן, חשוב לפתח סוג אחר של הידרוג, אשר הקשיחות יכול להיות נשלט על ידי crosslinking של hydrogels. למטרה זו, פותחו bioinert hydrogels, אשר הוכנו אלכוהול-co-itaconic פוליוויניל חומצה (P-IA) עם קשיחות שונות, אשר נשלטה על-פי מידת crosslinking עם המשתנים crosslinking זמן25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. תאי גזע יכולים לטפח את hydrogels P-IA nonmodified, כמו גם hydrogels P-IA הושתל עם מטריצה חוץ-תאית (ECMs), oligopeptides. הקודם המחקר25, hematopoietic תאי גזע אנושי (hHSCs) של דם טבורי היו מעובדות על P-IA hydrogels עם ערכים קשיחות שונות ועד 30 מודולוס אחסון של kPa, איפה fibronectin או oligopeptide נגזרת kPa 3 fibronectin (CS1, EILDVPST) היה הושתל על גבי hydrogels P-IA. גבוהה שמחוץ קיפול הרחבה של hHSCs נצפתה ב hydrogels P-IA הושתל CS1 או fibronectin, שהציגה של נוקשות ביניים ועד 12 kPa 30 kPa25.

IPS אנושיים ותאי ES לא יכול להיות מעובדות על-קונבנציונאלי תרביות רקמה פוליסטירן (TCP) מנות33,34 מכיוון ES האדם ואת תאי iPS דורשים קשירה ספציפי ECMs, כגון vitronectin או laminin כדי לשמור על pluripotency שלהם במהלך תרבות לטווח ארוך. לכן, מספר מבני הושתל oligopeptide hydrogels P-IA עם מאפיינים של האופטימלית נוקשות היו תוכנן והכינו תצורות של שרשרת אחת, שרשרת אחת עם קטע משותף, שרשרת כפולה עם קטע משותף, סוג הקנים שרשרת32. רצפים Oligopeptide נבחרו מתחומים אינטגרין, גליקוזאמינוגליקן-איגוד של ECMs. Hydrogels P-IA הושתל עם vitronectin, נגזר oligopeptides עם שרשרת כפולה או קטע משותף, אשר יש מודולוס אחסון של kPa כ 25, נתמך התרבות לטווח ארוך של ES האדם ואת תאי iPS עבור המעברים מעל 12 ללא קסנו וכימיים התנאים מוגדרים32. קטע משותף, שרשרת כפולה עם התא מולקולות אדהזיה על hydrogels הקלו ההתפשטות ו pluripotency של ES ואנושי iPS תאים32. . הנה, פרוטוקול להכנת hydrogels P-IA (עם מודולוס אחסון של 10 kPa ל kPa 30, אשר נמדדה בתנאים רטובים באוויר) הושתל עם או בלי oligopeptides או ECMs מתואר. כיצד תרבות, בקטע מספר תאי גזע (כולל תאי גזע נוזל מי השפיר, נגזר שומן בתאי גזע, התאים של ES האדם ותאים iPS אנושי) מוצג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הניסויים במחקר זה אושרו על ידי ועדות האתיקה של בית החולים Landseed טייוואן (IRB-13-05) וכן באוניברסיטה המרכזית הלאומי. כל הניסויים נערכו על פי קווים מנחים רלוונטיים וישימים ממשלתיים ומוסדיים כל תקנות במהלך מחקר זה.

1. פתרון והכנה מדיה

  1. פולימר טיהור
    1. לטהר P-IA עם חומצה קרבוקסילית קבוצה עם רמה מסוימת של הידרוליזה של > 96.5% ע י שטיפת P-IA עם אתנול. מקום 20 גרם של P-IA לתוך 200 מ של אתנול חרוט בתוך 500-mL, להתסיס על פגים עבור 24-30 ה Exchange האתנול עם אתנול טריים h כל 8-10.
    2. הסר P-IA האתנול על-ידי סינון באמצעות משפך ביכנר.
    3. יבש P-IA על ידי ייבוש ואקום בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה.
      הערה: מומלץ לנקות את המלכודת במערכת ואקום פרמצבטי (על-ידי הסרת אתנול) לעתים קרובות, במיוחד בתקופת הראשונית כמה שעות, כי המלכודת נוטה סתומים לאחר הסרת כמות גדולה של אתנול מ P-חקירות פנים
  2. הכנה של הפתרון P-IA
    הערה: להוסיף הפולימר באיטיות לתוך הממס (מים). מומלץ לקחת לפחות 15 דקות כדי להוסיף P-IA הממס. אם הממס נוסף לתוך הפולימר, הפולימר לא להיות מומס לחלוטין. יש להיזהר לא לייצר חומר נפץ הרתחה של הפתרון P-IA. השתמש משקפי מגן במהלך ההכנה של הפתרון P-IA. תהליך חימום של הפתרון P-IA חיוני כדי להמיס גבישי P-חקירות פנים הוא הציע (עדיף) כדי להכין את הפתרון P-IA בחדר נקי יחסית ניסיוני, במידת האפשר.
    1. להמיס P-חקירות פנים במים טהורים ריכוז % משקל 0.050 לניסוי לטיפוח התא או במשקל 0.50% ריכוז עבור המידה rheometer: לדוגמה, להמיס 50 מ"ג של P-IA 100 מ של מים טהורים על תרבית תאים ו 500 מ ג של P-IA בשנת 100 מ של דה שתייה (DI) עבור המידות rheometer.
    2. להתסיס את הפתרון P-IA 1 h ב- הכיריים.
      הערה: כדי להימנע רותחים נפץ, לא לחמם הפתרון מעל 95 ° C. רותחים נפץ של הפתרון פולימר בטמפרטורה גבוהה עשויה ליצור כוויות בעור. לכן, לבצע את החימום של P-IA בזהירות רבה, לנטר את הטמפרטורה של הפתרון P-IA במהלך החימום.
    3. לאחר הפתרון P-IA היה מקורר בטמפרטורת החדר, להתסיס את הפתרון P-IA בטמפרטורת החדר במשך 48 ה לעזוב הפתרון P-IA חם בצלחת חמים ללא חימום ולאחר מכן משאיר אותו בלי עצבנות בטמפרטורת החדר במשך 20-24 שעות להבטיח כי בועות אוויר לא להציג הפתרון P-IA.
  3. הכנה של הפתרון crosslinking
    1. להפוך את ההרכב של פתרון 1.0 crosslinking משקל % גלוטראלדהיד מהפתרון 25% מימית גלוטראלדהיד, 20.0 משקל % נה2אז4 שימוש 99% > טוהר, ו- 1.0 משקל % H2אז4. לדוגמה, עבור אחד 6 או 12 טוב תא תרבות צלחת, להוסיף 100 µL של פתרון גלוטראלדהיד, 2 גר' נתרן גופרתי, 100 µL של חומצה גופרתית 10 מ"ל של מים טהורים.
  4. האדם ES/PS תא תרבות המדיה
    הערה: שימוש DMEM/F12 מדיה, מדיה 6 חיוני ומדיה חיוני 8 עבור התרבות תאים.
    1. להחזיר קפוא תוספת 50 X 8 חיוני לאט לפתרון של בן לילה על ידי מפשיר במקרר 4 ° C.
    2. להוסיף בקבוק אחד של תוספת 50 X 8 חיוניים לתוך בקבוק אחד של מדיה הבזליים 8 חיוני. להפריד את המדיה לתוך aliquots קטן (50 מ ל כל אחד) צינורות צנטריפוגה 100 מ ל, ולאחר מכן לאחסן התקשורת ב-20 ° C.

2. P-IA הידרוג מאכל הכנה

  1. הכנת הסרט P-IA
    1. להזריק את aliquot 1 מ"ל של הפתרון P-IA לתוך תבשיל TCP 35 מ מ, לייבש את המנה בתנור 45 מעלות צלזיוס במשך יומיים לייצר סרט P-IA, ספסל נקי.
  2. Crosslinking מהמאכלים הידרוג P-IA
    1. לטבול את הסרטים P-IA לתוך פתרון crosslinking מימית 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 ו 48 שעות.
      הערה: ' P-IA -X' (למשל, P-IA-12 h) מתייחס תפור הידרוג P-IA עבור X h (למשל, 12 שעות).
    2. לאחר crosslinking, לשטוף את hydrogels P-IA מים זכים בטמפרטורת החדר, ואז לשמור hydrogels במים טהורים בטמפרטורת הסביבה ב ספסל נקי.
    3. לחטא את hydrogels P-IA על ידי טבילה אתנול 75.0 volume/volume% פתרון 1 דקות, לשטוף את hydrogels P-IA במים טהורים שש פעמים, אז שמור את hydrogels P-IA במים טהורים עד המשמש עבור הטיפוח סלולריים.
  3. הכנת מאכלים הידרוג P-IA הושתל עם oligopeptide או ה-ECM
    1. להפעיל את hydrogels P-IA באמצעות טבילה 1 מ"ל של פתרון מימית המכילה 10 מ"ג/מ"ל N-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide הידרוכלוריד (EDC) ו- 10 מ"ג/מ"ל N- hydroxysuccinimide (NHS) עבור 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס או 4 h ב 4 º C.
    2. יש לשטוף hydrogels P-IA עם 1 מ"ל של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS, pH 7.2) 3 פעמים, לטבול את hydrogels P-IA בפתרון PBS המכיל 1 מ"ל של oligopeptide (100-1,500 µg/mL) או ECM (10-100 µg/mL) במשך 24 שעות ביממה ב 4 º C.
      הערה: רצפי oligopeptide ואת ECMs לשימוש בתאי גזע תרבות מסוכמים בטבלה1.
    3. לאחר השתלת עור של oligopeptide או ECM, לשטוף את hydrogels P-IA מים זכים 3 פעמים.
      הערה: hydrogels P-IA הושתל עם Y µg/mL של oligopeptide או ECM (Z) הם ןלהל P-IA -Xh -Z אוP-IA-Xh -Z-Y, שבו X מתייחס הזמן crosslinking (h), Y מציין את הריכוז של oligopeptide או ECM, ומציין Z של oligopeptide שונים או ECM.

3. תרבית תאים ES האנושי/iPS

  1. שיטת המעבר ותחזוקה של ES האדם מובחן, תאי iPS
    1. לשמור על האדם ES (למשל, WA09 או H9) תאים או אנושי iPS (למשל, HS0077) לתאים Matrigel במדיה חיוני 8 מנות 6 ס מ באמצעות ES אנושי רגיל/iPS תא תרבות פרוטוקולים28,32.
    2. דגירה תאים ES/iPS אנושיים בקרבת מקום ל- confluent עם dispase 2.0 mg/mL השני בתקשורת DMEM/F-12 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 8-10 דקות, ואז לשטוף תאים אנושיים ES/iPS פעמיים עם DMEM/F12 מדיה.
    3. לאחר התוספת של 2 מ של מדיה DMEM/F-12 מנות התרבות תאים ES/iPS אדם, ניתוק חלש מושבות חסיד באמצעות המגרד של התא או על-ידי pipetting.
    4. לאסוף את התאים ES/iPS אנושי לתוך צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, צנטריפוגה תאים אנושיים ES/שב ס ב g × 160 עבור 5 דקות ב 37 º C.
    5. לאחר צנטריפוגה, למחוק את DMEM/F12, להשעות את התאים ES/iPS האנושי 1 מ"ל של מדיה E8, ואז לספור את צפיפות התאים באמצעות מונה תא.
    6. לחסן את התאים ES/iPS לאחר ההתאמה צפיפות המתאים (1-5 x 104 תאים לכל ס מ2 passaging או כפי שצוין) לתוך מנות חדשות התרבות (hydrogels P-IA הושתל עם oligopeptide או ECM).

4. אפיון איפיון תאים ES האדם/iPS

  1. הערכה של פעילות פוספטאז אלקליין (AP)
    1. מודדים את הפעילות phosphatase אלקליין (AP) של תאים ES/iPS אנושיים באמצעות בשידור חי phosphatase אלקליין רגילה מכתים.
  2. Immunostaining
    1. מבצע immunostaining של טרה-1-81, SSEA-4, Sox2 ו- Oct3/4 תאים הס והירכיים לחקור pluripotency בעקבות28,את פרוטוקול קונבנציונאלי32.
    2. להוסיף נפח 0.5 מ של 4% (נפח/נפח) paraformaldehyde לתוך כל מנה טוב 24 שבו התאים ES/iPS האנושי היו בתרבית, לאחר מכן, דגירה המנות למשך 15 דקות ב 4 ° C כדי לתקן את התאים.
    3. האחות הפתרון paraformaldehyde מכל קידוח. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של PBS לכל טוב, תשאף PBS לשטוף את התאים. לבצע את תהליך השטיפה 3 פעמים.
    4. Permeabilize קרום התא על-ידי הוספת 0.5 מ של 0.3% (נפח/נפח) פתרון טריטון-X 100 ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. האחות הפתרון טריטון-X 100 להוסיף 300 µL של 2% (משקל/נפח) אלבומין שור (BSA) ב- PBS (חסימת מאגר) לבאר כל ו תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. להסיר את המאגר חסימה על ידי pipetting, לאחר מכן, הוסף את הנוגדנים הראשית הרצויה (Oct3/4 (1:200), Sox2 (1:200), SSEA-4 (1:200), Tra-1-81(1:200) על ידי פיפטה, עיין בטבלה 2) כל טוב, איפה 1:200 מציין הנוגדנים היו מדולל עם PBS 200-fold, מודגרות ליום אחד ב 4 º C.
    7. האחות הפתרון נוגדן ראשוני, ולשטוף את התאים עם 300 µL של 0.05% 20 Tween ב- PBS פתרון 3 פעמים בטמפרטורת החדר.
    8. להוסיף 300 µL של נוגדנים משניים (1:200, ראה טבלה 2), אשר הספציפיים המשנה IgG העיקרי, בפתרון BSA 2% (משקל/נפח) לתוך כל טוב, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר בחושך.
    9. לשטוף את התאים עם 300 µL של 0.05% 20 Tween ב- PBS פתרון 3 פעמים בטמפרטורת החדר בחושך.
    10. לנתח את התאים מוכתם על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ או מיקרוסקופיה קונפוקלית.
  3. היווצרות הגוף embryoid
    1. לחקור את pluripotency של תאים ES/iPS האנושית על ידי היווצרות embryoid הגוף (EB)-פסוקים 10 ו- 20.
      הערה: ליד 80% למפגש ב- 6-ובכן צלחות מספיקה עבור הכנת מערך EB.
    2. לשטוף ES האדם או תאי iPS עם 2 מ"ל של מדיה DMEM/F-12 פעמיים ולאחר מכן לטבול התאים 1.5 מ ל 6 חיוני מדיה.
    3. חותכים ליד 80% confluent ES או שב ס תאים אנושיים לחלקים כ 32 בעזרת טיפים µL 200. בשלב הבא, ניתוק תאים מן הכלים באמצעות המגרד של התא.
    4. איסוף תאים ES/iPS אנושיים והעברת לתוך תבשיל מצורף ultralow 6-. טוב.
    5. המרת 6 חיוני מדיה על-ידי pipetting המדיה הישנה והוספת מדיה טריים כל יומיים.
      הערה: התרבות התאים ההשעיה 2 שבועות ב 37 ° C עם 5% CO2.
    6. לאחר EBs הושעו למשל 6 חיוניים בתקשורת, להעביר EBs כדי תרבות על מנות TCP 24-ובכן מצופה 0.1 ג'לטין % במשקל ולאחר התרבות התאים בתקשורת 6 חיוני לשבוע נוסף.
    7. כתם התאים עם נוגדנים נגד סמנים של תאים שמקורם שלוש שכבות germline עובריים [AFP (האנדודרם), ר GFA (האאקטודרם), β השלישי-טובולין (האאקטודרם), ו- SMA (והמזודרם)] ולהעריך את התאים בשיטה immunostaining שתוארו לעיל.
  4. היווצרות תפלצת
    1. לחקור את pluripotency של תאים ES/iPS האנושית על ידי היווצרות טרטומה ב פסוקים 10 ו- 20.
      הערה: 5 מנות ליד הנהרות 80% ב- 6-ובכן צלחות מספיקים היווצרות טרטומה (לפחות 3 x 106 תאים נחוצים עבור הניסויים היווצרות טרטומה).
    2. לשטוף את התאים עם 2 מ"ל DMEM/F-12 מדיה פעמיים, ולאחר מכן להוסיף 1.5 mL מדיה DMEM/F-12 המנות התרבות תאים.
    3. לחתוך כמעט 80% confluent ES או שב ס תאים אנושיים לחתיכות כ 32 באמצעות טיפים µL 200. בשלב הבא, ניתוק תאים מן הכלים באמצעות המגרד של התא.
    4. איסוף תאים ES/iPS אנושיים לתוך צינור צנטריפוגה 15-mL, centrifuge את התאים ב g × 160 עבור 5 דקות ב 37 º C.
    5. לאחר צנטריפוגה, להשעות את כדורי תא ב- 100 µL DMEM/F12, ואז לערבב התא. גללים עם 100 µL Matrigel (יחס 1:1 נפח).
    6. העברת התליה תא לתוך מזרק טרום מקורר-20 ° C. להזריק, בסך הכל, לפחות 3 × 106 תאים subcutaneously לתוך הנהון זכר-SCID (הנהון. CB17 -Prkda/JNarlscid) עכברים (5-8 שבועות).
    7. לאחר 5-8 שבועות, לנתח teratomas, לתקן עם פתרון paraformaldehyde 4.0% (משקל/נפח) ולאחר מכן לאחסן ב 4 º C.
    8. לתקן את תפלצת עם פרפין, פורסים את teratomas פרפין-מוטבע, כתם ועם hematoxylin אאוזין (H & E) שימוש בגודל28,נוהל מקובל32.
      הערה: חוקרים עשויים לשלוח רקמות טרטומה קבוע לחברה. כדי לתקן את teratomas עם פרוסה פרפין-מוטבע teratomas, פרפין, מכתים את הדגימה עם H & E, אשר משמש בדרך כלל בהמחלקה של פתולוגיה בבתי חולים.
  5. תרבית תאים גזע נגזר שומן אנושי (פרסומות)
    1. תרבות חמים מדיה (DMEM המכיל 1% antimycotic אנטיביוטיקה ו-10% עוברית שור סרום (FBS)), 0.25% של טריפסין-EDTA, PBS עד 37 ° C בלכהן אמבט מים לשימוש.
    2. רחץ התאים המודעות של האדם על ידי pipetting 10 מ"ל של PBS לתוך כל מנה 6 ס מ תרבות שבה התאים מתורבתים.
    3. להוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA פתרון (0.25%) לתוך הכלים תרבות 6 ס מ, דגירה הפתרון ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    4. להתבונן בתאים המנות תרבות 6 ס מ תחת מיקרוסקופ כדי לאשר התאים הם צמודי קרקע.
    5. לאסוף את התאים לתוך שפופרת צנטרפוגה 15-mL, ולהוסיף אמצעי שווה של תרבות התקשורת (DMEM המכיל אנטיביוטיקה antimycotic 1% ו-10% FBS) לתוך הצינור צנטריפוגה כדי לנטרל את טריפסין-EDTA.
    6. Centrifuge התאים ב g × 250 למשך 5 דקות ב 37 º C.
    7. לאחר צנטריפוגה, למחוק את תגובת שיקוע בקפידה על-ידי pipetting, מבלי להפריע בגדר התא.
    8. Resuspend התאים בתקשורת תרבות ולאחר מכן זרע תאי-צפיפות המתאים (5-10 x 103 תאים לכל ס מ2 passaging או כפי שצוין) לתוך מנות חדשות התרבות (hydrogels P-IA הושתל עם ובלי oligopeptides, ECM).
  6. נוזל מי השפיר האנושי נובעות תרבית תאים (AFS)
    1. לחמם טיפוח מדיה (201 DMEM/MCDB (2:3) המכיל 20% עוברית שור סרום (FBS), bFGF ng/mL 5 ו 1% antimycotic אנטיביוטיקה), 0.25% של טריפסין-EDTA, PBS עד 37 ° C בלכהן אמבט מים לשימוש.
    2. לשטוף AFS תאים אנושיים על-ידי pipetting 10 מ"ל של PBS בכל מנה 6 ס מ תרבות שבה התאים מתורבתים.
    3. להוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA פתרון (0.25%) מנות 6 ס מ תרבות, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    4. לבחון התאים על מנות 6 ס מ תרבות תחת מיקרוסקופ כדי לאשר את התאים הם צמודי קרקע.
    5. לאסוף את התאים לתוך שפופרת צנטרפוגה 15-mL, וכן להוסיף אמצעי שווה של תרבות התקשורת (DMEM/MCDB 201 (2:3) המכיל 20% עוברית שור סרום (FBS), 5 bFGF ng/mL ואנטיביוטיקה antimycotic 1%) לתוך הצינור צנטריפוגה כדי לנטרל את טריפסין-EDTA.
    6. Centrifuge התאים ב g × 250 למשך 5 דקות ב 37 º C.
    7. לאחר צנטריפוגה, למחוק את תגובת שיקוע בזהירות מבלי להפריע בגדר תא על-ידי pipetting.
    8. Resuspend התאים בתקשורת הטיפוח-תרגול, אז זרע תאי-צפיפות המתאים (5-10 x 103 תאים לכל ס מ2 passaging או כפי שצוין) לתוך מנות חדשות התרבות (hydrogels P-IA הושתל עם ובלי oligopeptide, ECM).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Hydrogels P-IA הושתל עם ECM, נגזר oligopeptide (oligoECM) או ECM עם elasticities שונים הוכנו על ידי ביצוע את ערכת התגובה, כפי שניתן לראות באיור 1A, באמצעות סוגים שונים של oligoECM (איור 1B). Elasticities של hydrogels היו מווסתות על-ידי עוצמת crosslinking יישומית (זמן) (איור 1C). Hydrogels P-IA הושתל עם vitronectin, נגזר oligopeptides, הכולל של מודולוס אחסון של kPa 25.3 (24 שעות ביממה crosslinking זמן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

P-IA-oligoECM ו- hydrogels P-IA-ECM עם קשיות שונות פותחו לצורך הרחבת לטווח ארוך ES האדם ותאים iPS שמירה על pluripotency שלהם מעברים מעל לעשר בתנאים קסנו-חופשית, כמו גם עבור התרבות של תאים אנושיים AFS, תאים המודעות, תאי גזע hematopoietic25,28,32. Hydrogels P-IA. מרותק למיטה עם oligoECM הם מועמד מצוין עבור חומרי טיפוח תא לחקור את ההשפעה של חומרים התרבות התא על גורלו של בידול והתפשטות של סוגים שונים של תאי גזע, כמו גם ראשי תאים ו ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן בחלקו על ידי משרד המדע הטכנולוגיה, טייוואן תחת גרנט מספרי 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 ו 104-2221-E-008-107-MY3. מחקר זה גם נתמך על ידי הפרויקט בבית החולים Landseed טייוואן (NCU-איש-105-A-001). מענק הסיוע למחקר מדעי (מספר 15K 06591) של משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה של יפן הוא גם הודה. א Higuchi רוצה להכיר עבור Rectorate סגן התוכנית השותפות המדעית הבינלאומית (ISPP-0062) עבור לימודים לתואר שני ושלישי ומחקר, אוניברסיטת המלך סעוד, ריאד 11451, ממלכת ערב הסעודית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
GTPGPQGIAGQRGVVPH יפןאיןמפרט: Oligopeptide
קיצור: RGD מחזורי, cRGD
GACRGDCLGAPH יפןאיןמפרט: Oligopeptide
קיצור: FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH יפןאיןמפרט: Oligopeptide
קיצור: CS1
EILDVPSTPH יפןללאמפרט: Oligopeptide
קיצור: VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH יפןללאמפרט: Oligopeptide
קיצור: HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH יפןאיןמפרט: Oligopeptide
קיצור: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH יפןאיןמפרט: Oligopeptide
קיצור: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH יפןאיןמפרט: Oligopeptide
קיצור: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMPPH יפןאיןמפרט: מטריצה חוץ-תאית
קיצור: rVN
VitronectinThermo Fisher מדעיA14700מפרט: מטריצה חוץ-תאית
קיצור: FN
פיברונקטיןסיגמא-אולדריץ'מפרט F2006חומר ציפוי זמין מסחרית
קיצור: Synthemax II
Synthemax IICorning3535מפרט: פולימר
פוליוויניל אלכוהול-חומצה קו-איטקוניתיפן VAM & מפרט PovalAF-17
כימי GlutaraldehydeSigma-AldrichG5882מפרט: כימי
Na2SO4Sigma-Aldrich239313מפרט:
כימי H2SO4Sigma-Aldrich339741 מפרט: Chemical
קיצור: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma-AldrichE7750מפרט: Chemical
קיצור: NHS
N-hydroxysuccinimideSigma-Aldrich56480מפרט:
כימי ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148מפרט:
כימי Triton-X100Sigma-AldrichT8787מפרט: תרבית תאים מתכלה
מגרד תאיםקורנינג3008מפרט: מתכלה תרבית תאים
Dispase IISigma-AldrichSI-D4693מפרט: מדיום תרבית תאים
חיוני 6תרמו פישר מדעיA1516401מפרט: מדיום תרבית תאים
חיוני 8תרמו פישר מדעיA1517001מפרט: מדיום תרבית תאים
DMEM / F12Thermo Fisher מדעי11330-032מפרט: מדיום תרבית תאים
DMEMThermo Fisher מדעי12800-017מפרט: מדיום תרבית תאים
MCDB 201Sigma-AldrichM6770מפרט: תא ES
תא ES אנושימכון המחקר WiCell, Inc.מפרט WA09תא iPS
תא iPS אנושיRiken Cell BankHS0077מפרט: 35 מ"מ
קיצור: TCP
צלחת TCPCorning353001מפרט: 60 מ"מ
קיצור: TCP
TCP צלחתקורנינג353002מפרט: 24 באר צלחת
24 באר353047 מפרט: חסימה סוכן
אלבומין סרום בקרסיגמא-אולדריץ'A8806מפרט: מגיב זיהוי
כתם חי פוספטאז אלקלייןThermo Fisher scientificA14353מפרט: מגיב זיהוי
המטוקסילין ואאוזיןסיגמא-אולדריץ'1.05175מפרט: צלחת היווצרות EB
צלחת חיבור נמוכה במיוחד 6 בארותקורנינג3471מפרט: חומר ציפוי
ג'לטיןסיגמא-אולדריץ'G9391מפרט: חומר ציפוי
MatrigelCorning354230מפרט: עכברים
עכברי NOD-SCIDמעבדות מחקר יישומיות לאומיותללאמפרט: סרום
סרום בקר עובריתעשיות ביולוגיות04-001-1Aמפרט: אנטיביוטיקה
אנטיביוטיקה אנטי-פטרייתThermo Fisher Scientific15240-062מפרט:
נוגדן ל-NanogInvitrogenMA1-017מפרט:
נוגדן ל-SSEA4Abcamab16287מפרט: נוגדן
נוגדן ל-OCT3/4InvitrogenPA5-27438מפרט:
נוגדן נוגדן ל-Sox2Invitrogen48-1400מפרט:
נוגדן לשריר חלקActin InvitrogenPA5-19465מפרט:
נוגדן נוגדן עבור AFPInvitrogenPA5-21004מפרט: נוגדן
נוגדן GFAPInvitrogenMA5-15086מפרט: נוגדן
Alexa Fluor 555 – נוגדן נגד עכבר עז מצומדInvitrogenA-21422מפרט: נוגדן
Alexa Fluor 488 – נוגדן מצומד עז נגד ארנבInvitrogenA-11008מפרט: נוגדן
: : : נוגדן נוגדן נוגדן

מקורות

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493(2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778(2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312(2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136(2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647(2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146(2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושייםהידרוג'לים מסוג P-IAתרבית נטולת קסנוגנ (Xeno-Free)בקרת קשיחות הידרוג'להשתבכות אוליגופפטידיםדיפרנציאציה של תאי גזעמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתפרוטוקול מעבר תאיםסינתזה של ביו-חומריםמטריצה חוץ-תאית
התרבות תאי גזע Pluripotent אנושי על פוליויניל אלכוהול-Co-Itaconic Hydrogels חומצה עם קשיות שונות בתנאים קסנו-חופשית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.