מאמר שיטה

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

DOI:

10.3791/57315

⸱

26 במרץ 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Engineering, University of San Diego, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג'ל-seq מאפשר חוקרים להכין בו זמנית ספריות עבור שניהם הדנ א - ו RNA-seq זניח עלות נוספת החל מ- 100-1000 תאים באמצעות מכשיר הידרוג פשוטה. המאמר מציג גישה מפורטת על הזיוף של המכשיר, כמו גם את הפרוטוקול הביולוגי כדי ליצור ספריות לזווג.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת להגביר את רצף ה-DNA או RNA מדגימות התחלה קטנה הושגה רק בחמש השנים האחרונות. למרבה הצער, פרוטוקולים סטנדרטיים עבור יצירת גנומית או ספריות transcriptomic אינם תואמים, חוקרים עליך לבחור אם רצף ה-DNA או RNA מדגם מסוים. ג'ל-seq פותר בעיה זו בכך שהוא מאפשר לחוקרים בו-זמנית להתכונן ספריות הן DNA ו- RNA החל מ 100-1000 תאים באמצעות מכשיר הידרוג פשוטה. המאמר מציג גישה מפורטת על הזיוף של המכשיר, כמו גם את הפרוטוקול הביולוגי כדי ליצור ספריות לזווג. עיצבנו ג'ל-seq. כך זה יכול להיות מיושם בקלות על ידי חוקרים אחרים; מעבדות גנטיקה רבים יש כבר את כל הציוד הדרוש כדי לשחזר את ייצור המכשיר ג'ל-seq. פרוטוקול שלנו מעסיקה נפוצות ערכות עבור שניהם הגברה שלם-תעתיק (של WTA), ספריית הכנה, אשר הם גם נוטים להיות מוכר חוקרים כבר שבקיאים גנומית ושוויונית transcriptomic ספריות. הגישה שלנו מאפשר לחוקרים להביא לשאת את הכוח של רצפי DNA ו- RNA על דוגמה אחת ללא פיצול ועם זניח בתוספת מחיר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדור הבא רצף (הגדרות) יש לו השפעה עמוקה על הדרך מתנהל מחקר גנטיקה. כאשר חוקרים התמקדו פעם רצף הגנום של זן שלם, עכשיו זה אפשרי את רצף הגנום של גידול יחיד או אפילו תא בודד בניסוי אחד. 1 הגדרות גם הפכה חסכוניות כדי רצף התרשימים RNA נמצא בתוך תא, אוסף של נתונים המכונה של transcriptome. היכולת להגביר את רצף ה-DNA או RNA מדגימות התחלה קטנה הושגה רק בחמש השנים האחרונות. 2 , 3 , 4 . למרבה הצער, פרוטוקולים סטנדרטיים אינם תואמים, חוקרים עליך לבחור אם רצף ה-DNA או RNA דגימה נתון. כאשר מדגם ההתחלתי הוא גדול מספיק, ניתן לפצל אותו לשניים. קשקשים קטנים יותר, עם זאת, אובדן של חומר עקב פיצול דגימות יכולים להשפיע על איכות ספריה ולאחר איגום של דגימות יכול ממוצעים גרסאות מעניינות בין תאים. 5 יתר על כן, החוקרים מעוניינים יותר ויותר בחינת והמדגמים יכולה להתפצל, כגון תאים בודדים או ביופסיות גידול קטן הטרוגנית. 6

כדי לטפל בבעיה זו, שלושה פרוטוקולים לאחרונה פותחו כדי רצף ה-DNA ו- RNA מדגם המוצא זהה: ג'ל-seq7, G & T-seq8ו ד ר-seq9. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט עבור ג'ל-seq, אשר יכול לשמש כדי בו-זמנית ליצור ספריות DNA ו- RNA מתוך כמה כתאי 100 זניח עלות נוספת. ההיבט הרומן של ג'ל-seq היא היכולת להפריד בין DNA ו- RNA המבוסס באופן בלעדי על גודל באמצעות מטריצות הידרוג בעלות נמוכה. החידוש הליבה של פרוטוקול ג'ל-Seq הוא ההפרדה הפיזית של ה-DNA מ- RNA. ההפרדה הזאת מושגת electrophoretically באמצעות שילוב של ממברנות לזיהוי לנצל גודל ההבדלים בין מולקולות אלה. כדי לשים את ההבדלים בגודל בהקשר, שקול כיצד DNA ו- RNA הם צילמו: בעוד דנ א קיים בסולם מיקרון ניתן להציג באמצעות מיקרוסקופים מסורתיים, RNA קיים בסולם ננומטר ולא חייב לדימות תוך שימוש בטכניקות מורכבות כגון אלקטרונים הקפאה מיקרוסקופ. 10

הגישה הפרדת DNA ו- RNA, פרוטוקול זה מוצג באיור1. החלונית השמאלית מציגה DNA ו- RNA חינם צף בפתרון בקרבת קרום. כאשר שדה חשמלי מוחל, כפי שמוצג בלוח הימני, DNA ו- RNA לחוות כוח electrophoretic שגורם העברה דרך הקרום. על-ידי כיוונון המאפיינים ממברנה, יצרנו קרום חדיר למחצה המפריד DNA RNA. מולקולות DNA יידחפו נגד הקרום, אבל להיות מסובכת בקצה בשל גודלם גדולים. מצד שני, מולקולות RNA קטנות, ניתן להגדיר מחדש, לארוג את דרכם דרך הקרום. תהליך זה, המכונה reptation, דומה לאופן בו שנחש עובר דשא. בסופו של דבר אלה מולקולות RNA מופסקים על ידי קרום השני, בצפיפות גבוהה זה קשה מדי עבור פולימרים אפילו קטנה יותר (> 200 זוגות בסיס) להתחמק על דרך. ברגע פיזית מחוזק, DNA ו- RNA יכול להיות התאושש לעבד להפיק מידע על הגנום והן transcriptome. בעוד נוכל להפריד DNA ו- RNA, מצאנו תוצאות טובות יותר מתקבלים אם ה-RNA היא הפוכה עיבד כדי cDNA לפני ההפרדה. היברידים רבים cDNA/RNA יציבים יותר RNA לבד, עדיין יכול לעבור דרך קרום בצפיפות נמוכה.

figure-introduction-1
איור 1 . עקרון ההפעלה ג'ל-seq. העיקרון הבסיסי המשמש להפרדת פיזית של DNA ו- RNA. בשדה חשמלי יישומית, מולקולות RNA קטנות להעביר דרך קרום בצפיפות נמוכה אבל מולקולות DNA גדולות לכוד על פני השטח. איור זה שוחזר הפניה למעורר 7, ברשות החברה המלכותית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מאמר זה מתאר בפירוט בשני הזיוף של המכשיר ג'ל-seq, הפרוטוקול הביולוגי ליצירת לזווג ספריות DNA ו- RNA. סקירה כללית של שניהם מוצג באיור2. המכשיר מפוברק על ידי שכבות 3 צפיפות שונה לזיהוי ג'לים אחד על גבי השני בתהליך דומה ליצירת תקן ג'לים הערימה. 11 הפרוטוקול הביולוגי מתחיל עם תאים 100-1000 הושעו ב- PBS. התאים הם lysed, הרנ א מומר cDNA לפני המכשיר משמש להפריד את הדנ א כלאיים cDNA/RNA. לאחר ההפרדה, התאוששות, גנומית, transcriptomic ספריות מוכנות באמצעות תהליך זה מקרוב כדלקמן פרוטוקול ערכת הכנה הספרייה הגנום כולו. ניתן לקרוא פרטים נוספים על פיתוח, אימות של ג'ל-seq במעבדה על פרסום שבב "ג'ל-seq: הגנום כולו ורצף transcriptome על ידי סימולטני קלט נמוך-DNA ו- RNA ספריית הכנה באמצעות מחסומים הידרוג חדיר למחצה ." 7

figure-introduction-2
איור 2 . פרוטוקול ג'ל-seq. מבט כולל על הצעדים כדי לפברק את המכשיר ג'ל-seq והפרוטוקול מחוללות לזווג ספריות DNA ו- RNA. חלקים של איור זה שוחזר הפניה למעורר 7, ברשות החברה המלכותית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כדי ליצור ספריות DNA ו- RNA מתוך תאים בודדים, חוקרים, כדאי שתשקול להשתמש או G & T-seq או ד ר-תת סעיף. G & T-Seq, כמו ג'ל-seq, מסתמך על הפרדה פיזית של רנ א מ- DNA גנומי. גישה זו נסמכת על messenger RNA (mRNA) 3′ polyadenylated זנב כמטרה נפתחים. ה-mRNA נלכד על חרוז מגנטי באמצעות פריימר oligo-dT biotinylated. ברגע mRNA כבר נתפס החרוזים הם שנערך במקום עם מגנט, תגובת שיקוע המכיל את הדנ א הגנומי יכול להיות הוסר, הועבר צינור אחר. בתום ההפרדה הפיזית הזאת, ספריות שונות ניתן להפיק מן ה-mRNA ו DNA. 8 גישה זו פועלת היטב אם הרנ א עניין polyadenylated, אולם אין אפשרות להשתמש ללמוד תעתיקים הלא-polyadenylated, כגון ribosomal RNA, tRNA, או RNA של אאוקריוטים.

ד ר-seq מסתמך על צעד הגברה מראש לאן דנ א והן cDNA נגזר מן ה-RNA הם מוגבר בצינור אותו. המדגם ואז לשתיים, מעובד במקביל להכין ספריות seq DNA ו- RNA. כדי להבחין בין DNA גנומי של cDNA נגזר מן ה-RNA, ד ר-seq מקבלת גישה חישובית. רצפים היכן נמצאים רק exons מדוכאים שהמפתחות בנתונים דנ א גנומי, כמו אלה יכול להיות שמקורם מן ה-DNA או RNA. 9 היתרון בגישה זו הוא כי ה-DNA ו cDNA/RNA צריך להיות פיזית מופרדים זאת על ג'ל-seq ו G & T-תת סעיף. החיסרון, לעומת זאת, היא ד ר-seq דורשת ידע א-פריורי של הגנום, transcriptome (כלומר, exons לעומת אינטרונים), לא יהיה אידיאלי עבור יישומים כגון רצף של גרעינים, שבו תעתיקים רבים עדיין אינם לגמרי משולבים, עדיין להכיל אינטרונים. 12

ההיבט הרומן של ג'ל-seq היא היכולת להפריד בין DNA ו- RNA מאות תאים המבוסס באופן בלעדי על גודל. שיטה זו דורשת שום ידע אפריורי של הגנום או transcriptome, היא חזקה נגד שחבור לא שלם, אינה מוגבלת תעתיקים פולי-adenylated. עבור יישומים שבהם חוקר יכול להתחיל עם תאים לפחות 100, ג'ל-seq מספקת גישה ישירה באמצעות חומרים נרחב זמין וזול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פתרון כימית הכנה

הערה: השלבים הבאים הם להכנת כימי הפתרונות הנדרשים בשלבים מאוחר יותר. אלה יכולים להיות גרם בצובר ומאוחסנים במשך מספר חודשים.

  1. כדי להתחיל, להכין 50 מ של מים מטוהרים, יונים על-ידי לחיטוי בתנור 254 ננומטר UV crosslinking למשך 15 דקות (15 mJ/cm2 הכולל חשיפה) לנטרל. את דנ משחיתה. מחממים עד 37 ° C לשימוש בשלבים.
  2. להפוך את 10 מ"ל של 40% סה כ (T) ו- 3.3% crosslinker (C) (29:1) לזיהוי קודמן פתרון. שוקל 3.867 g של אקרילאמיד מונומר ו- g 0.133 אינץ של bis-אקרילאמיד מונומר. לשלב ולהביא נפח עד 10 מ ל מים חמים מטוהרים, מערבולת עד התפרקה. חנות מוגן מפני אור בטמפרטורת החדר.
    הערה: מעורבבים מראש 40% T, פתרונות לזיהוי של 3.3% C (29:1) ניתן לרכוש באופן מסחרי.
  3. להפוך 10 מ"ל של 50% T, פתרון ג'ל 5% C. שוקל 4.750 g של אקרילאמיד מונומר ו- g 0.250 של bis-אקרילאמיד מונומר. לשלב ולהביא נפח עד 10 מ"ל באמצעות מים חמים מטוהרים ו מערבולת עד התפרקה. חנות מוגן מפני אור בטמפרטורת החדר.
  4. להפוך 10 מ"ל של פתרון סוכרוז 50% (w/v). להוסיף 5 g סוכרוז משורה ולהוסיף מים מטוהרים חמים עד הנפח הכולל של 10 מ"ל. מערבולת עד התפרקה, חנות בטמפרטורת החדר.
  5. להפוך את 10 מ"ל של 10% APS (w/v). להוסיף 1 g של קירור (APS) משורה. להוסיף קר (~ 4° C) טיהור מים הנפח הכולל של 10 מ"ל ו מערבולת עד התפרקה. להקפיא מיידית ב- aliquots של 200 µL.

2. ג'ל-seq קלטת פבריקציה נוספת

הערה: ג'ל-seq פותחה במקור עם קלטות זקוף (לקבלת מידע נוסף, ראה טבלה של חומרים ); עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לעבודה עם כל קלטת אלקטרופורזה ג'ל רגיל.

  1. הכנת ג'ל מבשרי שלושה צינורות פלסטיק נפרדות על-ידי הוספת ריאגנטים כמוצג להלן ב- טבלה 1. לא הוספת APS או Tetramethylethylenediamine (TEMED) עד ביים בשלבים הבאים. רכיבים מערבולת לערבב ביסודיות.
מילוי ג'ל קודמןצפיפות גבוהה ג'ל קודמןקודמן ג'ל בצפיפות נמוכה
40 %T, 3.3%C אקרילאמיד Bisacrylamide פתרוןמ ל 1.650 %T, 5 %C אקרילאמיד Bisacrylamide פתרון2.4 מ40 %T, 3.3%C אקרילאמיד Bisacrylamide פתרון0.6 מ"ל
מים יונים10.2 mLמים יונים1.0 mLמים יונים4.8 מ
פתרון סוכרוז (50% w/v)2.6 מפתרון סוכרוז (50% w/v)0.6 מ"ל
10 X טריס-בוראט-EDTAמ ל 1.610 X טריס-בוראט-EDTA0.6 מ"ל
קירור (10% w/v)104.0 ΜLקירור (10% w/v)50.0 ΜLקירור (10% w/v)39.0 ΜL
TEMED6.0 ΜLTEMED1.0 ΜLTEMED2.2 ΜL
הנפח הכולל16.1 מהנפח הכוללמ ל 4.1הנפח הכולל6.0 mL

טבלה 1. ג'ל סינתזה ריאגנטים. ריאגנטים קודמן לזיהוי ג'ל מספיק עבור ייצור של שתי מגרות.

  1. דה-גז ג'ל מונומר פתרונות על-ידי החדרת מחט דרך הכיפה של הצינור וחיבור את המחט למקום שיש בו קו ואקום של הבית. להטביע את מכלול ערכה באמבט אולטרא גבוהה ולחכות עד בועות לעצור העולה מן הנוזל לפני המעבר לשלב הבא (~ 60 שניות / צינור).
    הערה: האיכות של שואב האבק והכוח של האמבטיה אולטרה סאונד אינה קריטית כל עוד בועות ניתן לראות העולה מן הפתרון.
  2. להוסיף TEMED ו APS מילוי ג'ל קודמן ו מערבולת בקצרה. מיד להוסיף 6 מ של מילוי ג'ל למבשר שכל קלטת ג'ל על-ידי pipetting הפתרון לתוך העליון של הקלטת. השתמש micropipette 1 מ"ל כדי להוסיף למבשר בדרגות 6 כדי להימנע לשפוך. הזמן הכולל בשלב זה צריך להיות פחות מ 3 דקות.
  3. ודא שהנוזל הוא רמה על-ידי הצבת הקלטות זקופה על רמה השולחן. למלא את השארית בקלטת יונים, degassed מים. Pipette המים, שוב באמצעות במרווחים 1 מ"ל, אט-אט אל מרכז הקלטת כדי למזער את ערבוב. לאפשר הפולימר לרפא לפחות שעה אחת, עד ללון.
  4. לאחר הפולימר ריפאה, היפוך הקלטות ג'ל מעל הכיור כדי להסיר את הכיסוי מים. אקדח אוויר דחוס יכול לשמש בעדינות לייבש את הממשק על ידי פיצוץ אוויר דרך הפתח העליון בקלטת ממרחק של 6 אינץ '.
  5. להוסיף TEMED ו APS קודמן ג'ל בצפיפות גבוהה, מערבולת בקצרה. מיד להוסיף µL 320 למבשר בצפיפות גבוהה הקלטת, שוב באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. ודא שהנוזל באופן שווה ציפוי השכבה ג'ל מלוי במוזיקת את הקלטת אחורה וקדימה בסביבות 3 פעמים. שלב זה צריך לקחת פחות מ-3 דקות.
  6. למלא את השארית בקלטת יונים, degassed מים. פיפטה לאט עם פיפטה 1 מ"ל למרכז הקלטת כדי למזער את ערבוב. לאפשר הפולימר לרפא במשך 15 דקות לפחות, רצוי שעה.
  7. שוב, היפוך הקלטות ג'ל כדי להסיר את הכיסוי מים. ניתן להשתמש באוויר דחוס בעדינות לייבש את הממשק. להוסיף TEMED ו APS קודמן ג'ל בצפיפות נמוכה, מערבולת בקצרה. מיד למלא את השארית בקלטת (~1.65 מ"ל) למבשר ג'ל בצפיפות נמוכה והכנס את המסרק ג'ל.
  8. Pipette עודף של שמורת קודמן בחלק העליון של המסרק כמו זה ייקלטו בזמן הפילמור. לאפשר הפולימר לרפא לפחות 4 שעות, רצוי למשך הלילה. ג'לים ניתן לאחסן במשך שבוע או יותר במאגר של טריס-בוראט-Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (מאגר TBE).

3. משאבות הפוכה שעתוק

  1. החל השעיה של התאים של הריבית, ובעבודה של פולימראז תגובת שרשרת (PCR) למינארי, להשתמש hemocytometer או מונה אוטומטי תא הניתן לחישוב ריכוז תא. לדלל את התאים כדי ריכוז של 100 עד 1000 תאים לכל µL בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS).
    הערה: פרוטוקול זה אומתה על טווח של תאים כולל PC3, הלה ותאים העכבר בכבד.
  2. בעזרת ריאגנטים הניתנים של WTA קיט (ראה טבלה של חומרים), מיקס µL 19 פירוק המאגר, µL 1 של מעכב RNase להכין 10 X במניה פתרון התגובה המאגר. ליצור שילוב מאסטר פירוק של נפח מספיק המכילה 0.5 µL התגובה המאגר, µL 2.75 של נוקלאז מים חינם עבור כל דגימה.
  3. Pipette התליה תא לאורך 5 פעמים מחדש להשעות תאים התיישבו, ואז פיפטה µL 1 מדגם לתוך צינור חשפנות חינם נוקלאז 200 µL מחוטא ע י UV. חזור על לפי הצורך בהתאם מספר הדגימות. הקפד לכלול פקד שלילי על-ידי pipetting µL 1 של נוקלאז מים חינם במקום תאים עבור תגובה אחת. בשלב הבא, להוסיף 3.25 µL של מיקס מאסטר פירוק כל מדגם ומערבבים על ידי pipetting בעדינות לאורך 5 פעמים.
  4. מחממים הצנטרפוגה תרמי (עם מכסה מחוממת) ל- 72 מעלות צלזיוס. להוסיף 1 µL של RT פריימר 1 µL של 20 מיקרומטר hexamer אקראיים עם מתאם של WTA (יונקות-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′) כל דגימה. שמורת שפופרת אחת לפחות כפקד חיובי להכנה ספריית gDNA ולהוסיף 2 µL של מים במקום תחל.
    הערה: hexamer אקראיים עם מתאם של WTA הוא אופציונלי ויש לו השפעה מינימלית על רצף תוצאות.
  5. דגירה דגימות-72 מעלות צלזיוס הצנטרפוגה התרמי preheated במשך 3 דקות כדי lyse התאים. להסיר תאים הצנטרפוגה תרמי ומקום על קרח למשך 2 דקות. לאחסן את הפקד חיובי ב 4 ° C עד שלב 5.
  6. בעוד התאים הם lysing, ליצור נפח מספיק של שעתוק במהופך מיקס מאסטר עבור כל הדגימות RNA המכיל את היחס ריאגנט הבא: 2 µL הראשון מאגר סטרנד, 0.5 µL של תבנית מתג oligonucleotide (TSO), µL 0.25 של מעכב RNase ולאחר 1 µL של רוורס טרנסקריפטאז (100 U µL).
  7. מחממים הצנטרפוגה תרמי ל 42 º C. להוסיף µL 3.75 של מיקס מאסטר שעתוק במהופך הדגימות הנותרים, להביא את אמצעי האחסון הכולל דוגמה 10 µL. מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים.
  8. לבצע שעתוק במהופך על ידי מיד הצבת דגימות הצנטרפוגה התרמי preheated. הפעל את התוכנית הבאה: 42 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 4 ° C לנצח. זוהי נקודת עצירה בטוח.

4. ג'ל ההפרדה מדגם שחזור

  1. לנקות בזהירות ג'ל אלקטרופורזה התא באמצעות מוצר הסרת DNA. להחיל מ"ל במספר של הסוכן ניקוי נוזלי מוך חד פעמיות חינם לנגב ולנגב על פני כל המשטחים של התא ולאחר מכן למלא את החדר עם 0.5 נקי x TBE. לקבלת תוצאות מיטביות, למקם את כל המתקן בתנור 254 ננומטר UV crosslinking ולחטא במשך 15 דקות (15 mJ/cm2).
  2. הכנס את הקלטת ג'ל-seq לתא ג'ל אלקטרופורזה ונעל אותה למקום. הסר את המסרק ג'ל על ידי משיכת ישר למעלה. זזים לאט למנוע קורע את הג'ל או העתקה מכל הזרועות.
  3. מונע את הדגימות שלב 3 על קרח, שומרים מדגם אחד לפחות כפקד חיובי לדור ספריית cDNA. לאחסן את פקד זה ב 4 ° C עד שלב 6. להוסיף 2 µL של 6 X טוען לצבוע את הדגימות הנותרים, מביא את הנפח הכולל µL ~ 12. ביסודיות לערבב את הדוגמאות על-ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים.
  4. לשלב 1 µL של סולם הדנ א עם 2 µL של 6 x בטעינת צבע ו- 7 µL של מים. Pipette תערובת זו לנתיב 1 בקלטת ג'ל-seq כפקד של אלקטרופורזה. Pipette דגימות מן השלב הקודם לתוך מסלולים נפרדים בקלטת ג'ל-seq. להיות זהירים כדי למנוע זיהום בין בארות על-ידי הוספת את פיפטה באופן מלא כל טוב והסרה אותו באמצעות רק תנועה אנכית.
  5. באמצעות ספק כוח סטנדרטי ג'ל אלקטרופורזה, להחיל שדה חשמלי של 250 V על פני בקלטת ג'ל-seq במשך 30 דקות להפריד את gDNA כלאיים cDNA/RNA. לאחר שנפרדתם, להסיר את הקלטת ג'ל-seq מהתא ג'ל אלקטרופורזה ופתח את שני החצאים של קלטת מסען את הקצוות עם כלי מגרד.
  6. באמצעות אזמל, לחצי את הג'ל מתחת לשכבת בצפיפות גבוהה. למחוק את החצי המכילה מילוי ג'ל להרים אותו. עם ידך העטויה בכפפה. מקלפים בעדינות את הג'ל הנותרים ממני הקלטת על ידי גירוד זה עם שפכטל צבע או כלי דומה אחר. במקום סעיף זה של הג'ל לתוך תבשיל המכיל ~ 30 מ"ל של 0.5 x TBE עם 3 µL של ג'ל כתם.
  7. מכסה המכולה כדי למזער את photobleaching ומשרים את הג'ל תוך בעדינות טלטול המיכל למשך 5 דקות. להניח את הג'ל על ניילון נצמד ולקחת תמונת UV באמצעות מערכת תיעוד ג'ל (לקבלת פירוט נוסף ראה הפניה למעורר 13). חשיפה השני 30 בדרך כלל מייצרת תמונות ברורות. ודא שאירעה ההפרדה.
  8. להעביר את הג'ל transilluminator UV כדי להקל על ויזואליזציה של חומצות גרעין. משקפיים מתאימים UV, לאשר את תוצאות מתוך מערכת תיעוד ג'ל. GDNA צריך להיות ממוקם בתחילתה של הג'ל בצפיפות נמוכה, את cDNA-הממשק של האזורים בצפיפות נמוכה, בצפיפות גבוהה.
  9. השתמש אזמל, לגזור את האזורים של הג'ל המכילות את gDNA ואת cDNA. דוגמאות יימצאו בצורה הטובה ביותר על ידי חיתוך של 4 מ מ על ידי 10 מ מ מלבני של ג'ל; עם זאת, הצורה הגיאומטרית המדויק יהיה תלוי ג'ל אלקטרופורזה המערכת בשימוש. זכור גם לחתוך השביל נטען עם הפקד שלילי.
  10. מקם כל מקטע נכרת של הג'ל לתוך צינור רצועת באמצעות זוג הקהה פינצטה. להיזהר לא להפעיל כוח רב מדי או הג'ל יפצל לחלקים מרובים. צריך זה יקרה, פשוט לאסוף כל פיסת ולהוסיף אותו ברכבת התחתית.
  11. לטחון את הג'ל בצינור כל משתמש קצה פיפטה (200 µL פיפטה טיפים עבודה טוב) על-ידי הזזת את הטיפ פיפטה בצורה מעגלית, בתחתית הצינורית. להוסיף מים חינם נוקלאז (µL 40 לתוך הדגימות gDNA ו- µL 80 לתוך הדגימות cDNA) כל שפופרת לפני הסרת קצה פיפטה נהגו לטחון את הג'ל כדי למזער את אובדן מדגם.
  12. במקום רצועת צינורות למסיבה מערבולת בתוך 37 ° C ואז ללחוץ על 8-12 שעות. דבר זה מאפשר חומצות גרעין לנטרל את הג'ל, טבעי עוצר בנקודה עבור פרוטוקול יום זה ריבוי.
  13. Pipette את הדגימות לתוך צלחת מסנן רשת 8 מיקרומטר ולסובב את הצלחת ב 2600 x g 5 דקות לאמץ את השברים ג'ל. הרם את הצלחת מסנן רשת מן הלוח דיור, pipette את הדגימות ג'ל ללא מים לתוך צינור חדש µL 200 רצועת.
  14. להוסיף 1 µL של פרוטאז (AU 0.9/mL) כל מדגם המכיל gDNA, לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה, דגירה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחריו של איון חום ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. שלב זה הוא קריטי עבור depleting נוקליאוזומים והופך את gDNA נגיש עבור שלבי התגובה עוקבות.
  15. שימוש של מחט בקוטר 18, תחורר הפקקים של כל צינורות מדגם. מקם את הדגימות vacufuge כדי לצמצם את נפח נוזלי. דוגמאות gDNA צריך להצטמצם עד 5 µL cDNA דגימות ירד ל 10 µL.
  16. בהתאם vacufuge מספר הדגימות, הזמן הכולל אידוי משתנה בין 30 ל 60 דקות. אם אמצעי האחסון מדגם יורד מתחת האחסון המטרה, פשוט להוסיף מים חינם נוקלאז כדי להגדיל את נפח דגימה.

5. gDNA ספריית הכנה

  1. שימוש fluorometer או טכנולוגיה דומה, לכמת את ריכוז הדנ א כל מדגם gDNA משלב 4, כמו גם את הפקד חיובי משלב 3. עבור פרוטוקול מפורט עיין במדריך הפניה fluorometer. 14
  2. לדלל את הדוגמאות כדי 0.2 ng/µL של ה-DNA. בהתאם לסוג התא ההתחלתי איכות התוצאות הנדרשות, ריכוז נמוך יותר יכול עדיין לייצר ספריות בת קיימא. כמה ניסויים יידרש; עם זאת, המחברים היו הצלחה עם ספריות המתחילים 0.1 ng/µL.
  3. להשלים את הכנת ספריה gDNA לפי פרוטוקול אחסון ספריית התגובה חצי הכנה בשלב 7.

6. הכנה ספריית cDNA

  1. החל עם 10 דוגמאות cDNA µL, בקרה חיובית משלב 4, להוסיף µL 12.5 של תערובת X qPCR 2, 0.5 µL cDNA PCR פריימר 2 µL נוקלאז ללא מים.
  2. לבצע PCR thermocycler בזמן אמת באמצעות פרוטוקול הבאים: חם-start ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריו 20-30 מחזורים של 98 ° C עבור 10 s, 65 ° C 30 s ו-72 מעלות עבור אמצעי האחסון הכולל דוגמה מינימלית 3 הוא 25 µL. לנטר. את עקומות תגובת ולהפסיק ההגברה לפני ה e תגובות יוצאים השלב מעריכית (אות ליניארי עלייה לעומת מחזור מספר) כדי להימנע PCR חפצים עקב overamplification. למידע נוסף על הימנעות overamplification, עיין בסעיף הדיון של הנייר הזה, כמו גם הפניה למעורר 15.
  3. לאחר הגברה, לנקות את המוצר באמצעות מעבדתי הפיך הנייח (אלוהים אדירים) חרוזים בעקבות הפרוטוקול בשלב 8. עם סיום, המשך לשלב הבא.
  4. שימוש fluorometer או טכנולוגיה דומה, לכמת את ריכוז הדנ א כל מדגם cDNA, כמו גם את הפקד חיוביים משלב 4. לדלל את הדגימות במידת הצורך להכיל כ 0.2 ng/µL של ה-DNA. ריכוז נמוך במקצת עדיין לייצר ספריות בת קיימא. כמה ניסויים יידרש, אולם המחברים הצלחה עם ספריות המתחילים 0.1 ng/µL.
  5. שלב אופציונלי: לבצע הפרדה סטנדרטית לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה על µL 1-2 מכל סוג המוצר qPCR כדי לאמת את תגובת הדור ספריית עבד. תמונת מדגם של תוצאה מוצלחת מוצג באיור4. עבור פרוטוקול מפורט על אופן התנהלות לזיהוי בג'ל, ראה הפניה למעורר 16.
  6. להשלים את הכנת ספריית cDNA לפי ספריית הכנת ערכת חצי נפח התגובה פרוטוקול לשלב 7.

7. ספריית הכנה עם חצי נפח תגובות

  1. הכנה הספרייה כדלקמן פרוטוקול ערכת הכנה הספרייה באמצעות חצי נפח תגובות. 17 ריאגנטים כל המוזכרים בסעיף זה של הפרוטוקול הם משלב הכנת ספריה קיט (ראה טבלה של חומרים). להתחיל UV לחיטוי מספר מספיק של רצועת צינורות עבור מספר דוגמאות יעובדו.
  2. לבצע את התגובה transposase על-ידי הוספת 5 µL transposase מאגר כל שפופרת רצועת כדי לשמש וזמינותו. לאחר מכן להוסיף 2.5 µL קלט DNA ב 0.2 ng/µL (ng 0.5 סה כ) ואחריו 2.5 µL transposase. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים.
  3. דגירה ב 55 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז לקיים ב- 10 מעלות צלזיוס. לאחר המדגם מגיע ל 10 ° C, הסר אותה ממנה thermocycler ולהוסיף מיד 2.5 µL transposase עצירה מאגר כל דגימה. שומרים את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  4. הכינו את תגובת ה-PCR כדי להגביר את הדגימה transpose מטופלים על-ידי הוספת 7.5 µL ספריית ההכנה PCR מיקס, 2.5 µL של פריימר אינדקס 1 ו- 2.5 µL של פריימר אינדקס 2. אלה תחל קניינית, מסופקים על-ידי היצרן של ערכת ההכנה של הספרייה. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים.
    הערה: ודא כי שילובים ייחודיים פריימר משמשים עבור כל דגימה. ישנם 12 שונה אינדקס 1 תחל תחל שונים אינדקס 2 8, בכך ניתן לתייג באופן ייחודי עד 96 מדגמים שונים. לבחור שילוב ייחודי של צבעי יסוד כל דגימה.
  5. לבצע PCR באמצעות התוכנית הבאה thermocycler. אמצעי האחסון מדגם נמצא 25 µL.
    72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות
    95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות
    12 מחזורי:
    95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות
    72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות
    55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות
    72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות
    להחזיק ב 10 ° C
  6. לנקות את ספריות מוכן באמצעות חרוזים אלוהים אדירים בעקבות הפרוטוקול בשלב 8. הספריות לאמת באמצעות אלקטרופורזה בג'ל או של assay דומה. עיין במדריך ערכת הכנה הספרייה לקבלת פרטים לגבי אופן לאמת את ספריות. 17

8. מעבדתי הנייח הפיך חרוז ספריית ניקוי

  1. מעבדתי מחרוזת הנייח הפיך (אלוהים אדירים) צריך להיות מאוחסן ב- 1.5 mL aliquots, צריך להיות הביא לטמפרטורת החדר לפני כל שימוש. מומלץ גם להכין טרי 80% אתנול ניסוי. הפעולות הבאות מבוססות פרוטוקול חרוז אלוהים אדירים במדריך קיט של WTA. 18
  2. להוסיף 1 µl של המאגר של WTA ערכת פירוק כל מוצר ה-PCR. מערבולת החרוזים אלוהים אדירים עד אחיד מעורב, לאחר מכן להוסיף 50 µl של אלוהים אדירים חרוזים כל דגימה. לערבב על-ידי pipetting המדגם לאורך 10 פעמים, ואז דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר במשך 8 דקות.
  3. בקצרה לסובב את הדוגמאות כדי לאסוף את הנוזל מן הצד של הצינורות. מניחים את הדוגמאות על מכשיר הפרדה מגנטית ~ 5 דקות עד שהנוזל מופיע לגמרי נקי.
  4. בעוד הדגימות הן על המכשיר הפרדה מגנטית, לאט פיפטה ליד כביש תגובת שיקוע של ביטול - להיזהר שלא להפריע. את הטבעת של חרוזים על המרקע. לאחר מכן להוסיף 200 µL של 80% אתנול כל מדגם מבלי להפריע את החרוזים. המתן 30 שניות ולאחר מכן בקפידה פיפטה הנחה תגובת שיקוע. חזור על שלב זה (שטיפת אתנול) ברגע.
  5. לאפשר את הדגימות לייבוש על 30 s - 1 דקות. לא יתר לייבש את הדגימות כמו רסיסים גדולים הופכים מאוגד לצמיתות את החרוזים.
    הערה: זמן קצר יבש מומלץ כדי להבטיח שכל עקבות של אתנול יוסרו. כמויות קטנות של אתנול תישאר מאחורי הם יכול לעכב מעט תגובות במורד הזרם.
  6. להסיר את הדגימות מהמכשיר הפרדה מגנטית ולהוסיף 15 µL של מים כל דגימה כדי elute את ה-DNA של החרוזים. פיפטה למעלה ולמטה, להבטיח שהחרוזים יוסרו מן הצדדים של הצינורות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. בקצרה לסובב את הדגימות ולאחר מכן למקם אותם על המכשיר הפרדה מגנטית למשך דקה ~ 1 להופעת הפתרון ברור.
  7. בעוד הדגימות הן על המכשיר הפרדה מגנטית, לאט פיפטה למעלה תגובת שיקוע, להעביר אותו צינורות נקיים. להיזהר שלא להפריע. את הטבעת של חרוזים על המרקע. למחוק את הצינורות עם חרוזים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההפרדה הפיזית של מכוניות היברידיות gDNA הרנ"א/cDNA במכשיר ג'ל-seq להיות visualized באמצעות ג'ל פלורסנט הדמיה; תוצאה נציג מוצג באיור3. פאנל A מראה המכשיר ג'ל-seq והתחייה; הצבעים נוספה כדי להבחין בין האזורים השונים ג'ל. לוח ב' מופיע קרוב של ארבעה הפרדות שונות נעשה שימוש עבור אימות. במסלול השלישי, פקד שלילי, מייצג את הרקע ומראה שאין שום autoflourescence של הג'ל על הממשקים. אנו נטען המסלולים הראשון והשני עם ה-DNA סולמות. מסלולים אלה מראים רק להקה כהה. הממשק בין d...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם מספר שלבים קריטיים המשויך הזיוף התקן ג'ל-seq, כמו גם את הפרוטוקול עצמו. במהלך פבריקציה נוספת, אנו ממליצים החל עוביים השכבה שנקבעו עבור אזורים שונים של הג'ל. בילינו זמן משמעותי בדיקת אפשרויות ייצור שונה ומייצרת הפרוטוקול המתואר כאן ההתקנים הטוב ביותר עבור הקלטות המפורטים בטבלה של חומרים, ריאגנטים. אם חוקרים משתמשים מערכת חלופית קלטת, הם עשויים למצוא אותו צורך לעדן את אמצעי האחסון שמשמש בעת יצירת המכשירים. האתגר העיקרי ב פבריקציה נוספת היא שאם האזור ג'ל בצפיפות גבוהה גדול מדי זה יכול delaminate מקצות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KZ הינו מייסד ומנכ ל מדעי יועץ של Singlera גנומיקה inc.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מימון עבור עבודה זו היה בתנאי על-ידי באוניברסיטת סן דייגו, הלאומית למדע קרן בוגר מחקר תכנית העמיתים, NIH להעניק R01-HG007836, ועל ידי קוריאנית משרד המדע, ICT ותכנון העתיד.

גירסאות קודמות של כמה דמויות פורסמו לראשונה ב- "התקליט הזה, ג ד. et al. ג'ל-seq: הגנום כולו, רצף transcriptome על ידי סימולטני קלט נמוך-DNA ו- RNA ספריית הכנה באמצעות מחסומים הידרוג חדיר למחצה. מעבדה על שבב 17, מוריה ברטל-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " מעבדה על שבב וההתנהגותיים שימוש חוזר של דמויות בפרסום זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ריאגנטים
אקרילאמיד מונומרסיגמא אולדריץ'A8887-100G
אמוניום פרסולפטסיגמא אולדריץ'A3678-25G
אמפור XP חרוזיםבקמן קולטרA63880המכונה בטקסט חרוזי אימוביליזציה הפיכה בשלב מוצק (SPRI)
ג'ל טעינת צבע (6x)ThermoFisher מדעיR0611המכונה בטקסט כ-6X טוען צבע
אתיל אלכוהולסיגמא אולדריץ'E7023-500ML
KAPA SYBR ערכות qRT-PCR מהירות שלב אחדKapa BioSystems7959613001המכונה בטקסט 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide) Sigma Aldrich146072-100Gידוע גם בשם bis-acrylamide
NexteraXT ערכת הכנת ספריית DNA (המכונה בטקסט ערכת הכנת ספרייה)IlluminaFC-131-1024כולל: TD (המכונה בטקסט מאגר טרנספוזאז), ATM (המכונה בטקסט טרנספוזאז), NT (המכונה בטקסט כמאגר עצירת טרנספוזאז), ו-NPM (מכונה בטקסט תערובת PCR להכנת ספרייה)
מיםללא נוקלאזערכת Millipore3098
פרוטאזQiagen19155
SMART-Seq v4 (המכונה בטקסט ערכת הגברת תעתיק שלם (WTA))Takara/Clontech634888כולל: מאגר ליזה, מעכב RNase, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (המכונה בטקסט פריימר RT), 5X Ultra Low First Strand Buffer (המכונה בטקסט מאגר גדיל ראשון), SMART-Seq v4 אוליגונוקלאוטיד (המכונה בטקסט אוליגונוקלאוטיד מתג תבנית (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (המכונה בטקסט טרנסקריפטאז הפוך), ו-PCR Primer II A (המכונה בטקסט פריימר cDNA PCR)
הקסמר אקראי עם מתאם WTA IDTn/a5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
סוכרוזסיגמא אולדריץ'S0389-500G
TEMEDסיגמא אולדריץ'T9281-25 מ"ל
DNA רחוק מטהר פני השטחThermoFisher Scientific7010PK   מכונה בטקסט מוצר להסרת DNA
מאגר Tris-Borate-EDTA (ריכוז פי 10)Sigma AldrichT4415-1L
SYBR כתם ג'ל חומצת גרעין זהב (תרכיז פי 10,000 ב-DMSO)ThermoFisher ScientificS11494המכונה בטקסט כצבע ג'ל
ציוד
BD Precisionglide  מחטי מזרק, מד 18סיגמא אולדריץ'Z192554כל חומרה שווה ערך מקובלת
אמבטיה אולטרסאונד מסדרת ברנסון CPXסיגמא אולדריץ'Z769363 כל חומרה שווה ערך מקובלת
ג'ל ריקות, מיני, 1.0 מ"מThermoFisher ScientificNC2010כל חומרה שווה ערך מקובלת
פלטת סינון רשת - Corning  HTS Transwell 96 תומך חדיר היטב - 8.0 ומיקרו; m גודל נקבוביותסיגמא אולדריץ'CLS3374המכונה בטקסט צלחת מסנן רשת 8 אום
PowerPac HC ספק כוחBio-Rad1645052כל חומרה שווה ערך מקובלת
Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ33216כל חומרה שווה ערך מקובלת
ואקופוגהEppendorf22822993כל חומרה שווה ערך מקובלת
מערכת XCell SureLock Mini-CellThermoFisher ScientificEI0001כל חומרה מקבילה מקובלת
Bio-Rad CFX96 Touch בזמן אמת מערכת זיהוי PCRBio-Rad1855195 כל חומרה מקבילה מקובלת
Amersham UVC 500 Ultraviolet CrosslinkerGE Healthcare Life SciencesUVC500-115Vהופסק, כל חומרה מקבילה מקובלת
Gel Doc XR+ Gel Documentation SystemBio-Rad1708195המכונה בטקסט
Dark Reader TransilluminatorClare Chemical ResearchDR89המכונה בטקסט transilluminator UV transilluminator
  אולטרסאונד  אמבטברנסוניק1207K35כל אמבטיה אולטרסאונד שווה ערך מקובלת.
DNA קלטות רכז

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mawy, T. Single-cell sequencing. Nat Methods. 11 (1), 18(2014).
  2. Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nat Biotech. 31 (12), 1126-1132 (2013).
  3. Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA-Seq reveals non-genetic gene expression heterogeneity. Genome Biol. 14 (4), 31(2013).
  4. Ramsköld, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  6. Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  7. Hoople, G. D., et al. Gel-seq: whole-genome and transcriptome sequencing by simultaneous low-input DNA and RNA library preparation using semi-permeable hydrogel barriers. Lab Chip. 17, 2619-2630 (2017).
  8. Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nat Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
  9. Dey, S. S., Kester, L., Spanjaard, B., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Integrated genome and transcriptome sequencing of the same cell. Nat Biotechnol. 33 (3), 285-289 (2015).
  10. Gopal, A., Zhou, Z. H., Knobler, C. M., Gelbart, W. M. Visualizing large RNA molecules in solution. RNA. 18 (2), 284-299 (2012).
  11. SDS-PAGE Gel. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 087908(2015).
  12. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), at http://science.sciencemag.org/content/352/6293/1586 (2016).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  14. Qubit 3.0 Fluorometer Manual. MAN0010866. Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd (2017).
  15. Vitak, S. A., et al. Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing. Nat Methods. 14 (3), 302-308 (2017).
  16. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040 Rev B. Bio Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
  17. Illumina. Nextera ® XT DNA Library Preparation Kit. , (2017).
  18. Takara Bio USA Inc. SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing User Manual. , (2016).
  19. Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nat Protoc. 2 (3), 739-752 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Gel seqDNA RNA SequencingHydrogel MatricesLibrary PreparationGel ElectrophoresisWhole AmplificationNuclease Free WaterPolyacrylamide GelUV CrosslinkingVortex Mixer

מאמרים קשורים