Assay מבוססי לזיהוי עיצוב רב טוב ללמוד את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד

תאים ברקמות בעלי חיים ביותר הם בדרך כלל חסיד, הצמדת התאים הסמוכים וגם כדי שלהם מטריצה חוץ-תאית (ECM). המעגנה תאים ECM שלהם הוא קריטי עבור תהליכים תאיים רבים החל תנועתיות תא לתא^1,התפשטות והישרדות². Anchorage הסלולר ל ECM תלוי ECM הרכב והן נוקשות. התאים מגיבים לשינויים האחרונים על ידי באופן דינמי סידור מחדש שלהם שלד התא, התא-ECM ו תא-cell הדבקויות, אשר בתורו אנושות לשנות תא ביומכניקה ופונקציות^3,4,5,6 . ECM נוקשות יכול להשתנות בחלל (קרי, מיקום אנטומי), זמן (כלומר, הזדקנות), וכן התהליכים הקשורים pathophysiological (למשל, טרשת עורקים, סרטן, זיהומים, וכו '). למשל, מקובל כי אנדותל תאים המתגוררים על נוקשה-לעומת רך-מטריצות להפעיל כוחות מוגברת שלהם ECM, אחד את השני ולגלות מוגברת תנועתיות והתפשטות^7,8. באופן דומה, fibroblasts המתגוררים על מטריצות נוקשה להקנות את כוחות כויץ גבוהה שלהם ECM ולהראות התפשטות מוגברת, תנועתיות ו- ECM ייצור^9,10,11. למרות תא מכניקה והתגובה ECM נוקשות נחקרו בהרחבה עבור סוגי תאים שונים, הקשר בין התאים המארחים חסיד, הנוקשות של שלהם ECM, זיהומים חיידקיים הוא עדיין אינו מודע לקיומם.

ללמוד את התפקיד של נוקשות ECM באינטראקציות תא חיידקים-מארח, ל' monocytogenes (Lm) נבחר את הפתוגן מודל. Lm הוא חיידק נפוץ המועבר במזון שיכולים לגרום זיהום סיסטמי במגוון רחב של מחשבים מארחים יונקים. זה פתוגן תאיים עיצוב גבות ניתן להעביר האפיתל במעי לאיברים מרוחקים באמצעות חציית סוגים שונים של כלי הדם endothelia. אם זה מפרה את מחסום דם - מוח, Lm עלולה לגרום לדלקת קרום המוח, כאשר יחצה את השליה, זה יכול לגרום הפלה ספונטנית^12,13. Lm יכול להדביק מארח שונים סוגי תאים, באפשרותך לעשות זאת באמצעות אסטרטגיות פתוגניים ברורים. Lm זיהום נחקרה בעיקר בהקשר של תאי אפיתל, בעוד הרבה פחות ידוע על איך יכול להדביק Lm ו מעקף התאים אנדותל המצפים לומן של כלי הדם^14,15,16. יתר על כן, לא ידוע עדיין במידה רבה איך הנוקשות של ECM שבו שוכנות תאי אנדותל מודולציה היכולת של Lm לפלוש אלה בתאי המארח להתפשט. באימות Lm ומספר נוסף מינים חיידקי (קרי, parkeri ריקטסיה) לנצל שלד התא אקטין של המחשב המארח תאים הם הדביקו לשניהם לפלוש לתוך הציטופלסמה שלהם וכדי להקל על הפצת לתא^{17 , 18 , 19}. הם להשיג את זה דרך הביטוי של חלבונים המאפשרים להם להתערב עם מסלולים פלמור אקטין מארח וליצור זנבות כוכב השביט אקטין המאפשרים^16,שלהם הנעה קדימה²⁰. בעקבות זיהום, שלד התא אקטין של התא המארח צריך לארגן מחדש באופן דינמי באופן מתאפיין עדיין לא לגמרי, פוטנציאל להשפיע על ביומכניקה של התאים מארח כולל את הכוחות הפיזיקליים שהם מפעילים על ECM שלהם ועל כל אחרים. לבחון תהליכים אלה, תאי אנדותל microvascular אדם (HMEC-1) נבחרו כתאי מארח מודל שלוש סיבות: 1. תאי אנדותל ידועים להיות מאוד mechanosensitive כפי שהם נחשפים כל הזמן משתנה סימנים פיזיים²¹; 2. אסטרטגיות ש-lm מעסיקה להדביק תאי אנדותל הם עדיין אינו מודע לקיומם²²; ו- 3. HMEC-1 הם קו תא מונצחים, יכול, לפיכך, להיות בקלות תרבותי ונחשפו לבצע מניפולציות גנטיות.

זיהום חיידקי של התאים המארחים בעיקר למד כבר במבחנה על-ידי זריעת תאי זכוכית או מצעים פוליסטירן הנמצאים באופן משמעותי נוקשה מאשר ה-ECM פיזיולוגיים של רוב התאים^12,14,23. כדי לבחון את הזיהום של תאים נזרע על מטריצה נוקשות אשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית וכדי להבהיר את התפקיד של ECM נוקשות על הזיהום של תאים על ידי פתוגנים חיידקיים, עקבנו אחר גישה חדשנית המבוססת על בדיית דק hydrogels microbead-מוטבע לזיהוי של נוקשות tunable על רב טוב צלחות. החידוש של הגישה המוצעת טמון בכך שהיא מאפשרת ניטור תנאים מרובים בו זמנית עקב תבנית רב טוב שלה, כי הוא תואם עם טכניקות מרובות בשל אופן מסוים שסובסטרטים בנויות. HMEC-1 התאים היו נזרע על אלה hydrogels מצופים חלבון, אז נגוע זנים Lm להפוך פלורסנט על הפנמה או הם צורונים פלורסנט. תפקידו של ה-ECM נוקשות על זיהום הרגישות של התאים HMEC-1 המארחים הוערך על ידי cytometry זרימה. בנוסף, מיקרוסקופ immunostaining, קרינה פלואורסצנטית שימשו כדי להבדיל בין חיידקים למביטה והקפדה. לבסוף, מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM) בוצעה בהצלחה כדי לאפיין את ההשפעה של Lm חדירתו הלחצים המתיחה זה תאי אנדותל מארח להפעיל על מטריצות שלהם במהלך זיהום. וזמינותו שהוצגו ניתן לשנות בקלות כדי לאפשר יותר מחקרים על ההשפעה של ECM נוקשות על זיהום הרגישות של תאים חסיד באמצעות שורות תאים שונים או פתוגנים.

1. ייצור Hydrogels לזיהוי דו שכבתי דק (PA) על רב טוב צלחות

1. להמיס קירור (APS) מים מזוקקים הנדסה גנטית כדי להשיג ריכוז סופי של 10 גרם/mL. Aliquot, חנות הפתרון ב 4 ° C לשימוש לטווח קצר (3 שבועות).
   הערה: הפתרון שלעיל ניתן להכין מראש הידרוג פבריקציה נוספת.
2. זכוכית ההפעלה של מנות 24-ובכן
   1. תקופת דגירה לוחות זכוכית 24-ובכן עם 13 מ מ קוטר וולס (ראה טבלה של חומרים) של h 1 עם µL 500 של NaOH M 2 לכל טוב בטמפרטורת החדר.
   2. לשטוף את הבארות 1 x עם הנדסה גנטית מים ולאחר מכן להוסיף 500 µL של 2% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (ראה טבלה של חומרים) אתנול 95% לכל אחד טוב במשך 5 דקות.
   3. לשטוף את הבארות 1 x שוב עם מים ולהוסיף 500 µL של 0.5% גלוטראלדהיד מכל קידוח עבור 30 דקות לשטוף את הבארות 1 x עם מים, לייבש אותם ב 60 הלעפה תרוטרפמט עם המכסה.

איור 1 : זיהום חיידקי וזמינותו של התאים המארחים המתגוררים על hydrogels דק דו שכבתי פלורסנט חרוז-מוטבע לזיהוי (PA) של נוקשות בדרגות שונות. א coverslips זכוכית דקה עוברות שינוי כימי כדי לאפשר הידרוג המצורף. B. µL 3.6 של הרשות הפלסטינית תערובות מופקדים על תחתית זכוכית. ג. התערובת מכוסה coverslip זכוכית עגול 12 מ מ כדי לאפשר הפילמור. D. coverslip מוסר עם מזרק המחט. E-µL 2.4 של פתרון הרשות הפלסטינית עם גרגרי הוסיף על גבי השכבה התחתונה, כתרים עם coverslip זכוכית עגול. F. מאגר נוסף בתוך הבאר, coverslip מוסר. G. הקרנת UV עבור 1 h מבטיח עיקור. H. Sulfo SANPAH-המכילים פתרון נוסף על ג'לים, אשר ממוקמות מכן מתחת UV עבור 10 דקות אני. Hydrogels עם מאגר שטופים ואז מתפשט בין לילה עם קולגן אני J. הידרוג הוא equilibrated עם תא מדיה. K. התאים מארח הם נזרע. ל' Lm חיידקים נוספים לפתרון, הזיהום מסונכרן באמצעות צנטריפוגה. ז. 1 h חיידקים לאחר הפגיעה בפתרון נשטפו, הוספת מדיה בתוספת אנטיביוטיקה. N. ב- 4 שעות לאחר הפגיעה, Lm (JAT985) מתחיל ואזוריט. O. HMEC-1 תאים ינותקו מעמוד מטריקס שלהם ואת הפתרונות של העברת צינורות כדי לבצע מדידות cytometry זרימה. שימו לב בימים ובשעות המשוער עבור כל שלב של וזמינותו מסומנות גם. איור זה השתנה מ Bastounis ו- Theriot⁵⁹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

3. ייצור הידרוג לזיהוי
   הערה: ראה איור 1.
   1. להכין פתרונות מימית המכילים 3-10% של 40% מניות אקרילאמיד פתרון (ראה טבלה של חומרים) ו 0.06 - 0.6% 2% במניה bis-אקרילאמיד פתרון (ראה טבלה של חומרים) כדי לייצר hydrogels של נוקשות tunable החל 0.6 kPa ל 70 kPa. ראה טבלה 1.
      1. עבור 0.6 kPa hydrogels, מערבבים אקרילאמיד 3% עם 0.045% bis-אקרילאמיד. עבור 3 kPa hydrogels, מערבבים אקרילאמיד 5% עם 0.074% bis-אקרילאמיד. עבור 10 kPa hydrogels, מערבבים אקרילאמיד 10% עם 0.075% bis-אקרילאמיד. עבור 20 kPa hydrogels, מערבבים אקרילאמיד 8% עם 0.195% bis-אקרילאמיד. עבור 70 kPa hydrogels, מערבבים אקרילאמיד 10% עם 0.45% bis-אקרילאמיד.
         הערה: פרטים נוספים על השגת הקשיחות הידרוג הרשות הפלסטינית רצוי ניתן למצוא במקום אחר^24,25,26,27.
   2. להכין שני פתרונות מימית כל נוקשות הידרוג רצוי. להכין פתרון 1 להיות ללא חרוז פתרון 2 להכיל 0.03% 0.1-מיקרומטר קוטר ניאון מיקרו-חרוזים (ראה טבלה של חומרים).
   3. דגה פתרונות 1 ו- 2 על ידי ואקום למשך 15 דקות כדי לחסל את החמצן הידוע לעכב פלמור של הפתרונות.
   4. להוסיף פתרון 1 כדי לאפשר חניכה פלמור של 0.6% של 10 גרם/mL במלאי פתרון APS, 0.43% tetramethylethylenediamine (TEMED). לפעול מהר.
   5. להוסיף µL 3.6 של פתרון 1 למרכז של כל טוב של המנה 24-טוב (ראה צעד 1.2 עבור הכנתה).
   6. מיד לכסות את הבארות עם 12-מ מ לא מטופל coverslips מעגלית ולתת פתרון 1 לשבת 20 דקות כך זה באופן מלא polymerizes.
   7. טפח בעדינות מחט מזרק על משטח כדי ליצור קרס קטנה בקצהו כדי להקל על הסרת coverslips. הרם את coverslips באמצעות מחט מזרק.
   8. להוסיף 0.6% של הפתרון APS מניות 10 g/mL ו- 0.43% TEMED פתרון 2. רשת אלחוטית 2.4 µL של התערובת על גבי השכבה הראשונה בכל טוב של המנה 24-. טוב.
   9. לכסות 2 פתרון עם coverslips זכוכית עגול 12-מ מ דקה, בעדינות לחיצה כלפי מטה בעזרת זוג מלקחיים כדי להבטיח עובי השכבה השנייה היא מזערית. תן פתרון 2 פולימריזציה כעשרים דקות.
   10. להוסיף 500 µL של 50 מ מ HEPES pH 7.5 לכל אחד מן הבארות ולהסיר את coverslips זכוכית דקה עם מחט מזרק, מלקחיים.
4. עיקור, ציפוי קולגן ו equilibration של hydrogels לזיהוי
   1. UV-וחושפים hydrogels עבור h 1 בשכונה תרביות רקמה כדי לאפשר עיקור.
   2. להכין תערובת של 0.5% משקל/נפח sulfosuccinimidyl 6-(4 ′-azido-2 ′-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, ראה טבלה של חומרים) ב 1% דימתיל סולפוקסיד ו-50 מ"מ HEPES pH = 7.5.
   3. להוסיף 200 µL של פתרון זה על פני השטח העליון של hydrogels. משחק מהיר, חושפים אותם בפני UV (302 ננומטר) למשך 10 דקות להפעיל אותם.
   4. לשטוף את hydrogels פעמיים עם 1 מ"ל של 50 מ מ HEPES pH = 7.5. אני חוזר במידת הצורך להבטיח כי כל crosslinker עודף מוסר.
   5. חלבון-hydrogels עם µL 200 של 0.25 מ"ג/מ"ל עכברוש זנב קולגן אני (ראה טבלה של חומרים) ב- 50 מ מ של HEPES. דגירה של hydrogels, עם הפתרון קולגן עליון, ללילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: כדי למנוע התייבשות/אידוי, למקם את הלוחות רב טוב בלימה משני ולהוסיף מעבדה ניקוי רקמות ספוגה במים בפריפריה הפנימי של הבלימה.
   6. להשתמש epifluorescence או מיקרוסקופ קונפוקלי עם יעד X 40 למדידת עובי hydrogels. לעשות זאת על ידי איתור עמדות z התחתון (כאשר הוא משטח זכוכית), מובילים רבדי הידרוג (כאשר בעוצמה החרוזים פלורסנט הוא המרבי). ואז לחסר את העמדות z כדי לקבוע את הגובה.
      הערה: השתמשנו במיקרוסקופ epifluorescence הפוכה, מטרה X 40 עם מפתח נומרי 0.65 למדידת עובי hydrogels. ניתן גם לבצע מדידות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) בשלב זה כדי לאשר את הנוקשות המדויק של hydrogels (ראה איור 2).
   7. לפני זריעה התאים של ריבית על hydrogels, להוסיף 1 מ"ל של המדיה על hydrogels, דגירה אותם ב 37 הלעפה תרוטרפמט למשך 30 דקות כדי 1 h כדי להבטיח equilibration.
      הערה: הוספנו MCDB-131 לסיקור כי זה התקשורת שבו התאים מארח מודל (HMEC-1) היו תרבותי (ראה צעד 2.1 לפרטים).

איור 2: AFM מדידות של הרשות הפלסטינית הידרוג נוקשות והפצה של חרוזים. א. הנתונים מראים הצפוי האלסטיות (מידת קשיחות) של הרשות הפלסטינית hydrogels, בהתחשב בכמות של אקרילאמיד bis-אקרילאמיד בשימוש לעומת האלסטיות נמדד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (N = 5-6). אופקיות מתארים את הממוצע. לא ניתן למדוד את הנוקשות של hydrogels kPa 0.6 כי hydrogels היו מאוד רך, מודבקת לקצה AFM. B. זוהי תמונת שלב של תאים HMEC-1 confluent ומוטבעים התמונה המתאימה של החרוזים על פני מעייניו הידרוג רכה 3 kPa-PA. ה-HMEC-1 היו נזרע במשך 24 שעות ביממה-ריכוז של 4 x 10⁵ תאים לכל טוב. ג. הדמות הזאת היא אותו הדבר כמו באיור 2B אבל התאים השוכנים במחשב הידרוג הרשות הפלסטינית 70 נוקשה-kPa. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. האדם Microvascular תא אנדותל תרבות, זריעה על Hydrogels

1. תרבות HMEC-1 (אנושי, microvascular אנדותל) בתאים MCDB-131 מלא המדיה המכילה MCDB-131 מדיה בתוספת 10% סרום שור עוברית, 10 ננוגרם למ"ל של גורם הגדילה באפידרמיס, 1 µg/mL של הידרוקורטיזון, ו- 2 מ מ של L-גלוטמין (ראה טבלה של חומרים ).
2. לפצל את התרבויות confluent 1:6 כל 3-4 ימים ולשמור את התאים עד מעבר 40.
3. יום אחד לפני הניסוי, לנתק את התאים שלהם כלי התרבות באמצעות 0.25% טריפסין/EDTA. קודם לשטוף את התאים שלהם כלי תרבות 1 x עם פוספט סטרילי buffered תמיסת מלח (PBS), ולאחר מכן להוסיף את הכמות המתאימה של 0.25% טריפסין/EDTA (2 מ"ל לכל מנה 100-מ מ או 75 ס מ מבחנה 1 מ"ל לכל מאכל 60 מ מ או הבקבוק 25 ס מ), המקננת את הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות כדי לאפשר התנתקות של תאים מן המצע שלהם.
4. לנטרל את טריפסין על-ידי הוספת האחסון הרצוי של מדיה מלא MCDB-131, pipet בעדינות כדי לפרק את גושים של תאים, ולאחר מכן מקם את הפתרון לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט.
5. בעדינות מערבולת הפתרון של תאים כדי להבטיח כי התאים מופצים בצורה שווה, אז תוציא µL 20 של הפתרון, למלא בעדינות את שני תאים מתחת coverslip של hemocytometer זכוכית.
6. גלולה למטה הפתרון של תאים הכלול הצינור צנטריפוגה חרוט באמצעות צנטריפוגה 10 דקות ב 500 x g.
7. במהלך תקופת ההמתנה 10 דקות, לספור את התאים באמצעות hemocytometer. שימוש במיקרוסקופ, להתמקד קווי הרשת של hemocytometer עם יעד X 10 ולאחר מכן השתמש מונה טלי יד כדי לספור את מספר התאים אחד 1 מ"מ x 1 מ"מ מרובע.
8. להעביר את hemocytometer עוד ריבוע 1 מ"מ x 1 מ"מ, לספור את התאים שם, לחזור על התהליך פעמיים נוספות. חישוב ממוצע המדידות ארבע, ואז להכפיל את הממוצע 10⁴. הערך הסופי הוא המספר של קיימא תאים למ"ל ההשעיה תא זה הוא להיות centrifuged.
9. הסר את הנוזלים הצינור צנטריפוגה חרוט תוך הקפדה כי בגדר תא לא מופרת. Resuspend התאים בתקשורת מלאה MCDB-131-ריכוז של 4 x 10⁵ תאים/מ ל....
10. הזרע התאים ההשעיה-hydrogels על ידי קודם הסרת המדיה שבה hydrogels היו מתפשט, ולאחר מכן הוספת 1 מ"ל של התא השעיה על כל הידרוג.

3. זיהום של תאי אנדותל Microvascular אדם עם ל' monocytogenes

1. הכנה מראש
   הערה: להכין מראש את הפתרונות הבאים.
   1. סטרפטומיצין, כלורמפניקול, גנטמיצין מניות
      1. הכן 50 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין פתרונות מניות על ידי שקילה 0.5 גר' סטרפטומיצין סולפט, המסת זה לחלוטין לתוך 10 מ"ל מים הנדסה גנטית.
      2. הכן 7.5 מ"ג/מ"ל כלוראמפניקול פתרונות מניות על ידי שקילה 75 מ ג כלורמפניקול, המסת זה לחלוטין לתוך 10 מ"ל אתנול 100%.
      3. להכין 20 מ"ג/מ"ל של גנטמיצין מלאי פתרונות שקילה 0.2 גר' גנטמיצין סולפט, המסת זה לחלוטין לתוך 10 מ"ל מים הנדסה גנטית.
      4. מסנן-לעקר כל הפתרונות מניות עם מסנן מזרק 0.2-מיקרומטר ואחסן אותם ב-20 ° C לשימוש ארוך טווח (1-2 חודשים).
   2. המוח הלב אינפוזיה (BHI) פלטות אגר ומדיה
      1. אתר שתי המבחנות 1-L ולאחר להוסיף פס מגנטי מערבבים פנימה את הבקבוק כל.
      2. למדיה BHI, מוסיפים 37 גרם אבקת BHI בקבוק אחד, להוסיף מים הנדסה גנטית עד 1 ל' לערבב את הפתרון נמרצות על ידי הצבת את הבקבוק על צלחת מגנטית מערבבים עד האבקה היא התפרקה.
      3. עבור לוחות אגר BHI, להוסיף 37 גרם של אבקת BHI, 15 גר' אגר מגורען (ראה טבלה של חומרים) ב. הבקבוק השני להוסיף מים הנדסה גנטית 1 ל' מיקס הפתרון נמרצות על ידי הצבת את הבקבוק על צלחת מגנטית מערבבים עד האבקה היא התפרקה.
      4. לדפוק את המכסים של המבחנות לא חזק מדי ולא אוטוקלב הפתרונות בעזרת הנוזל הגדרה או לפי המפרט של החיטוי.
      5. הסר את הפתרון של החיטוי, ואז לקרר את הפתרון אגר-BHI 55 מעלות צלזיוס. אם המדיה BHI הבקבוקון 1 ליטר נשמרת סטרילית, ניתן להשתמש עבור עד חודש.
      6. כדי להכין החיידקים פלטות אגר-BHI, תחילה להוסיף אנטיביוטיקה, אם מתאים, הבקבוקון המכילה BHI, אגר (בהתאם זני חיידקים גדל). בקצרה לשים את הבקבוק על צלחת מגנטית מערבבים כדי לאפשר ערבוב מהיר.
         הערה: האנטיביוטיקה המשמש כאן ספיציפית זנים Lm בשימוש, אך הצורך אנטיביוטיקה יכולה לשמש BHI-אגר צלחות. הוספנו סטרפטומיצין ריכוז של µg/mL 200 ו כלורמפניקול כדי ריכוז של 7.5 µg/mL-מכיוון 10403S Lm זנים עמידים בפני סטרפטומיצין. זנים אלו היו מצומדת עם פלסמיד המכיל כלורמפניקול acetyltransferase קריאה פתוחה המסגרת, ומכאן ההתנגדות כלורמפניקול.
      7. שופכים את התערובת לתוך החיידקים פוליסטירן ס מ-10 תרבות צלחות (כ 20 מ"ל לכל צלחת). כדי להיפטר בועות, להבה המשטח העליון של הלוחות בקצרה. צלחות מגניב ללילה בטמפרטורת החדר.
      8. למחרת, לאטום את הצלחות יבש ואחסן אותם ב 4 º C.
2. זיהום של תאי אנדותל microvascular אדם עם ל' monocytogenes
   1. שלושה ימים לפני הזיהום, פס החוצה Lm להתאמץ כדי לשמש של מניה גליצרול (מאוחסן ב- 80 ° C) על צלחת אגר-BHI שמכיל 7.5 µg/mL כלוראמפניקול, 200 µg/mL של סטרפטומיצין, במידת הצורך.
      הערה: המתח כדי להיות רץ בעירום החוצה יכול להיות פראי-סוג או מוטציה, צורונים לבטא קרינה פלואורסצנטית (עבור immunostaining ש-jat1045 שימש) ולהבעת פלורסצנטיות תחת האמרגן ActA (עבור לזרום cytometry או המתיחה מיקרוסקופ כוח JAT983 או JAT985 שימשו)²².
   2. דגירה צלחות ב 37 ° C עד מושבות דיסקרטית נוצרות (ימים 1-2).
   3. יום לפני הזיהום, לגדול המתח הרצוי בין לילה, מנענע ב 150 סל ד ב 30 ° C בתקשורת BHI עם 7.5 µg/mL כלוראמפניקול (במידת הצורך).
      1. מקום 5 מ"ל של התקשורת BHI שפופרת צנטרפוגה חרוט 15-mL, להוסיף 7.5 µg/mL כלוראמפניקול (במידת הצורך), ואז לחסן מושבה בודדת מהצלחת אגר באמצעות טיפ µL 10 סטרילי.
   4. למחרת היום, בדיוק לפני זיהום, למדוד את הצפיפות האופטית של הפתרון חיידקים על 600 nm (OD600) על ידי דילול דוגמה 1:5; השתמש cuvette המכיל BHI לבד כדי לשמש מקום ריק.
   5. לדלל את תרבות לילה OD600 של 0.1, דגירה, רועד עבור 2 h ב- 30 מעלות צלזיוס, BHI בתקשורת עם 7.5 µg/mL כלוראמפניקול (במידת הצורך) כדי לאפשר לחיידקים להגיע יומן-שלב הצמיחה.
   6. למדוד את OD600 של הפתרון חיידקי, אשר צפוי להיות בסביבות 0.2 - 0.3. אם OD600 גבוהה, למהול אותו כדי 0.2 - 0.3 עם BHI לבד.
   7. קח 1 מ"ל של פתרון חיידקיים לתוך צינור microcentrifuge. . תסובב את זה למטה במשך 4 דקות ב g 2,000 x באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורת החדר הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר חיידקי ב 1 מ"ל של PBS תרביות רקמה-כיתה, בשכונה תרביות רקמה. לשטוף את החיידקים עוד פעמיים על ידי מסובב אותם למטה במשך 4 דקות ב g x 2,000 בטמפרטורת החדר. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend החיידק ב 1 מ"ל ל- PBS.
   8. להכין את תערובת זיהום על ידי ערבוב µL 10 או 50 של החיידק resuspended ב- PBS עם 1 מ"ל של MCDB-131 מדיה מלאה עבור ריבוי של זיהום (MOI; כלומר, מספר חיידקים לכל התא המארח) של-50 חיידקים לכל התא המארח או חיידקים 10 לכל התא המארח.
   9. הסר את המדיה הבארות של הצלחות 24-ובכן, כדי לשבש את hydrogels או את התאים. לשטוף את התאים 1 x 1 מ של MCDB-131 מלא מדיה ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של החיידקים מכל קידוח.
   10. להמשיך לערבב כמה זיהום (לפחות 100 µL) מצפני MOI (ראה שלב 3.3).
   11. כיסוי לצלחת עם המכסה ועוטפים את הצלחות באריזת מזון פוליאטילן כדי למנוע דליפה. מקם את הצלחות בצנטריפוגה ולסובב את הדגימות 10 דקות ב- 200 גרם x כדי לסנכרן את הפלישה. להעביר את הצלחות לתוך החממה תרביות רקמה, דגירה אותם למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
   12. לשטוף את הדגימות 4 x עם MCDB-131 מלא מדיה, להעביר אותם לתוך החממה תרביות רקמה. לאחר 30 דקות נוספות, החלף את המדיה מדיה בתוספת 20 µg/mL של גנטמיצין.
3. הנחישות של הריבוי של זיהום (MOI)
   1. במהלך הדגירה 30-מין הראשונית של התאים מארח עם החיידקים, להכין 10-fold דילולים טורי של המיקס זיהום כדי לקבוע למשרד הפנים. הפוך דילולים 10-fold על ידי ערבוב µL 100 של המיקס זיהום עם µL 900 ל- PBS 1 x (דילול 10^-1 ). לאחר מכן, מערבבים 100 µL של דילול 10^-1 עם µL 900 ל- PBS (דילול 10^-2 ).
   2. המשך עד 10^-5 לדילול מתקבל.
      הערה: כל הפתרונות צריכים להיות מעורב לפני דילול אותם, טיפים פיפטה נקי טרי אמור לשמש בכל שלב.
   3. ברגע דילולים נעשים, במקום 100 µL של 10^-2 - 10 דילולים^-5 על המרכז הלוחיות BHI/אגר/כלורמפניקול/סטרפטומיצין (במידת הצורך).
   4. לבצע מפזר מ פיפטה מזכוכית באמצעות אש לכופף את פיפטה ליצירת קרס. טובלים את פיפטה אתנול 100% עבור עיקור, ואז לשרוף האתנול עם להבה.
   5. ברגע מפזר יש מקורר, מורחים את דילולים חיידקי homogeneously על לוחות החל מ- 10^-5 הדילול ועובר לגור תערובות מרוכז יותר. דגירה הלוחות הפוך ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
   6. בהתאם צפיפות המושבה, לקבוע את מספר מושבות או את 10^-3 , 10^-4 10^-4 , או 10 צלחות דילול^-5 . לחשב למשרד הפנים כדלקמן:
      מספר מושבות × דילול גורם ÷ נפח הראשונית הוסיף = מספר CFU לכל µL
      מספר CFU לכל אמצעי אחסון × µL של תערובת חיידקים לכל טוב = מספר CFU לאדם טוב
      מספר CFU לכל טוב × אמצעי אחסון של תאים לכל טוב = מספר חיידקים בכל תא
      הערה: CFU עומד על המושבה יוצרי יחידות.
   7. ממוצע MOIs מ שתי צלחות כדי להשיג את MOIs הסופי.

4. לזרום Cytometry לכמת נוקשות מטריצה חוץ-תאית הרגישות התלויים של התאים המארחים לזיהום

1. שוקל 5 מ"ג של collagenase ומניחים אותו בתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 15-mL. להוסיף 10 מ של 0.25% טריפסין-EDTA ומערבבים אותם היטב.
2. 8 שעות לאחר הפגיעה, מסיר את המדיה מן הבארות של צלחת 24-ובכן ולשטוף הבארות 1 x עם תרביות רקמה PBS. הסר את PBS הבארות ולהוסיף 200 µL של המיקס טריפסין-EDTA/collagenase כל טוב. מקום זה החממה תרביות רקמה 10 דקות לאפשר ניתוק מלא של התאים.
3. השתמש פיפטה טריים כל טוב, pipet המיקס לאורך 8 x. להיות עדין כדי לא לפגוע בתאים. להוסיף 200 µL של התקשורת מלאה בכל טוב כדי לנטרל את טריפסין.
4. העברת הפתרון תא 400-µL של מכל קידוח לתוך צינור פוליסטירן 5-mL עם כובע מסננת תא 35-מיקרומטר (ראה טבלה של חומרים).
5. לנתח 10,000-20,000 תאים עבור דגימה על-ידי cytometry זרימה. לבצע רכישת נתונים דרך cytometry זרימה, לקבוע את אחוזי תאים נגועים לכל טוב באמצעות תוכנה הזמינים בשוק הרלוונטי. שימוש הפיזור קדימה לעומת הצד פיזור מתווה לשער את עיקר חלוקת התא סופרת.
   הערה: זה להבטיח ניתוח של תאים בודדים, לסלק פסולת או תא doublets או שלישיות.
   1. למדוד את האות פלורסצנטיות מתאי uninfected-שליטה, שער אוכלוסיית תאים נגועים למעט autofluorescence.

5. Immunostaining של חיידקים חוץ-תאית, מיקרוסקופ, עיבוד תמונה

הערה: גישה זו מלווה כדי להבדיל בין ECM-נוקשות אדהזיה חיידקי התלויים על גבי המשטח התא המארח נגד חיידקי הפנמה (הפלישה) בתוך המחשבים המארחים.

איור 4 : Immunostaining של Lm נגועה HMEC-1 תאים המתגוררים על hydrogels של נוקשות משתנות כדי להבדיל אדהזיה חיידקי נגד הפלישה. תמונות אלה להראות דוגמה ייצוגית דיפרנציאלי immunostaining מציג A. תא גרעינים (דאפי), B. כל החיידקים (GFP), ו- C. החיידקים מבחוץ (אלקסה-546). התאים HMEC-1 היו השוכנים במחשב הידרוג 3-kPa רך. החצים הצבע על חיידקים כי כבר הפנימו, כך מוצגים בלבד לערוץ הצבע הירוק. הנתונים ב- D-F מתייחסים N = 20 תמונות שנלכדו עבור התאים HMEC-1 נגוע המתגוררים על 3 רך-kPa ו 70 נוקשה-kPa hydrogelsלהראות D. החיידק הכולל לכל הגרעינים; E. החיידק למביטה לכל הגרעינים; ו F. היעילות הפלישה (היחס בין חיידקים למביטה הכולל חיידקים). אופקיות מתארים ממוצע של הנתונים. P-ערך מחושב עם הבדיקה Wilcoxon דרגה סכום שאינו פרמטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

1. 30 דקות לאחר הפגיעה, תשטוף התאים HMEC-1 נגוע JAT1045 (Lm המבטאת צורונים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)) x 4 עם המדיה.
2. לאחר לשטוף את הרביעי, לערבב את µL 1 של 1 מ"ג/מ"ל Hoechst לצבוע עם 1 מ"ל של מדיה מלא MCDB-131, להוסיף את כל טוב כתם גרעינים התאים. מקם את התאים בחממה תרביות רקמה למשך 10 דקות.
3. לשטוף את התאים 1 x עם PBS. לתקן אותם מקבע permeabilizing עבור immunostaining דיפרנציאלי עבור 20 דקות-בטמפרטורת החדר²⁸.
   הערה: מקבע מכיל 0.32 M סוכרוז, 10 מ מ MES pH 6.1, 138 מ"מ אשלגן כלורי, 3 מ מ MgCl₂, 2 מ מ EGTA, ו- 4% פורמלדהיד (מיקרוסקופ אלקטרונים כיתה).
4. לשטוף את התאים 1 x עם PBS. לחסום את הדגימות למשך 30 דקות עם אלבומין שור 5% (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS.
5. דגירה בדגימות לשעה אנטי-קשה להביןנוגדן ראשוני (ראה טבלה של חומרים) מדולל בטחונות ב- PBS המכיל 2% BSA.
6. לשטוף את הדגימות ב- PBS 3 x ואז דגירה אותם עבור h 1 עם AlexaFluor-546 נוגדנים משניים עז-נגד-ראביט (ראה טבלה של חומרים) מדולל 1:250 ב- PBS המכיל 2% BSA. לשטוף את הדגימות 3 x ב- PBS. אחסן את הדגימות 1 מ"ל של PBS עבור הדמיה.
7. תמונה ולנתח תאים למעלה מאלף לכל תנאי.
   1. עבור הדמיה, להשתמש במיקרוסקופ epifluorescence הפוכה עם מצלמת CCD (ראה טבלה של חומרים) בן 40 X אוויר תוכנית פלואוריט אוויר המטרה עם מפתח נומרי 0.6 (NA).
      הערה: הכוח נקבע על 25% ויש זמן חשיפה 100 גב המסננים מיקרוסקופ המשמש mCherry 470/525 nm, nm GFP 530/645, ולכל nm דאפי 395/460, עירור, פליטה בהתאמה. המיקרוסקופ השתמשנו היה בשליטת של קוד פתוח מיקרוסקופ תוכנה חבילת²⁹.
   2. עבור immunostaining דיפרנציאלית, לספור כל החיידקים 'ירוק' המשויכים תאים בודדים כמו חסיד. לספור חיידקים כי הן 'ירוק' 'אדום' (בגלל קשירה נוגדנים) כמו שאינם הפנימו.
      הערה: זיהינו מספר גרעינים על-ידי הפעלת קובץ script בהזמנה אישית, התוכנה CellC (ראה טבלה של חומרים) עבור ספירה של חיידקים³⁰.

6. מיקרוסקופ כוח המתיחה רב טוב, מיקרוסקופיה מתח חד שכבתי

איור 5: תאים הנגועים Lm HMEC-1 להקטין את סדר הגודל של הכוחות המתיחה הם מפעילים על ECM שלהם במהלך זיהום. פאנל A מראה את התמונה שלב, B מראה השדה דפורמציה, ג מראה המתיחה מתח שדה, ומראה D בתחום המתח תאיים של התאים HMEC-1 נגוע השוכנים במחשב הידרוג 20-kPa. סרגלי הצבע של דפורמציה מפות (מיקרומטר), של המתיחה מתח (Pa), ומפות של המתח תאיים מפות (nNµm^-1) מוצגים על החלק העליון של מפות חום. העמודות להראות בשלוש נקודות זמן נציג: 3, 8, 18 שעות לאחר הפגיעה. E-H. אותו הדבר כמו לוחות A-D , אבל עבור תאים נגועים Lm-MOI 300. התמונות של החיידק (ערוץ אדום) הם יונחו על הדימויים שלב של התאים. הקלטות TFM נוהלו על ידי הדמיה בארות מרובים בו-זמנית. גודל החלון עבור PIV היה 32 פיקסלים עם חפיפה בין 16. סרגל קנה מידה הוא 32 מיקרומטר. איור זה השתנה מ Bastounis ו- Theriot⁵⁹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

1. להכין את hydrogels הרשות הפלסטינית על צלחת 24-טוב (ראו שלב 1). זרעי HMEC-1 תאים (ראה שלב 2), להדביק אותם עם JAT983 כפי שתואר לעיל (ראה שלב 3).
2. הכן מדיום מיקרוסקופיה-לחיות על ידי שכשהם L-15 של ליבוביץ עם סרום שור עוברית 10%, 10 ננוגרם למ"ל של גורם הגדילה באפידרמיס של הידרוקורטיזון 1 μg/mL.
   הערה: L-15 כבר מכילה 2 מ מגלוטמין, כך שאין צורך להוסיף תוספת כמו במקרה של מדיה MCDB-131.
3. 4 שעות לאחר הפגיעה (כאשר JAT983 למביטה מתחיל ואזוריט), מערבבים את μL 1 של 1 מ"ג/מ"ל Hoechst לצבוע עם 1 מ"ל של מדיה מלא L-15 ולהוסיף אותו מכל קידוח כתם גרעינים התאים. המקום התאים בחממה תרביות רקמה למשך 10 דקות ולאחר מכן להחליף היטב כל התקשורת מלאה L-15 1 מ"ל של L-15 מדיה מלא בתוספת 20 µg/mL של גנטמיצין.
4. כיסוי לצלחת עם המכסה שלה, המקום אותו בתא סביבתי של מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים) equilibrated כדי הלעפה תרוטרפמט 37.
   הערה: עבור הדמיה, השתמש במיקרוסקופ epifluorescence הפוכה עם מצלמת CCD (ראה טבלה של חומרים) בן 40 X אוויר תוכנית פלואוריט אוויר המטרה עם 0.6 הערך לא ישים
5. רכוש רב ערוצית תמונות בצילום מואץ של החרוזים פלורסנט החיידק פלורסנט ולאחר שלב תמונות חדות של תאי הפונדקאי, כל 10 דקות עבור h 4 עד 12.
   הערה: עבור ההדמיה, הכוח היה מוגדר 25% ויש זמן חשיפה 100 גב המסננים מיקרוסקופ (עירור/פליטה) המשמש mCherry של GFP 470/525 nm ו 530/645 nm בהתאמה.
6. בסוף ההקלטה, להוסיף 500 µL של 10% נתרן dodecyl סולפט (מרחביות) במים בכל אחד מן הבארות.
   הערה: התאים להיות מנותקת את הידרוג, הידרוג יחזור למצבו הראשוני undeformed מאז הוא אלסטי.
7. לקחת תמונה של הידרוג ולהשתמש בו כתמונה להתייחסות undeformed.
8. לקבוע את מימדי דפורמציה של הידרוג בכל רגע ורגע של זמן באמצעות חלקיקים תמונה velocimetry (PIV)³¹, השוואת כל תמונה של הסדרה בצילום מואץ עם תמונה הפניה של הידרוג undeformed. השתמש את מידות החלון המתאים, חופפים בהתאם הניסוי.
   הערה: השתמשנו windows של 32 פיקסלים עם חפיפה בין 16 פיקסלים.
9. לחשב את הלחצים 2D המתיחה זה התאים להפעיל על הידרוג כמתואר^32,33.
10. לחשב המתח טפט מהמתחים המתיחה כאמור תיאר³⁴ על ידי פתירת המשוואות של שיווי משקל מכני לצלחת אלסטיים דקים על כוחות תגובה שיצרו את הרשות הפלסטינית הידרוג על טפט, שהן של מול סימן כדי הלחצים נמדד המתיחה.
    הערה: ראה חומר משלים 1.

7. כמותיים מיקרוסקופ זמן לשגות לתאים להעריך Extracellular-מטריקס-נוקשות התלויים ל' monocytogenes הפצתו דרך אנדותל

איור 6: נתוני זמן לשגות מיקרוסקופ כמותית של Lm הפצתו דרך monolayers HMEC-1 נזרע על מצעים עם 3-kPa ו- 70-kPa נוקשות. א לוח זה מציג עדיין תמונות של שני מוקדים נציג זיהום ב- 0, 200, 400, 600 דקות. הערוץ שלב מתארת monolayers תא HMEC-1, ומתאר הערוץ האדום Lm תאיים (ראה שלב 7 לפרוטוקול). B. חלונית זו מציגה אזור קמור המקיף את המוקד זיהום המותווים כפונקציה של הזמן. אזור המיקוד של המצב 3-kPa (אדום) גדל מהר יותר מזה של 70-kPa (ירוק). ג. לוח זה מראה שהמרחק רדיאלי ממרכז לקצה של המוקד זיהום המותווים כפונקציה של זמן עבור נציג foci זיהום גדל (אדום) monolayers HMEC-1 נזרע על הרשות הפלסטינית סובסטרטים של 3-kPa וקשיחות 70-kPa (ירוק). מהירות רדיאלית (ד ר/dt) הוא קבוע עבור התנאי 3-kPa, אבל biphasic עבור התנאי 70-kPa. ד. נתונים אלה מראים המהירות רדיאלית מינימום 200 הראשון של עשר מוקדים זיהום עצמאית. אדום (3-kPa) וירוק (70-kPa) נקודות נתונים מתארים מורדות שני מוקדים שמתואר הלוחות הקודמים. אופקיות מתארים ממוצע של הנתונים. P-ערך מחושב עם הבדיקה Wilcoxon דרגה סכום שאינו פרמטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

1. להכין את hydrogels הרשות הפלסטינית על צלחת 24-טוב (ראה שלב 1), זרע תאים HMEC-1 (ראה שלב 2), ולגדול תרבויות JAT983 לילה כפי שתואר לעיל (ראה שלב 3).
2. היום של זיהום, להכין את תערובת זיהום על ידי ערבוב 10 µL של חיידקי גלולה לכל מיליליטר מדיה מלא MCDB-131. בזהירות להסיר את המדיה הבארות של הלוחות 24-ובכן, ולהוסיף 1.9 מ של התקשורת מלאה MCDB-131 ו- 0.1 מ"ל של המיקס חיידקי מכל קידוח.
   הערה: למשרד הפנים התחתון המשמשים assay הזה יש צורך לנתח אירועים הפצתו להפעיל מן חיידק בודד פולשים בתא המארח.
3. מכסה את הצלחת עם המכסה, לאטום אותו בניילון כדי למנוע דליפה. מקם את הצלחות בצנטריפוגה ולסובב את הדגימות 10 דקות ב- 200 גרם x כדי לסנכרן את הפלישה.
4. להעביר את הצלחות לתוך החממה תרביות רקמה, דגירה אותם במשך 5 דקות.
5. לשטוף את הדגימות 4 x עם מדיה ולהעביר אותם אל החממה תרביות רקמה. לאחר דקות נוספות 5-7, החלף את המדיה מדיה בתוספת 20 µg/mL של גנטמיצין.
6. דגירה את הצלחת בחממה, בתוספת 5 שעות כדי לאפשר את המקדם actA להדליק ולנסוע הביטוי של mTagRFP פתיחת קריאה מסגרת³⁵.
7. הכן מדיום מיקרוסקופיה-לחיות על ידי שכשהם L-15 של ליבוביץ עם סרום שור עוברית 10%, 10 ננוגרם למ"ל של גורם הגדילה באפידרמיס של הידרוקורטיזון 1 µg/mL.
   הערה: L-15 כבר מכילה 2 מ מגלוטמין, כך שאין צורך להוסיף תוספת כמו במקרה של מדיה MCDB-131.
8. לערבב 1 μL של 1 מ"ג/מ"ל Hoechst לצבוע עם 1 מ"ל של מדיה מלא L-15 ולהוסיף אותו מכל קידוח כתם גרעינים התאים. המקום התאים בחממה תרביות רקמה למשך 10 דקות ולאחר מכן להחליף היטב כל התקשורת מלאה L-15 1 מ"ל של L-15 מדיה מלא בתוספת 20 µg/mL של גנטמיצין. כיסוי לצלחת עם המכסה שלה, המקום אותו בתא סביבתי של מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים) equilibrated כדי הלעפה תרוטרפמט 37.
   הערה: עבור הדמיה, מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה שימש עם מצלמת CCD (ראה טבלה של חומרים) ו- 20 X אוויר תוכנית פלואוריט אוויר המטרה עם 0.75 הערך לא ישים הכוח נקבע ל- 50% ויש זמן חשיפה 50 גב המסננים מיקרוסקופ המשמש mCherry 470/525 nm עירור, פליטה בהתאמה.
9. תמונה מספר עמדות כל 5 דקות באמצעות תכונת פוקוס אוטומטי כדי לפקח על איך Lm התפשטה monolayers HMEC-1 נזרע על משתנה נוקשות hydrogels.
   הערה: L-15 נאגרת עם HEPES, כך שאין צורך להשתמש CO₂ במהלך ההדמיה.

ECM תלויי-נוקשות הרגישות של תאים HMEC-1 לזיהום Lm:
הרשות hydrogels של נוקשות בדרגות שונות, כל משטח מצופה עם קולגן אני, נבנו על לוחות זכוכית רב טוב כפי שמתואר שלב 1 של הפרוטוקול (ראה איור 1). AFM מדידות בוצעו כדי לאשר את הנוקשות המדויק של hydrogels, כפי שתואר לעיל26,27 (ראה איור 2). מחקרים שנעשו בעבר הראו כי הציות המקומי של קרום המרתף של תאי אנדותל יכול לנוע בין 1 kPa (למשל, רקמת המוח) עד 70 kPa (למשל, אבי העורקים)36,37,38, 39 , 40. לכן, בחרנו לבחון את הזיהום של תאים HMEC-1 המתגוררים על מטריצות עם הקשיחות הבאים: 0.6 kPa, 3 kPa, 20 kPa ו 70 kPa. עבור כל הידרוג נוקשות, שש hydrogels היו מפוברק כדי להעריך את הפארמצבטית של התוצאות.

Cytometry זרימה שימש כדי להעריך את הרגישות תלויי-נוקשות ECM של תאים HMEC-1 לזיהום Lm (ראה איור 3). תאים HMEC-1 נדבקו בנגיף זן Lm (JAT985) המבטאת סמן פלורסנט לאחר הפנמה (actAp::mTagRFP), המאפשר זיהוי חיידקים תאיים היחידה (ראה דמויות 1 L - 1N). JAT985 חסרה גם ActA, הפיכת החיידק להתפשט מתא לתא, מאז ActA הכרחי להיווצרות זנב השביט אקטין והפצה חיידקי עוקבות. 7 - 8 שעות לאחר הפגיעה, זיהום התאים HMEC-1 הוערכה באמצעות cytometry זרימה. כדי להבטיח הניתוח של תאים בודדים, היה עיקר חלוקת תא ספירת מגודרת באמצעות פארווערטס לעומת הצד פיזור מגרש, ולאחר מכן צעד המגביל השני היה ביצע כדי לא לכלול תאים כי התערוכה autofluorescence (ראה דמויות 3A - 3 C ). תוצאות ראשוניות מתואר באיור 3 מראים כי זיהום HMEC-1 עם Lm הוא כ כפולה גדולה יותר עבור תאים HMEC-1 המתגוררים על נוקשות hydrogels kPa 70 לעומת התאים השוכנים במחשב hydrogels kPa 0.6 רך (ראה דמויות 3B - תלת-ממד). הרגישות לזיהום Lm מוגברת של תאים HMEC-1 המתגוררים על נוקשות לעומת מטריצות רך יכול להיות בשל: 1. גדל Lm אדהזיה על גבי HMEC-1; 2. Lm מוגבר, פלישת HMEC-1; או 3. שני הנ ל שיתוף המתרחשים. כדי לבדוק חסימות איזה השערה, היו תאים HMEC-1 נזרע על רך (3 kPa) ו hydrogels (70 kPa) נוקשות, נגוע צורונים GFP לבטא Lm (ראה דמויות 4A - 4 C). הדגימות תוקנו זמן קצר לאחר זיהום, החיידקים (adhering) חיצוני היו מוכתמים נוגדנים. באמצעות מיקרוסקופ כמותית, מצאנו כי ישנם חיידקים באופן משמעותי יותר הקפדה על HMEC-1 כאשר התאים מארח שוכנים על נוקשות לעומת ג'ל רך (ראה איור 4D). בקנה אחד עם הנתונים cytometry זרימה, יש חיידקים באופן משמעותי לנחלתו של HMEC-1 כאשר התאים מארח שוכנים על נוקשות לעומת ג'ל רך (ראה איור 4E). אולם, הפלישה היעילות (חיידקים הפנימו/סה כ מספר חיידקים) של Lm לתוך תאים HMEC-1 הוא דומה, ללא התחשבות קשיחות המצע (ראה איור 4F).

מיקרוסקופ כוח המתיחה של תאים הנגועים Lm HMEC-1:
Lm זיהום של תאים HMEC-1 יכול לשנות את ביומכניקה של תאים נגועים המארח, כולל הכוח המצורף ECM שלהם או אחד לשני, המשפיעים על תקינותם מכשול. אנחנו ביקשו להעריך זה יכול להיות המקרה באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה32 כדי לחשב את כוחות המתיחה תא-ECM ומיקרוסקופיה מתח חד שכבתי41 כדי לחשב את הכוחות tensional תאיים. איור 5 מציג מפות של דפורמציה שדה, שדה מאמץ המתיחה, המתח תאיים שדה של תאים HMEC-1 המתגורר hydrogels 20-kPa-נקודות זמן שונות לאחר הפגיעה. דמויות 5A - 5 D להפנות לתאים נגוע השליטה HMEC-1 ואילו דמויות 5E - 5 שעות יש לפנות HMEC-1 תאים נגועים Lm-ריבוי של זיהום שווה ל- 300 תא חיידקים. עבודה ראשונית זו מרמזת כי תאים נגועים HMEC-1 להפחית את סדר הגודל של התא-ECM שלהם מדגיש תאיים במהלך זיהום עם Lm, ואילו זה לא נצפית עבור תאים נגוע השליטה.

ECM תלויי-נוקשות Lm הפצתו ברחבי monolayers HMEC-1:
מיקרוסקופ זמן לשגות שימש לחקור את האפקט מטריצת קשיחות יש ב- Lm הפצתו דרך monolayers HMEC-1. כמו Lm מתפשט דרך טפט, החיידקים ליצור מוקד הזיהום הגדל כפונקציה של הזמן (ראה איור 6A ואת הסרטונים דמויות 1 ו- 2). האזור של המוקד זיהום נמדד על ידי ציור של קמור, מהקטן לגדול קמורה המצולע שמקיף את ערכה של נקודות, סביב חיידקים42. יש מדד סטנדרטי אין בשדה כדי למדוד את היעילות של ל' monocytogenes התפשטות לתא דרך טפט של התאים המארחים. כדי להעריך את יעילות כפולה, כמה יש לספור את מספר התאים המארחים המוקד זיהום41, לאחרים יש גבולות מצוירות באופן ידני סביב הקבוצה של זיהום מארח תאים43. בחרנו לצייר מצולע קמור סביב החיידקים, כי זה תהליך אוטומטי, התמדה שהמפתחות זול כדי למדוד את היעילות של התפשטות monocytogenes ל' . בעשותם כך, מצאנו ירידה קלה באזור המיקוד זיהום בתאים HMEC-1 נזרע על 70 hydrogels kPa בהשוואה לאלה נזרע על מטריצות kPa 3 (ראה איור 6B ואת הסרטונים דמויות 1 ו- 2). כדי לקבוע את קצב הצמיחה של המוקד זיהום, המרחק רדיאלי הייתה להתוות כפונקציה של הזמן על-ידי לקיחת השורש הריבועי של האזור של המוקד זיהום חילוק זה פאי. טרנספורמציה מתמטית זו מניחה כי הצורה של המוקד זיהום הוא בערך מעגלית44. כדי למדוד את המהירות של הגידול המוקד, קצב השינוי (קרי, המדרון) של המרחק רדיאלי עבור שתי מטריצות 3 - ו 70-kPa נמדדה. גישה זו מבואר כי המוקד זיהום גדל מהר יותר מונוטוני בתאים HMEC-1 נזרע על גבי 3-kPa מטריצות. עם זאת, המוקד גדל איטי באופן משמעותי (הראשון 200 דקות), מעט איטי יותר (200 עד 600 דקות) בתאים נזרע על 70-kPa מטריצות (ראה איור 6C). אכן, ניתוח של נתונים נוספים אישר כי המוקד זיהום גדל, בממוצע, כפולה לאט יותר ב- 70-kPa מטריצות, בעיקר בזמן מינימום 200 הראשונה (ראה איור 6D).

איור 3 : הרגישות תלויי-נוקשות ECM של תאים HMEC-1 Lm לפלישה נמדד באמצעות cytometry זרימה .  תאים HMEC-1 נדבקו בנגיף Lm (JAT985), הזיהום נותחה על ידי cytometry זרימה. א. לוח זה מראה צד לעומת פיזור קדימה מגרש עבור תאים HMEC-1 נציג מגיע לבאר בודדת. התפלגות בכמות גדולה של תאים נבחר באמצעות gating כדי לא לכלול פסולת (משמאל) ותא doublets או שלישיות (מימין). B. גרף זה מראה היסטוגרמה של הלוגריתם של עוצמת קרינה פלואורסצנטית Lm בכל תא עבור HMEC-1 מצופה ב kPa 0.6 רך. ג. גרף זה מראה היסטוגרמה של הלוגריתם של עוצמת קרינה פלואורסצנטית Lm בכל תא HMEC-1 מצופה על נוקשות hydrogels kPa 70. היסטוגרמות עבור N = 4-6 משכפל מוצגים בצבעים שונים. היסטוגרמה התאים בקרה uninfected הוא סגול. השער משמש להגדרת מה נגוע מוצגים באדום. למשרד הפנים הוא 100, הזיהום היה המוערך 8 שעות לאחר הפגיעה. ד. הנתונים מראים אחוז תאים נגועים HMEC-1 לעומת הנוקשות הידרוג (N = 5). אופקיות מתארים ממוצע של הנתונים. P-ערך מחושב עם הבדיקה Wilcoxon דרגה סכום שאינו פרמטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

וידאו איור 1: ההפצה של Lm תאיים (ערוץ אדום) דרך חד שכבתי תא HMEC-1 (שלב) נזרע על מצע 3-kPa. התאים היו עם תמונה של ליבוביץ L-15 מדיה (10% FBS, µg/mL 20 של גנטמיצין) בתוך תא סביבתיים equilibrated כדי הלעפה תרוטרפמט 37. התמונות נאספו כל 5 דקות. מהירות הסרט היא 15 מסגרות/ס אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

סרטון איור 2: הפצת Lm תאיים (ערוץ אדום) דרך חד שכבתי תא HMEC-1 (שלב) נזרע על מצע 70-kPa. התאים היו עם תמונה של ליבוביץ L-15 מדיה (10% FBS, µg/mL 20 של גנטמיצין) בתוך תא סביבתיים equilibrated ל- 37 מעלות צלזיוס. התמונות נאספו כל 5 דקות. מהירות הסרט היא 15 מסגרות/ס אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

טבלה 1. ההרכב של לזיהוי (PA) hydrogels של קשיות שונות. בטבלה זו, האחוז של פתרון אקרילאמיד 40% מניות, ואת האחוז במניה 2% פתרון bis-אקרילאמיד להשגת מנדנד נתון (האלסטיות, E) הם הצביעו על עמודות שונות.

חומר משלים 1. חישוב של מתח תאיים מדגיש המתיחה מחושב. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

המחברים אין לחשוף.