דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

Culturing תאי מח עצם מאתר עם ציטוקינים גרנולוציט-מקרופאג המושבה מגרה פקטור (GM-CSF) נעשה שימוש נרחב ככל שיטה לייצר נגזר מונוציט תאים דנדריטים (moDC; ידוע גם בשם DC דלקתיות) מספרים גדולים ^{1, 2,3,4,5}. תאים אלה היה שימושי ביותר במגוון רחב של מחקרים של תא דנדריטי (DC) פונקציה ^6,7,8. בדרך כלל, אלו תאים במח העצם מאתר בתרבית למשך 6-8 ימים הינם ואז משמשים למחקר של הפונקציה תא דנדריטי ⁵. תרבויות אלה היו מזמן נחשב בעיקר הומוגנית, המורכב רוב moDC הבדיל. לאחרונה, כבר ברור כי בסוף תקופה זו תרבות 6-8 יום, ישנם רבים אכן moDC, כמו גם משנה גדולה מתוך הבדיל נגזר מונוציט מקרופאגים (moMacs) ^9,10,11. מחקרים שלנו עוד יותר הרחיבו ממצאים אלה מדגימים כי קבוצות אחרות משנה של תאים פחות מפותח, כמו סימנים מקדימים moDC (moDP) ומונוציטים, יישארו בתרבויות בתדר נמוך גם לאחר 7 ימים ¹⁰. לכן, מחקרים של תאים דנדריטים (DC) פונקציה באמצעות תאים שנוצרו על-ידי מערכת זו יכול לשקף את התגובות של קבוצה רחבה יותר של סוגי תאים מאשר בעבר מוערך.

למדנו הרבה מאוד מן המחקר של GM-CSF-שנוצר moDC הנוגעים הפונקציה של תאים אלה בשלבים האחרונים של בידול ^12,13,14. עם זאת, אנו מבינים באופן משמעותי פחות על מסלול התפתחותי אלה תאים^{15, 2,16} , של איך ומתי הם מציגים ספציפי פונקציות כגון: היענות הפתוגן הקשורים מולקולרית דפוסי (PAMPs), phagocytosis, עיבוד והצגת אנטיגן ¹³ועל פעילות אנטי בקטריאלי. פרוטוקול עבור בידוד של מספרים גדולים של אבות DC מבוססת Flt3L המקובלת, מבשרי כבר דווח על ¹⁷. בידוד של אוכלוסיות שונות אלה הושג באמצעות אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE)-צבעונית תאים במח העצם (כדי לעקוב אחר תאים החלוקה) ותרבות Flt3L במשך 3 ימים. התאים היו אז דלה של תאים חיובית linage, מתמיינים קדמון לאוכלוסייה קודמן בהתבסס על הביטוי CD11c ¹⁷. גישה אחרת על ידי הקבוצה של Leenen כדי לזהות מוקדם המוצא לאגס התרבותי DC בתרבות מונחה-GM-CSF היה כדי למיין התאים בהתאם CD31 ו- Ly6C ¹⁸. המטרה הראשונית היתה ליצור שיטה דומה עבור קבלת אבות סימנים מקדימים של moDC מונחה-GM-CSF. בשל סוגי תאים מסוים שנוצר על ידי GM-CSF, שינינו את הגישה ומיון אסטרטגיה המבוססת על הביטוי של מולקולות שבאו לידי ביטוי מוקדם ומאוחר יותר שלבי ההתפתחות. בסופו של דבר קבענו את זה Ly6C, CD115 (קולטן CSF-1), CD11c היו הסמנים הטוב ביותר עבור הבחנה תא אלו סוגי ¹⁰.

כאן, אנו מציגים שיטה עבור בידוד של תאים-מספר שלבים של פיתוח לאורך מסלול של בידול מונע על ידי GM-CSF: נפוץ מיאלואידית קדמון (CMP), גרנולוציט-מקרופאג קדמון (GMP), מונוציט, נגזר מונוציט מקרופאג (MoMac), נגזר מונוציט DC (MoDC). האוכלוסייה moMac יכול להיות עוד יותר הפרדה המבוססת על רמה של מחלקה MHC II ביטוי, חשיפת האוכלוסייה (moDP) קודמן ¹⁰moDC. אנו מנצלים במהירות גבוהה תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) אסטרטגיה כדי לבודד אוכלוסיות אלה 5 מבוסס על הביטוי של Ly6C, CD115 ו- CD11c. ואז נדגים את הבדיקה של תאים אלה במבחני פונקציונלי חושף את התגובות שלהם PAMP גירוי.

כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי אובורן אוניברסיטת אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה בהתאם להמלצות המפורטות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים.

1. הכנה איסוף מוח עצם.

1. להכין 250 מ ל מדיה מלאה על-ידי הוספת פתרון של רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני עם סרום עגל עוברית 10%, 2 מ מ גלוטמין ו 50 מיקרומטר מרקפטואתנול לחלק העליון של יחידת 0.22 של הבקבוק מסנן ואקום מיקרומטר, ולהחיל על ואקום.
   הערה: בינוני מלא ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 2 חודשים.
2. הכן 70% אתנול פתרון על ידי ערבוב 350 מ ל 100% אתנול עם 150 מ סטרילי H₂O בבקבוקון 500 מ"ל.
3. צנטריפוגה set כדי 4 ° C.
4. לחטא מלקחיים, אזמל, מספריים ב-70% אתנול.
5. באמצעות פיפטה סרולוגית, הוסף 5 מ של מדיה מלאה שלוש צלחות פטרי 60 מ מ.
6. שימוש של פיפטה סרולוגית, להוסיף 30 מ של התקשורת מלאה צינור חרוטי 50 מ.

2. אוסף של תאים במח העצם מאתר

1. המתת חסד עכבר C57BL/6 על ידי הרדמה₂ CO לפי הכללים שנקבעו על-ידי המנחים אמריקאי וטרינרי רפואי האגודה (AVMA) 2013 על המתת חסד.
2. להסיר, להסיר את הרגליים האחוריות.
   1. להרוות את הרגליים האחוריות ואת הגוף עם 75% אתנול, ולבצע חתכים דרך העור סביב מפרק הירך עם מספריים רקמה מעוקל. באמצעות מלקחיים, בחוזקה לנתץ את העור מן הירך לכיוון הקרסול, חשיפת השריר. להשתמש במספריים כדי להסיר את תוספת העור.
   2. הסר את כל הרגל על ידי חיתוך דרך העצם מעל מפרק הירך/הירך.
      הערה: בנוסף חיטוי האזור, האתנול לסייע במתן חתכים נקיים, למנוע זיהום הדגימות שיער.
   3. אם הרגליים יועברו למיקום חדש עבור מח עצם קציר, להטביע את הרגליים בתקשורת מלאה.
3. עובד אבטחה סטרילי ארון, להעביר את הרגליים לאחת המנות המוכנות בעבר פטרי.
4. להשתמש במספריים לחתוך הצדיק מתחת לקרסול, ובזהירות להסיר כמה של רקמת חיבור שרירים ו אלסטית ככל האפשר. להעביר את העצם נקי הפטרי מוכן השני.
   הערה: למרות שזה לא הכרחי להסיר את כל השרירים, מדי רקמות הנותרים יכולים להקשות. להוריד את מח העצם.
5. הפרד את עצם הירך, הברך, שוקה.
   1. באמצעות מלקחיים, החזק את הרגל בברך ואתר את מח העצם.
      הערה: מח עצם צריך להיות גלוי כמו קו אדום חלש בפנים חלל העצם בחלק העליון של עצם הירך, לקראת סוף עצם השוקה.
      1. בעזרת מספריים, לבצע שלושה חתכים כדלקמן.
         1. חותכים בשוקיים מעל בה מח העצם מופיע כדי לסיים.
         2. לחתוך מתחת הברך.
         3. לחתוך קצת מעל הברך.
         4. אם עדיין מקושר מפרק הירך עצם הירך, לחתוך מתחת מפרק הירך.
      2. להחזיר הרסיסים שלושה הפטרי וחזור על התהליך הזה על הרגל השנייה.
6. ריקון מח עצם הירך, שוקה.
   1. ממלאים מזרק 10 מ"ל עם מדיה להשלים צינור חרוטי 50 מ ל, ואת המחט 23 גרם.
   2. מחזיק את העצם עם מלקחיים מעל הפטרי השלישי מוכן, להוסיף את המחט לתוך התעלה עצם ודחף מדיה דרך, לשטוף החוצה את התאים (אשר עשויות להתגלות ללא פגע "הכנס" או כמו מספר אשכולות). חזור עד אין יותר צבע ניתן לראות דרך העצם. מילוי מחדש את המזרק עם המדיה לפי הצורך.
7. למחוץ את epiphyses.
   1. אמנם עדיין בצלוחית הפטרי השני, להחזיק את הכובע הברך בחוזקה עם מלקחיים, מועכים את הברכיים עם קצה המזרק. ממשיכים עד epiphyses כבר לא אדום.
8. באמצעות המזרק, להעביר את התאים השני והשלישי הפטרי הצינור 50 מ. הפרידה את הגושים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה. לא לנסות ליצור בועות. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
9. Lyse כדוריות דם אדומות
   1. להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה סרולוגית, לסלק צניפה על ידי מצליף, ואת lyse כדוריות דם אדומות על ידי המקננת ב 1 מ"ל ACK (אמוניום כלוריד-אשלגן) פירוק מאגר עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. בעזרת פיפטה סרולוגית, להוסיף 40 מ של מאגר HBSS (הנקס מאוזנת תמיסת מלח).
10. שימוש של פיפטה סרולוגית, לסנן את התאים למרות מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
11. באמצעות פיפטה סרולוגית, להסיר תאים supernatant, תשטוף עם 40 מ"ל של התקשורת מלאה. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: בשלב זה, שושלת היוחסין לימפוציטים חיובי ניתן להסיר באמצעות FACS או עמודה מגנטית טיהור. עם זאת, לימפוציטים לא נשמרות לטווח ארוך בתרבות. למרות מספר רב של תאים חיוביים שושלת היוחסין נמצאים ב- Ly6C-CD115-האוכלוסייה מח העצם ex-vivo, כמעט כולם נעדרים ביום 5 (איור 2).
12. באמצעות פיפטה סרולוגית, הסר את תגובת שיקוע ולאחר התרבות התאים במח העצם בתקשורת מלאה עם 10 ננוגרם למ"ל של העכבר רקומביננטי GM-CSF-צפיפות של עונה 1 פרק 10⁶ תאים/מ ל....
    הערה: בדרך כלל, 4 x 10⁷ תאים הכולל ניתן לקצור לאחר פירוק תאי הדם האדומים. עם זאת, לצפות רק 2 x 10⁷ למתחילים עד 5 x 10⁷ תאים עבור תבואות מנוסים.
13. באמצעות פיפטה סרולוגית, להעביר את התאים תרביות רקמה צלחות, דגירה ב 37 ° C 5% CO₂. אם באמצעות צלחת 24-ובכן, זרע אחד עם 2 מ"ל של התא השעיה.
14. כל 48 שעות, להשתמש פיפטה סרולוגית להסיר חצי של המדיה ולהחליף עם מדיה שלם טרי ו- GM-CSF.
    הערה: תרבויות יכולה להישאר ערה עד 9 ימים. עם זאת, הרכב משתנה לאורך זמן. לקבלת מידע נוסף, ראה סעיף 3.

3. בחירת יום מיון

1. כאשר תא האוכלוסייה יצירות להשתנות לאורך זמן, בחר ביום המניבה את המספר הגבוה ביותר של התאים הרצויים.
2. עיין בטבלה 1 עבור המיון פוסט התשואה הצפויה תא לכל אחת האוכלוסיות לאחר 3, 5 ו- 7 ימים של התרבות ב- GM-CSF לכל עונה 1 פרק 10⁷ תאים.

4. צביעת אסטרטגיה

1. השתמש aliquots קטן של תאים כדי להכין דגימות הבקרה. כוללות פקד וללא רבב, דגימות הבקרה פיצוי מוכתם רק פלורסנט סוג נוגדן אחד כל אחת, ושולט זריחה-מינוס-אחד באילו נוגדנים כל נוספים. חוץ מאחד, כדי לשלוט על ידי קרינה פלואורסצנטית שאינם ספציפיים בערוץ זה. אם באמצעות תיוג עקיפה, כולל ראשי משני לבד, לבד, ואת שניהם ראשיים ומשניים.
   הערה: Phycoerythrin (PE) allophycocyanin (APC) מתויג נוגדנים לספק הפרדה ברורה עם דימום מינימלי מעל בעת השימוש בהן ביחד. עם זאת, אם fluorochrome האפשרויות מוגבלות, CD115 מתבטא ברמה נמוכה יחסית, בעוד Ly6C מתבטא ברמות גבוהות מאוד. לכן, fluorochromes בהיר רצוי עבור אנטי-CD115, fluorochromes אנטי-Ly6C הם נבחרו כדי למנוע דימום.
2. הכן 100 מ של מאגר שטיפת FACS (FWB) על ידי ערבוב 97 מ ל תמיסת פוספט buffered צוננת של Dulbecco (DPBS) עם 3 מ"ל של עגל עוברית נסיוב צינור חרוטי 50 מ ל, ולמקם באמבט קרח.
3. להשתמש על פיפטה פיפטה בעדינות, אך ביסודיות, תאים למעלה ולמטה כדי לסלק תאים חסיד באופן רופף.
4. שימוש של פיפטה סרולוגית, העברת תאים צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   1. אם נפח התאים עולה 50 מ ל, להעביר המספר הדרוש של צינורות תאים ומשלבים בשלב מוכתמים.
5. בעדינות יוצקים את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים pelleted על-ידי הוספת 30 מ של FWB עם פיפטה סרולוגית. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וחזור בכביסה.
   הערה: אם מוות תאים גבוה צפוי, תאים יכולים להישטף עם FWB עם המתחילים 0.5% עגל עוברית סרום (FCS). פעולה זו תמנע תא הצליעה.
6. להשעות, כתם תאים לפי הוראות היצרן נוגדן.
   1. להשעות 5 x 10⁷ תאים 1 מ"ל של FWB ולהוסיף 2 µg כל של אנטי-Ly6C, אנטי-CD115 המסומנת את fluorophores (של הבחירה של החוקר). לבידול נוסף CMP moDC (שתיהן Ly6C - ו CD115-), להוסיף 2 µg של נוגדנים אנטי-CD11c (CMP הם CD11c^–; moDC הם CD11c⁺). תקופת דגירה של 30 דקות על קרח.
      הערה: איור 3 נוצר באמצעות Ly6C-PE ו- CD115-APC.
7. שימוש של פיפטה סרולוגית, להוסיף 10 מ ל FWB, צנטריפוגה x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
8. בעדינות יוצקים את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים pelleted על-ידי הוספת 30 מ של FWB עם פיפטה סרולוגית. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וחזור בכביסה.
9. לפני השעיית תאים, קפיצי צינור ביסודיות כדי לסלק את גלולה. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להשהות את תאי-עונה 1 פרק 10⁷ תאים למ"ל של FWB, לסנן דרך מסנן תא 35-מיקרומטר. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר תאים מסוננים לתוך צינור פוליפרופילן, ומניחים על הקרח עד מוכנים למיון.
   הערה: אם פוליפרופילן אינו זמין, צינורות פוליסטירן חלבון מצופה (ללא שומן חלב יבש או FCS) יכול לשמש כדי להפחית את הכריכה.

5. הגדרת שערים בהתבסס על דגימות הבקרה

הערה: כדי למנוע לשבירת תאים עקב הלחץ של הנחל זרימה מהיר, השתמש זרבובית מיקרומטר 100-130 למיון התא.

1. להפעיל את פקד וללא רבב (ראה שלב 4.1) דרך סדרן התא, ולהחיל שער כדי לא לכלול את הריסות (פיזור קדמי נמוך; FSC) וגרגרים מאוד (פיזור גבוהים יחסית; חלקיקי האס).
   1. כדי לנתח רק בשלבים מאוחרים יותר (monocytes, moMac/MoDP ו- MoDC), החל gating רק לכלול תאים גדול יותר (FSC גבוהה).
   2. אם נעשה שימוש הכדאיות כתמים, השתמש ברשימות אלה כדי לא לכלול מוכתם, כלכלית אירועים (דוגמה מודגם באיור1).
2. להריץ את דגימות הבקרה ניאון יחיד סדרן התא, והתאם פיצוי לפי הצורך.
3. הפעל מדגם של המדגם התווית על-ידי ריבוי. להתבונן ארבע אוכלוסיות נפרדות: Ly6C + CD115-(Gmp), Ly6C + CD115 + (monocytes), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), ו- Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). החל שער כדי לבודד כל אחת מארבע הגדולות.
   הערה: CMPs ו- moDC לשתף את Ly6C-CD115-פנוטיפ. עם זאת, הם ניתן להבחין בהתבסס על הביטוי CD11c: CMP חוסר CD11c, ואילו MoDCs אקספרס CD11c.

6. אוסף של אוכלוסיות מבודדות

1. להכין אוסף טורפדו על ידי הוספת FCS מספיק כדי להשיג לפחות 20% ריכוז סופי כשהם מתמלאים. לדוגמה, אם משתמש מ ל צינורות, להוסיף 1 מ"ל של FCS לפני מיון, להסיר את הצינור, כאשר הוא מגיע הנפח הכולל 5 מ.
2. למניעת ספיגת מחזור ונוגדן ממברנה, שמור כל דוגמאות (מעורבב וממוינות) ב 4 ° C במהלך המיון.
   1. אם הדבר אינו אפשרי, לשמור על הצינור המכילות את התאים ניתן למיין על הקרח ככל האפשר ולהעביר aliquots בסדרן כנדרש.
   2. בנוסף, העברת ממוין דגימות קרח כל 20-30 דקות.
3. לאחר שנאסף מספר התאים הרצוי, השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר את התאים צינור חרוטי. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   1. לאשר טוהר עם מיון שלאחר ניתוח על aliquots קטן מתוך כל אוכלוסיה שנאספו.
4. הסר את תגובת שיקוע, להשעות ב 10 מ"ל של FWB, צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות חוזר עבור סכום של שני מנקי.
   הערה: זה יכול להיות קשה להסיר את כל תגובת שיקוע ללא הם מוציאים בגדר. הצמדת טיפ פיפטה קו ואקום יכול לעזור עם הסרת. אם זו אינה זמינה, הוא הציע תגובת שיקוע ייאספו בשפופרת טריים במקרה של דיסוציאציה גלולה.
5. הסר את תגובת שיקוע לאחר לשטוף את השני.
6. אם עיצוב ניסיוני של המשתמש מכתיבה התאים להיות תרבותי מחדש, בצע את השלבים 2.12 – 2.14. אחרת, אם תאים ישמש לצורך בדיקה באופן מיידי, להכין תאים לפי הנוהל הרצוי.
   הערה: דוגמה אופיינית אנליזה פונקציונלית נכללת באיור 4.

במאמץ לשמור על כמה שיותר ערוצים זמינים עבור ניתוח כתאי אפשרי, קיימא באופן שגרתי נבחרו על סמך פיזור קדימה ואת הצד, למעט אירועים קטנים מאוד, מאוד ממוקדת (שער טיפוסי מוחל על כל הנקודה מגרשים ב איור 1A). כדי לקבוע אם אסטרטגיה זו חסימה באופן אמין שלא ייכללו תאים מתים, אנחנו מוכתמים ואקטינומיצין 7-אמינו D (7-מ) (איור 1B). 7AAD כתמי DNA בתאים במתים בשל חדירות הממברנה, ו הוא נשלל על ידי התאים קיימא. הכדאיות של GM-CSF מח עצם בתרבית תאים נותחו מיד לאחר הקציר (PH) ותא תואר 1, 3 ו- 5 ניתח באופן מיידי PH היה כ- 10% של תאים חיוביים 7-מ כאשר שער FSC/האס טיפוסי היה המוחלים על תאים מבודדים טריים מן העצם מח (איור 1, שלאחר הקציר). שיעור דומה של תאים מתים היה גם נוכח ביום 1 (~ 12%) וביום 3 (~ 11%) של תרבות (איור 1, יום 1 PH ו- 3 ימים PH). ביום 5, צומצם מספר תאים מתים בתוך השער ~ 5% (איור 1, 5 ימים PH). לפיכך, שימוש כזה שער הכדאיות מתאימה בדרך כלל עבור מיון ביום 5 ואחרי. לכן, אם משתמשים מוגבלים בפרמטרים הזמינות שלהם, FSC/האס gating מתאימה בדרך כלל. עם זאת, עבור מבחני רגיש יותר (במיוחד אם הם מסתמכים על מספרי הטלפון הנייד מדויק), לשלב כתם הכדאיות (הצעה).

פרוטוקולים רבים על התפשטות של תאים דנדריטים ממליצים דלדול של שושלת היוחסין תאים חיוביים, בעיקר לימפוציטים, ממח העצם לפני תרבות 11,17. הליך זה נחשב כדי להגדיל את הטוהר של התאים החלים על בידול GM-CSF-מתווכת. בדרך כלל, תאים המבטאים סמנים של תאי T (CD3), B תאים (CD45R או CD19), תאי NK (NK1.1) עשוי להיות מרוקנים לפי בחירה חיובי באמצעות beads מגנטי או התא מיון 11,17,18. עם זאת, בהתבסס על מערכת culturing, לימפוציטים היו רחוקות התאושש או זוהה אלה מבחני. לפיכך, אנו ביקשו להעריך את תוחלת החיים של לימפוציטים בהשתתפות Ly6C-CD115-האוכלוסייה בין התאים מונחה-GM-CSF (איור 2 א). GM-CSF תרבותי מח עצם תאים (כי לא היו שושלת דלה), היו מוכתמים נוגדנים CD3, CD45R ו- NK1.1 (ב fluorophore זהה), מדי יום נמדדת cytometry זרימה (איור 2B). בתוך Ly6C-CD115-האוכלוסייה, תאים חיוביים CD3/CD45R שהתמידו בחוזקה דרך ימים 0 – 3 (איור 2B). ביום הרביעי, נשארו רק כמה CD3/CD45R חיובי תאים, עד היום 5 ו- 6, היו לא CD3/CD45R לבטא כדוריות. לפיכך, תוך 4 ימים של התרבות ב- GM-CSF, התאים חיובי שושלת היוחסין נעדרו בעיקרו של דבר, לא אותרו כל יום 5 ו-6 של תרבות.

ההרכב של התרבות תאים מונחה-GM-CSF משתנה מדי יום בבמערכת זו התאים ולפיתוח להבדיל (טבלה 1; איור 3). בנקודות זמן מוקדם, התאים הנפוץ ביותר אבות הינם סימנים מקדימים, ב מאוחר יותר פעמים רוב התאים יותר הבדיל 10. כדי לקבוע כיצד מיון בימים שונים של תרבות עשוי להשפיע על הנתיב התפתחותית עוקבות או קינטיקה, מיני בוצעו 3, 5 ו- 7 ימים PH (איור 3 א). התפתחות האוכלוסייה MoMac (Ly6C-CD115 +) ואז היה במעקב במשך 2 – 3 ימים נוספים בתרבות (איור 3B-3D).

בעת מיון 3 ימים PH, רק 40% Ly6C-CD115 + תאים ירדה CD115 ביטוי בתוך 24 שעות לאחר מיון (PS) (איור 3B). מאת 48 h PS, השבר זה היה למטה מוסדר CD115 היה 66%, והיה מאת 72 h, 70% של התאים זה פנוטיפ. היצירה פנוטיפי נשמר (~ 70-72% Ly6C - CD115-) גם לאחר עוד ימים של תרבות (נתונים לא מוצג). בעת מיון 5 ימים PH, ~ 75% של התאים היו Ly6C - CD115-, עובר במהירות למטה מוסדר CD115 בתוך 24 שעות PS, ~ 80% היו CD115 - אחרי 48 שעות בלבד. הפצה זו נשמר לאחר 72 h (איור 3C). לבסוף, כאשר הן ממוינות 7 ימים PH, למטה-רגולציה של CD115 היה גם די מהירה. בתוך 24 שעות PS, ~ 75% של תאים הייתה ביטוי CD115 ולמטה מוסדר, מגמה זו נשמר לאחר 48 שעות (דמות תלת-ממד). מעניין, כאשר מיון ביום 7, הרמה הכללית של הביטוי CD115 היה נמוך על התאים בתוך האוכלוסיה CD115 +.

לפיכך, ממצאים אלה מציינים כי קינטיקה של פיתוח הם איטיים יותר במידה מסוימת בעת מיון-יום מוקדם, כגון יום מיון 3 תאים לעומת ההתפתחות מהירה יותר ובידול נצפתה לאחר מיון ביום 5 או 7. בהתבסס על תוצאות אלו, משתמש מחפש מספר גדול של moDC צריך כנראה מיון ביום 5 או 7.

התגובה ההבשלה של DC היא מבוססת היטב 6,7,12,14. כאשר מטופלים עם מגוון רחב של פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs), DC ילדותי למעלה-לווסת את הביטוי של MHC מולקולות costimulatory, ציטוקינים פרו-דלקתיים, שיפור שלהם קיבולת תא T-הפעלת 6. עם זאת, זה פחות ברור כאשר התאים המתפתח להשיג את היכולת להגיב גירוי PAMP, איזו תכונה של DC ההבשלה הם עשוי להפגין. כדי לקבוע אשר לאוכלוסיות ממוינים להגיב לגירויים ההבשלה, כל האוכלוסייה טופלה זמן קצר לאחר מיון עם קוקטייל של PAMPs כולל פוליפוני: C, lipopolysaccharides (LPS), ו- DNA CpG לעורר קולטן דמוי-אגרה (TLR) 3 (TLR3), TLR4, TLR9, בהתאמה. התאים היו מטופלים (או לא מטופל) במשך 24 שעות ביממה, ביטוי של CD86 ושל MHCII נמדדה על ידי cytometry זרימה (איור 4A-4B). יתר על כן, ייצור IL-12p 40/70, IL-6 נמדדה ב supernatants על ידי מערך ציטוקין אליסה (איור 4C-4D).

CMPs ו- Gmp הביעו רמות נמוכות מאוד של MHC מחלקה II ו- CD86 מצב unstimulated, ואת אלה ביטוי דפוסי לא השתנה באופן משמעותי עם חשיפה במסיבת הקוקטייל PAMPs (איור 4A , 4B). כמו כן, הביטוי של מחלקה MHC II על ידי ומונוציטים היה גם נמוך ושיניתי קצת עם חשיפה PAMP (איור 4A). עם זאת, הביטוי של CD86 הייתה מתונה על ומונוציטים 24 שעות לאחר מיון, גברה עוד יותר בעקבות גירוי h 24 שעות ביממה. הביטוי הבזליים גבוה יותר של MHC מחלקה II, CD86 MoMacs, MoDCs נצפתה ואת שתי האוכלוסיות הציג של אינדוקציה חזקה של מולקולות אלה על גירוי PAMP. במונחים של MHC class II ביטוי בעקבות גירוי, היה הבדל סטטיסטי בין CMPs, Gmp, ומונוציטים, ואילו MoMacs ואת MoDCs הקים קבוצה ברורים. ובכל זאת, מבחינת הביטוי CD86, התאים CMPs ו- Gmp היו שונים מבחינה סטטיסטית יותר MoMacs ו- MoDCs. עם זאת, ומונוציטים לא היו שונים מאשר MoMacs או MoDCs.

רצינו הבא להעריך את היכולת היחסית של כל אחת חמש לייצר ציטוקינים בתגובה TLR גירוי. לפיכך, אנו לבצע וזמינותו של ציטוקינים על האוכלוסיות ממוינים לאחר תרבות נוכחות או היעדרות של אגוניסט TLR קוקטייל בשימוש מעל. התאים היו תרבותי עם הגירויים במשך 24 שעות, ולאחר מכן נאספו supernatants. הבחנו מעט מאוד IL - 12 p 40/70 או ייצור IL-6 על ידי CMPs על גירוי TLR (איור 4C-4D). האוכלוסייה השנייה, Gmp, היו מסוגלים לייצר IL-12p 40/70 (איור 4C), אך תאים אלה הפיק כמות נמוכה של IL-6 על גירוי על-ידי PAMPs (איור 4D). הרמות הגבוהות ביותר של ייצור ציטוקינים נצפו על האוכלוסיות שלושה האחרונים. ומונוציטים ו MoMacs היה דומה מאוד דפוסי מגניטודות ייצור ציטוקינים. שניהם הגדיל במידה עצומה את IL - 12 p 40/70 והגדילה בצניעות IL-6 הפקה עד גירוי (איור 4C-4D). מעניין, בנוכחות PAMPs MoDCs לא להגביר הפרשת IL-12 p 40/70; עם זאת, אוכלוסייה זו הגדיל במידה עצומה את ייצור IL-6 (איור 4C-4D). ממצאים אלה מצביעים על כי האוכלוסיות ממוינים החזיקו הפונקציות אימונולוגי שלהם אחרי הבידוד.

איור 1: התאים קיימא בתוך קדימה לעומת שער לצד פיזור. מח עצם העכבר היה תרבותי ב- GM-CSF, הכדאיות נמדדה באמצעות 7-מ (7-אמינו-ואקטינומיצין D) צביעת שלאחר הקציר (PH), 1, 3 ו- 5 ימים שלאחר הקציר. התאים קיימא (A) נבחרו על-ידי החלת שער (Viable) אשר הושמט ואירועים קטנים מאוד ממוקדת, בהתבסס על FSC האס. (B) היסטוגרמות של 7-מ מכתים להפיק של אירועים בתוך שער Viable (FSC/האס). אירועים חיוביים עבור 7-מ לציין תאים עוברים אפופטוזיס. חיצים מציינים gating תא בר קיימא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: לימפוציטים בתוך האוכלוסיה Ly6C CD115. מח עצם העכבר היה תרבותי ב- GM-CSF, סמני לימפוציטים (CD3, CD145R ו NK1.1) נותחו מדי יום על ידי cytometry זרימה. (א) תא היו מוכתמים Ly6C-PE ו- CD115-APC לזיהוי תאי-CD115-Ly6C. רביע שער הוחל בהתבסס על פקדי צבע יחיד. מגרש נקודה מדומה שנוצר מיום 0 ביטוי CD3 (B), CD45R, NK1.1 Ly6C-CD115-תאים נותחו ביום הקציר (יום 0) עד ליום 6. תא ספירת היו מנורמל למצב באמצעות תוכנת ניתוח cytometry זרימה. החץ מצביע על Ly6C-CD115 - gating. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: קינטיקה של פיתוח של Ly6C-CD115 + תאים לאחר המיון בימים שונים. (א) העכבר מח קוצרים ותרבותית ב- GM-CSF. Aliquots של תאים7 עונה 1 פרק 10 היו שנקטפו (B) 3, (ג) 5, או (ד) 7 ימים שלאחר הקציר (PH). הימים המצוין PH, Ly6C-CD115 + התאים היו ממוין מתרבות מעורבת (טרום מיון) וניתח מיד לאחר מיון (PS). תאים ממוינים היו בתרבית מחדש ב- GM-CSF, שינויים בביטוי Ly6C/CD115 נותחו מדי יום על ידי cytometry זרימה. תיבת וחץ מצביעים על שער מיון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: התבגרות והביטוי ציטוקין בעקבות גירוי TLR. התאים היו מתמיינים אוכלוסיות 5 ביום השלישי של התרבות ב- GM-CSF. הם טופלו אז עם קוקטייל של PAMPs (LPS, פולי. אני: C, ו- CpG DNA) עבור ה 24 כלומר עוצמת פלורסנט (MFI) (A) MHC class II וניתח CD86 (B) היה מיד לאחר מיון (PS) ו- h 24 שעות ביממה עם ובלי PAMPs מאת flow cytometry. קווי שגיאה לייצג סטיית התקן של ניסויים שכפל 3-5. (ג) IL - 12 p 40/70 ו- IL-6 (ד) ב- supernatants מ 3 דגימות במאגר נמדדו על ידי ציטוקינים מערך נקודה חשופה ELISA לאחר 24 שעות עם ובלי PAMPs. RLU; יחידות קלות יחסית; -/ + את נוכחותם של סמן משטח תאים עבור האוכלוסייה המיועדת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1: צפוי את המספר המינימלי והמקסימלי של תאים התאושש לאחר מיון לכל התאים7 עונה 1 פרק 10- CMP (קדמון מיאלואידית משותפת); GMP (גרנולוציט/מקרופאג קדמון) מונו (monocytes); MoMac (נגזר מונוציט מקרופאג); MoDC (נגזר מונוציט תא דנדריטי); N/a (לא זמין); Min (yield התאים המיזערי מחוץ לתאים7 עונה 1 פרק 10); מקס (yield התאים המרבי מחוץ לתאים7 עונה 1 פרק 10).

המחברים לך אין קונפליקטים לחשוף.