Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול פשוט וקל למדידת שיפור התלויים נוגדנים לזיהום על ידי Zika וירוס הבראה בנסיוב באמצעות וירוס דנגה כתב נגיפים.

תקציר

שיפור התלויים נוגדנים לזיהום הוכח לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה נגיפי קדחת דנגה. מבחני מסורתי המודדים את הקיבולת של נוגדנים או סרום כדי לשפר הידבקות שורות תאים שבידנו צריכים לסמוך על באמצעות פלט ויראלי בתקשורת ואחריו פלאק מבחני לכמת זיהום. לאחרונה, מבחני אלו בחנו דנגה זיהום בנגיף (DENV) בשורות תאים באמצעות נוגדנים fluorescently עם תוויות. שתי גישות אלה יש מגבלות שמגבילות את השימוש הנרחב של טכניקות אלה. כאן, אנו מתארים assay פשוט במבחנה באמצעות דנגה כתב ויראלי חלקיקי וירוס (RVPs) המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק ותאים K562 לבדוק נוגדנים התלויים שיפור (איד) של זיהום DENV השימוש סרום זה היה המתקבלים רזוס קופי מקוק 16 שבועות לאחר ההדבקה בנגיף Zika (ZIKV). טכניקה זו הוא אמין, כרוך מניפולציה מינימלי של תאים, אינו כרוך השימוש של וירוס המוסמכת שכפול בשידור חי, יכול להתבצע בתבנית תפוקה גבוהה כדי לקבל בדיקה כמותית באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, וזמינותו זו ניתן להתאים בקלות לבדוק נוגדנים התלויים שיפור (איד) של זיהומים נוספים flavivirus כגון נגיף קדחת צהובה (YFV), וירוס. קדחת מוח הסוסים יפני (JEEV), וירוס הנילוס המערבי (WNV) שבו זמינות RVPs וכו. הקלות של הגדרת וזמינותו, ניתוח הנתונים, ופרשנות תוצאות הופך לבצע רוב ההגדרות מעבדה.

מבוא

נוגדן התלויים שיפור (איד) של זיהום הוא תהליך לפיה תגובות נוגדנים cross-reactive חלקית המושרה על ידי serotype של וירוס משפר ספיגת של serotype נוספת של וירוס, המוביל שכפול ויראלי מוגברת viremia. אייד תועד בהרחבה דנגה זיהומים וירוס (DENV) שבו ארבע הגדולות אשר נגרמו מהזנים אליהם גם הם נפוצים. בקבוצת משנה של חולים, אייד משויכת קדחת דנגה מדמם (DHF). לאחרונה הראינו כי זיהום בנגיף (ZIKV) Zika המושרה רמות גבוהות באופן משמעותי של תגובות נוגדנים cross-reactive DENV גרם אייד של DENV חוץ גופית בתוך , סביר להניח תרמו שיפור DENV viremia in vivo^{1 , 2}. מבחני שיפור התלויים נוגדנים הם כלי חשוב כדי להעריך את הקיבולת של נוגדנים כדי לשפר את זיהום משני עם וירוסים הקשורים ואת לספק תובנות לתוך בפתוגנזה של זיהומים flavivirus ליידע פיתוח חיסונים.

וזמינותו המתוארים כאן משתמש DENV RVPs יחד עם תאים K562, כי הם בדרך כלל שבידנו לזיהום. RVPs הם שכפול מבנית כשירים DENV חלקיקים נגיפיים אשר קידוד של replicon תת-גנומית חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הבאה לידי ביטוי לאחר סבב אחד של שכפול³. ככזה, תאים נדבקים בנגיף RVPs לזרוח ירוק, ניתן בקלות להבחין באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופ. RVPs בשימוש assay זו התקבלו ממקורות מסחריים. הם יכולים, לעומת זאת, להיות שנוצר נגד וירוסים אחרים, המשמשים וזמינותו המתואר בכתב היד. בינתיים, תאים K562 הם FcγIII-קולטן-הבעת ' לוקמיה תא קו לאגד האזור Fc של נוגדנים, להידבק בנוכחות תת נטרול ריכוזים של נוגדן^4,5.

מבחני אייד שימשו בהרחבה מחקרים חוקרת את גורמי הסיכון עבור דנגה חמור וכדי ניסחו את המנגנונים של במבחנה אייד^6,7,8. וזמינותו אייד המתוארים כאן יכול בקלות ובמהירות לשמש כדי לקבוע את הקיבולת של נסיוב flow cytometry, לעומת שאר מבחני בשימוש כיום, אשר דורשים גם הקביעה של פלאק ויוצרים ולשפר במבחנה זיהום באמצעות RVPs יחידות (pfu) ורו תאים או נוגדן כתמים נגוע תאים^{6,7,8,9,10,11}, שניהם נמצאים זמן רב ודיני אינטנסיבית.

פרוטוקול

הדוגמאות סרום בשימוש כדי להדגים את הפרוטוקול המתואר כאן, התקבלו קופי מקוק רזוס שהיו שוכנו, בהתאם במדינת מקומיים, ושלמישהו אכפת הפדרלית מדיניות שיוך עבור הערכת ולדאוג הסמכה של מעבדה חיה הבינלאומי (AAALAC)-מוכר מתקן. כל ניסויים בבעלי חיים היו נבדקו ואושרו על-ידי אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש, דגימות נרכשו דרך רקמה שיתוף פרוטוקול.

1. יום 1

הערה: בצע את כל השלבים המתוארים להלן ב- cabinet אבטחה בעל דירוג זרימה שכבתית סטרילי המשמש תרביות רקמה במעבדה BSL-2.

1. להפשיר את הדוגמאות סרום בטמפרטורת החדר, להעביר µL 100 לכל דגימת נסיוב צינור סטרילי. חום הפוך ללא פעיל למשך 30 דקות ב 56° C באמבט מים או של thermomixer טמפרטורה מתכוונן. להפוך 10-fold דילולים טורי של דגימת נסיוב ועד 1:1 1:1,000 באמצעות RPMI קר-10 (RPMI עם 10% סרום שור עוברית).
2. העברת µL 10 דגימת נסיוב באופן סדרתי מדולל כל טוב של צלחת V-התחתון 96-ובכן סטרילי. כוללים שתי קבוצות של שליטה וולס, RPMI-10 עם RVPs בלבד, ללא דגימת נסיוב, ו RPMI-10 רק בלי RVPs ובלי דגימת נסיוב. להגדיר כל דגימת נסיוב ופקדים RPMI-10 ב- triplicates.
3. להסיר את קדחת דנגה-1, 2, 3 ו 4 RVPs מן המקפיא-80 ° C ו להפשיר אותם בתוך אמבט מים 37 º C. להעביר את RVPs המופשרים מיד לקרח. להשיג כ 170 µL RVPs עבור כל דגימה סרום (10 µL של בארות RVPs x 3 עבור כל בסרום (1:1, 1:10, 1: 100, 1:1, 000) 10 µL של בארות RVPs x 3 עבור כל אחד ה-RPMI-10 עם RVP רק לשלוט וולס).
4. פיפטה 10 µL של RVPs לתוך כל טוב של צלחת V-התחתון 96-ובכן המכיל את דגימת נסיוב, כדי RPMI-10 עם RVPs (ללא סרום) שליטה וולס. אל תוסיף בארות RVPs RPMI-10 בלבד (אין דגימת נסיוב, אין RVP). לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 – 10 פעמים. להוסיף 10 µL קר RPMI-10 במקום RVPs על כל RPMI-10 קר בלבד (אין דגימת נסיוב RVP אין) ובקרת בארות.
5. להעביר את הצלחת התחתונה V 96-ובכן אינקובטור, תקופת דגירה לצלחת של שעה ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%₂. בעוד צלחת V-התחתון 96-ובכן הוא המקננת, לנקות את השטח של אבטחה הקבינט עם-70% אתנול ולהפעיל את אולטרא סגול למשך 15 דקות.
6. הסר בקבוקון T75 באופן מלא confluent של תאים K562 החממה, לערבב את התאים היטב באמצעות pipet מ ל סטרילי ולאחר להעביר 5 מ של תאים צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל.
   הערה: התאים K562 הם שמרו ב- RPMI-10, subcultured-עונה 1 פרק 10⁶/mL.
7. לספור את מספר תאים על-ידי הסרת תאים µL 10 מהצינור חרוט סטרילי 15 מ"ל ומערבבים עם 10 כחול tryphan µL. לספור את התאים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים בצינור חרוט 15 מ"ל.
8. Centrifuge 15 mL חרוט עם תאים ב ~ 1,200 x g למשך 10 דקות, decant את תגובת שיקוע, resuspend תאי RPMI חמים-10-ריכוז של 80,000 µL תאים/30 של מדיה (2.66 x 10⁶ תאים /mL).
9. הסר את לוחית V-התחתון 96-ובכן של החממה (שלב 1.6), להעביר 30 µL של תאים K562 כל טוב של צלחת V-התחתון 96-ובכן, לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 – 10 פעמים. להעביר את הצלחת התחתונה V 96-ובכן אינקובטור, תקופת דגירה לצלחת של 1שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%₂.
10. לאחר המקננת עבור 1 h, הסר את לוחית V-התחתון 96-ובכן מן החממה צנטריפוגה ב ~ 1,200 x g למשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, decant המדיה מן הבארות מאת מתהפך לגמרי את הצלחת לתוך מיכל המכיל 10% מלבין.
11. לשטוף את התאים היטב כל מאת resuspending אותם ב- 125 µL של RPMI חמים-10, לערבב היטב עם פיפטה ולאחר centrifuge את הצלחת ב g ~ 1,200 x עבור 5 דק Decant התקשורת על-ידי הפעלת את הצלחת במהופך לתוך מיכל המכיל 10% מלבין. חזור על שלב זה לשטוף פעמיים.
12. לאחר הרחצה, להוסיף 100 µL חמים RPMI-10 לכל אחת, לערבב למעלה ולמטה עם pipet, דגירה את הצלחת. בשביל h 48-37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%₂.

2. יום 3

1. הסר את לוחית V-התחתון 96-ובכן המכיל 100 µL של תאים, מדיה/טוב מן החממה והעברתו אבטחה בארון. שימוש של פיפטה רב-ערוצי, לערבב התוכן של כל אחד טוב ולהעביר את התאים ואת מדיה 96 טוב U-תחתון צלחת או כדי הנקרא מראש 5 מ ל צינורות פוליפרופילן.
2. לשטוף כל טוב ב 96-ובכן V-תחתית לצלחת עם µL 100% 1 Paraformaldehyde (PFA) ב- 1-פוספט Buffered מלוחים (PBS) והעברת הבארות בהתאמה גם צלחת U-התחתון או צינורות פוליפרופילן שכותרתו מ ל 96 מ שלב 2.1 להניב סופית ריכוז של 0.5% מחברים/טוב או ברכבת התחתית. לערבב ביסודיות באמצעות פיפטה רב-ערוצי עם כיסוי לצלחת עם נייר אלומיניום, תן לזה לנוח בחממה במשך 30 דקות לתקן את התאים.
3. להכין את cytometer זרימה (ראה טבלה של חומרים לדוגמה) על-ידי הפעלת מוכתם K562 תאים כדי לכייל את הצד ופיזור קדימה יחד עם ההגדרות זריחה. הערוץ היחיד פלורסצנטיות הנדרש הוא FL1, כמו GFP היחידה ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלט מהתאים. לרכוש ~ 30, 000 – 50,000 תאים מחלון כל דגימה.
   הערה: כל cytometer זרימה היכול לקרוא פלורסצנטיות יחיד יכול לשמש עבור רכישת הנתונים, כפי תאים נגועים RVPs רק פולט קרינה פלואורסצנטית ירוק בשל נוכחותם של ה-GFP, אין ערוץ פלורסצנטיות אחרים נדרשים.

3. ניתוח נתונים

1. ניתוח נתונים רכשה ב- cytometer זרימה באמצעות תוכנות ניתוח cytometry זרימה (ראה טבלה של חומרים).
   1. ערכת בשער הראשון מבוססת על FSC-A (קדמי פיזור – אזור) לעומת FSC-H (פיזור קדימה – גובה) כדי לכלול תאים בודדים או להשמיט אוטומטית-פלורסנט doublets ניתוח¹². לאחר מכן, שער תאים ממותגת גופיה בהתבסס על האס-A (לצד פיזור – אזור) לעומת FSC-A כדי לא לכלול כל פסולת autofluorescent.
   2. לנתח האס-A לעומת תאים מגודרת FSC-A עבור הביטוי של GFP בהתבסס על האס-A vs GFP-א לקבוע את אחוז ה-GFP + תאים עבור כל דילול של הדוגמאות סרום ושליטה על-ידי הגדרת שער סביב GFP + התאים.
2. לקבוע את האחוז הממוצע של GFP + תאים עבור כל דגימה בסרום שליטה בארות על-ידי חלוקת האחוז הכולל של GFP + בתאים הבארות triplicate ע י 3.
3. לחשב קיפול-שיפור של זיהום על ידי חלוקת האחוז הממוצע של GFP + בתאים הדוגמאות סרום עבור כל דילול חלקי האחוז הממוצע של GFP + תאי ה-RPMI-10 עם RVPs (אין דוגמה סרום) שליטה וולס.
4. גרף קיפול-שיפור (ציר y) נגד דילול (ציר x), ולבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA ואחריו מבחן פוסט-הוק של Tukey להשוואות מרובות.

תוצאות

שרה מ 4 רזוס קופי מקוק היו שנאספו 16 שבועות לאחר ההדבקה עם ZIKV ונבדק את הפוטנציאל שלהם לשפר את DENV-1, 2, 3 ו 4 זיהום בתאים K562. החיות היו נגיפי ~ 1 x 10⁵ עותקים של RNA ZIKV/mL של פלסמה ביום 3 לאחר זיהום ירדו לרמות שהיו מתחת לגבול של זיהוי על ידי 7 ימים לאחר ההדבקה. Viremia לא זוהה הפלזמה-16 שבועות לאחר הפגיעה. לאחר מכן, וזמינותו RVP בוצעה, נותחו הנתונים שנאספו, כמפורט בפרוטוקול לעיל.

האסטרטגיה המגביל המשמש לזיהוי G...

דיון

Flaviviruses כגון DENV ו- ZIKV לשתף עדויות משמעותיות של הומולוגיה בחלבונים שני שלהם מבניים שאינן מבניות המייצרים נוגדנים cross-react אחד עם השני^13,14. תגובות cross-reactive נוגדנים אלה הוכחו לשפר לזיהום הן ויוו והן במבחנה עם heterologous serotype או אחרים הקשורים flaviviruses^1,2. הפוטנציאל לשיפור צלב זיהום יש השלכות משמעותיות עבור ניהול של המחלה וכן לפיתוח חיסון.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DENV 1-4 RVP	אינטגרלי מולקולרי	RVP-501
K562 תאים	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS ב-RPMI-10
פניצילין-סטרפטומיצין	MP ביו-רפואי	1670049	100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL ב-RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M
בתמיסת חומצות אמינו לא חיוניות RPMI-10 MEM (100 ופעמים;)	Sigma	M7145	1x ב-RPMI-10
נתרן פירובט	Cellegro	25-000-Cl	1mM ב-RPMI-10
L-גלוטמין	פישר MT25005CI
צלחות תחתונות V סטריליות	תומאס סיינטיפיק	333-8001-01V
BD פלקון פוליפרופילן 5 מ"ל צינורות FACS	VWR	60819-728
צלחות תחתונות U לא סטריליות	Falcon	Ref 353910	אלטרנטיבה בתפוקה גבוהה לצינורות FACS
5 מ"ל, פיפטה סטרילית, סרולוגית	דנוויל	P7127
200uL קצות	פיפטה סטרילייםדנוויל	P3020 CPS
20uL קצות פיפטה סטריליות	דנוויל	P1121
50-200uL פיפטה רב ערוצית	דנוויל	P3975-8-B
5-50uL פיפטה רב ערוצית	דנוויל	P3975-9-B
20% פורמדהיד	Tousimis	#1008B
אמבט מים	ThermoFisher	TSCOL35
Thermomixer	Eppendorf	2231000387	אלטרנטיבה לאמבטיית מים להפעלת חום
חממת CO2	ThermoFisher	13-998-213
אתנול	Sigma Aldrich	E7023
אקונומיקה נוזלית	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II ציטומטר זרימה	Becton Dikinson
אקונומיקה נוזלית	פישר NC9724348