מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

סיכום

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

תקציר

זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מייצג מודל המתעוררים עבור המחקר של חילוף החומרים. אכן, דרוזופילה יש מבנים הומולוגיים לאברים אנושיים, בעלי מאוד שנשמרת מסלולים מטבוליים, יש אורך חיים קצר יחסית המאפשר לימוד מנגנונים בסיסיים שונים בתקופה קצרה של זמן. עם זאת, מפתיע כי באחד המנגנונים חיוני לחילוף החומרים הסלולר, הנשימה מיטוכונדריאלי לא ביסודיות נבדקה במודל זה. סביר כי המדד הנשימה מיטוכונדריאלי ב דרוזופילה בדרך כלל דורש מספר רב מאוד של אנשים, התוצאות המתקבלות אינן מאוד לשחזור. כאן, מתוארת שיטה ומאפשר המידה המדויקת של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי באמצעות כמויות מינימליות של רקמה מתוך דרוזופילה. בשיטה זו, thoraxes ביתר, permeabilized באופן מכני עם מלקחיים חדה והן מבחינה כימית עם סאפונין, ומאפשר תרכובות שונות לעבור את קרום התא לווסת את הנשימה מיטוכונדריאלי. לאחר permeabilization, פרוטוקול מתבצע כדי להעריך את היכולת של מתחמי שונים של מערכת התחבורה אלקטרון (ETS) להתחמצן מצעים שונים, כמו גם תגובתם של uncoupler, מעכבי מספר. שיטה זו מציג יתרונות רבים לעומת שיטות שימוש ומשום מיטוכונדריאלי, כמו זה רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית בגלל המיטוכונדריה עדיין אינטראקציה עם רכיבים אחרים התאית, המורפולוגיה מיטוכונדריאלי כולו. יתר על כן, מדגם ההכנות מהירים יותר, ואת התוצאות המתקבלות הן מאוד לשחזור. על ידי שילוב היתרונות של דרוזופילה כמודל לחקר מטבוליזם עם הערכת הנשימה מיטוכונדריאלי, חשוב תובנות חדשות יכול להיות חשפה, במיוחד כאשר הזבובים חווים שונים סביבתי או pathophysiological תנאים.

מבוא

זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימש כאורגניזם מודל עבור מחקר גנטי עבור מעל המאה ה¹. המחקר של האורגניזם הזה הוביל לא רק ידע משמעותי על ירושה שאיי², קצב מוטציה³, הפיתוח של מערכת העצבים, את קביעת גורל התא⁴, אבל גם לאחרונה התפתחה כלי חשוב ללמוד את המנגנונים הטמון כמה מחלות כגון אלצהיימר ופרקינסון^5,6. יתר על כן, זה מודל פופולרי ללמוד את תהליך ההזדקנות, כפי שהם יכולים לגדול במספר גדול על פני תקופה קצרה של זמן יש אורך חיים קצר. הם גם בעלי מבנים הומולוגיים לאיברים אנושי, כגון לב, oenocytes (כמו hepatocyte תאי....

פרוטוקול

1. נוגדנים הכנה

1. להכין את הפתרונות הבאים לנתיחה, permeabilization של הרקמה.
   1. להכין תמיסת השימור: 2.77 מ"מ CaK₂EGTA, 7.23 מ מ K₂EGTA, 5.77 מ מ נה₂ATP, מ מ 6.56 MgCl₂, טאורין, 20 מ מ 15 מ מ נה₂phosphocreatine, imidazole 20 מ מ, dithiothreitol 0.5 מ מ, ו 50 מ מ K-MES, pH 7.1 (ניתן לאחסן ב-20 ° C).
   2. להכין סאפונין פתרון: 5 מ"ג של סאפונין ב 1 מ"ל של תמיסת השימור (להכין טרי מדי יום).
2. הכינו את הפתרונות הבאים לשקילת הנשימה.
   1. להכין נשימה בינוני: 120 מ"מ אשלגן כלורי, 5 מ מ ח'₂PO₄, 3 מ מ HEPES, 1 מ"מ EGTA, 1 מ MgCl₂ו- 0.2% BSA (w/v), pH 7....

תוצאות

עקבות נציג של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל הינו מסופק באיור2. פירובט, בנויים מוזרק בתאי יחד עם סיבי השריר permeabilized מכונים הנשימה CI-דליפה, דהיינו, כאשר המתחם מלך החוצנים הוא מגורה על ידי NADH המופק באמצעות חמצון פירובט, בנויים באמצעות מחזור חומצה tricarboxylic (CI). במהלך זה קצב נשימה, חמצן מיטוכונדריאלי נשמר בעיקר כדי לפצות על הדליפה הפרוטונים, כלומרפרוטונים חוצה מן המרחב intermembrane למטריקס מיטוכונדריאלי, כ.......

דיון

במחקר זה, מתוארת שיטה עבור הכנת הדוגמא לפני המידות של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי דרוזופילה. שיטה זו פותחה כדי להתגבר על בעיות שונות הקשורות הפרוטוקולים באמצעות ומשום מיטוכונדריאלי, בייחוד מבחינת משך מספר האנשים הדרושים. במקום לעבוד עם ומשום מיטוכונדריאלי בדרך כלל נדרש גם כמות גדולה של רקמות שהושג מאנשים שונים, ניסוי זה מתבצע על סיבי השריר permeabilized מן thoraxes של כמה דרוזופילה. ב פרוטוקול זה, רק שלושה אנשים נדרשים להציג תוצאות אופטימליות. לכן, מידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי בנקודות זמן שונות אפשרי גם ככה השגה כדי לסנכר.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מד נשימה ברזולוציה גבוהה Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, אינסברוק, אוסטריה	10022-02	ערכת מד נשימה O2K להפעלה
סט טיטרציה O2K	Oroboros Instruments, אינסברוק, אוסטריה	20820-03	מזרקי המילטון בנפחים שונים
תוכנת Datlab	Oroboros Instruments, אינסברוק, אוסטריה	20700	תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים
מלקחיים אנטי מגנטיים עדינים	VWR	82027-400
Secura225D-1S-DQE	Sartorius AG, גטינגן, גרמניה		יתרה חצי מיקרו (מופצת על ידי מספר חברות)
Drosophila melanogaster סוג פרא w1118Bloomington	Drosophila stock Center, IN, USA		br/> מצב אחסון: 24 & deg; C
אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA מצב אחסון: RT
KOH	Sigma-Aldrich	P1767	זהירות: קורוזיבי למתכות, רעילות חריפה, קורוזיה בעור, נזק חמור לעיניים, רעילות מימית חריפה. מצב אחסון: RT
CaCO3	Sigma-Aldrich	C4830	מצב אחסון: RT
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	מצב אחסון: -20 ° C
MgCl2.6H2O	Sigma-Aldrich	M9272	מצב אחסון: RT
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	מצב אחסון: RT
Na2phosphocreatine	Sigma-Aldrich	P7936	מצב אחסון: -20 & deg; C
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	מצב אחסון: RT
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632	מצב אחסון: 2-8 & deg; C
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	מצב אחסון: RT
Saponin מקליפת קווילג'ה	Sigma-Aldrich	S7900	Saponin מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: 5 מ"ג ב-1 מ"ל של תמיסת שימור. הכן טרי מדי יום.
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	מצב אחסון: RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	מצב אחסון: RT
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	מצב אחסון: RT
BSA	Sigma-Aldrich	05470	מצב אחסון: 2-8 & deg; C
Na2S2O4	Sigma-Aldrich	157953	נתרן דיתיוניט. זהירות: חומרים ותערובות לחימום עצמי, רעילות חריפה, רעילות מימית חריפה רעילות מימית כרונית. מצב אחסון: RT
נתרן פירובט	סיגמא-אולדריץ'	P2256	פירובט מצב אחסון: 2-8 ו-deg; הכנת תמיסת C : במי MilliQ. הכן טרי מדי יום.
L-(-)-חומצה מאלית	Sigma-Aldrich	M1000	Malate מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: במי MilliQ. מנטרלים עם KOH ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
אדנוזין 5'-דיפוספט מונופוטסיום מלח הידרט	Sigma-Aldrich	A5285	ADP מצב אחסון: -20 & deg; הכנת תמיסת C : במי MilliQ. מנטרלים עם KOH ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
ציטוכרום c מלב סוסים	Sigma-Aldrich	C7752	ציטוכרום c מצב אחסון: -20 & deg; הכנת תמיסת C : במי MilliQ. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380	Proline מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: במי MilliQ. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
נתרן סוקסינט דו-בסיסי הקסהידראט	סיגמא-אולדריץ'	S2378	סוקסינט מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: במי MilliQ. לנטרל עם HCl ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
sn-גליצרול 3-פוספט ביס(ציקלוהקסילאמוניום) מלח	סיגמא-אולדריץ'	G7886	גליצרול-3-פוספט מצב אחסון: -20 & deg; הכנת תמיסת C : במי MilliQ. לנטרל עם HCl ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי)פנילהידרזון	סיגמא-אולדריץ'	C2920	FCCP. אזהרה: רעילות חריפה, רגישות בעור, רעילות מים כרונית. מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: באתנול מוחלט. יש לאחסן בבקבוקוני זכוכית בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
רוטנון	סיגמא-אולדריץ'	R8875	זהירות: רעילות חריפה, גירוי בעור, גירוי בעיניים, רעילות איברי מטרה ספציפיים (מערכת הנשימה), רעילות מימית חריפה, רעילות מימית כרונית. הכנת תמיסה: באתנול מוחלט. יש לאחסן בבקבוקונים כהים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
חומצה מלונית	סיגמא-אולדריץ'	M1296	מלונט. אזהרה: רעילות חריפה, נזק חמור לעיניים. מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: במי MilliQ. לנטרל עם KOH. הכן טרי מדי יום.
אנטימיצין A מStreptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A. זהירות: רעילות חריפה, רעילות מימית חריפה, רעילות מימית כרונית. מצב אחסון: -20 ו-deg; הכנת תמיסת C : באתנול מוחלט. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine	Sigma-Aldrich	T7394	TMPD מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: במי MilliQ. יש לאחסן בבקבוקונים כהים בכתובת  -20 מעלות צלזיוס.
(+)-נתרן L-אסקורבט	סיגמא-אולדריץ'	A4034	אסקורבט מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: במי MilliQ. יש לאחסן בבקבוקונים כהים בכתובת  -20 מעלות צלזיוס.
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002	נתרן אזיד. אזהרה: רעילות חריפה (דרך הפה והעור), רעילות של איברי מטרה ספציפיים (מוח), רעילות מימית, רעילות מימית כרונית.  הכנת תמיסה: במי MilliQ. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

<