Method Article

בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה

DOI:

10.3791/57386

⸱

May 2nd, 2018

 ,  , 
1Department of Animal Health, Universidad Complutense de Madrid, 2Visavet Health Surveillance Centre, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Zoology, University of Oxford, 4Department of Microbiology, Hospital Universitario Ramon y Cajal (IRYCIS) and CIBERESP

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נציג של השיטה הניסיונית כדי לבחון את התפקיד של פלסמידים multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלסמידים multicopy נפוצים מאוד אאוקריוטים אך תפקידם באבולוציה חיידקי נשאר ממעטים להבין. לאחרונה הראינו כי העלייה במספר עותק גנטי בכל תא שסופקו על-ידי פלסמידים multicopy עלול להאיץ את האבולוציה של גנים פלסמיד מקודד. בעבודה זו, אנו מציגים מערכת ניסויית לבחון את היכולת של פלסמידים multicopy כדי לקדם את ג'ין האבולוציה. באמצעות שיטות בביולוגיה מולקולרית פשוטה, ואנחנו נבנה מערכת מודל שבו שניתן להוסיף של גנים עמידות לאנטיביוטיקה Escherichia coli MG1655, הכרומוזום או על פלסמיד multicopy. אנו משתמשים בגישה ניסויית האבולוציה כדי להפיץ זנים שונים תחת הגדלת ריכוזים של אנטיביוטיקה, אנו מודדים את ההישרדות של אוכלוסיות חיידקים לאורך זמן. הבחירה של המולקולה לאנטיביוטיקה ואת הגן ההתנגדות היא הגן יכול להתייעץ רק התנגדות באמצעות הרכישה של מוטציות. גישה זו "הצלה אבולוציונית" מספק שיטה פשוטה כדי לבחון את הפוטנציאל של פלסמידים multicopy לקדם הרכישה של עמידות לאנטיביוטיקה. בשלב הבא של מערכת ניסויית, מאופיינים הבסיסים מולקולרית של עמידות לאנטיביוטיקה. כדי לזהות מוטציות אחראי על הרכישה של עמידות לאנטיביוטיקה אנו משתמשים עמוק רצפי DNA של דגימות המתקבל באוכלוסיות שלמות, שיבוטים. לבסוף, כדי לאשר את התפקיד של מוטציות בגן שנבחנה, אנחנו לשחזר אותם על רקע הורים ובדוק את ההתנגדות פנוטיפ של זנים וכתוצאה מכך.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים תהיה בעיה בריאות ור1. ברמה הבסיסית, ההתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים פתוגניים היא דוגמא פשוטה של אבולוציה על ידי הברירה הטבעית2,3. במילים פשוטות, השימוש באנטיביוטיקה יוצר מבחר זנים עמידים. בעיה מרכזיים בביולוגיה אבולוציונית, לכן היא להבין את הגורמים המשפיעים על היכולת של אוכלוסיות חיידקים לפתח עמידות לאנטיביוטיקה. מבחר ניסויים הופיעו בתור כלי רב עוצמה כדי לחקור את הביולוגיה האבולוציונית של חיידקים, שדה זה הפיק מדהים תובנות מגוון רחב של בעיות אבולוציונית-4,-5,-6

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית מערכת ניסויית קידוד גנטי עמידות לאנטיביוטיקה

הערה: כאן e. coli MG1655 שימש את המתח הנמען של הגן עמידות לאנטיביוטיקה פלסמיד או כרומוזום-מקודד. הגן עמידות לאנטיביוטיקה מקודד את הכרומוזום או על פלסמיד multicopy של זן isogenic אחרת (איור 1).

  1. החדרת הגן עמידות לאנטיביוטיקה λ phage שילוב האתר (attB)20 של הכרומוזום של MG1655.
    1. להגביר את האזורים bp באורך 500 משני צידי האתר כרומוזומלית attB על ידי ה-PCR. השתמש oligonucleotides YbhC-F (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') ו- attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') כדי ל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה הקודמת, נחקר על האבולוציה β לקטמאז ג'ין בלהTEM-1 לכיוון היוועצות התנגדות השלישי דור צפלוספורין ceftazidime12 . גן זה נבחר, כי למרות TEM-1 אינה מעניקה עמידות ceftazidime, מוטציות בגן בלהTEM-1 יכול להרחיב את טווח הפעילות של TEM-1 כדי hydrolyze צפלוספורינים כגון ceftazidime29. מוטציות עמידות לאנטיביוטיקה אנזימים כגון β-lactamases או aminoglycoside שינוי אנזימים מובילים לשינויים שלהם טווח הפעילות הן.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול חדש המשלב ביולוגיה מולקולרית, האבולוציה ניסיוני and רצפי DNA עמוק שנועד לחקור את התפקיד של פלסמידים multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. למרות פרוטוקול זה משלב טכניקות מתחומים שונים, כל השיטות נדרש לפתח אותו פשוטים, ניתן לבצע במעבדה למיקרוביולוגיה רגיל. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול כנראה הם הבנייה של זנים מערכת מודל ובנייה מחדש של מוטציות נצפתה לאחר ההתפתחות ניסיוני (אשר מבוצעות באמצעות אותה שיטה בדיוק). עם זאת, מערכת הרכבה איזותרמי21, מפשט באופן משמעותי פרוט.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי דה אינסטיטוטו סאלוד Carlos III (תוכנית Estatal דה אני + D + אני 2013-2016): מעניק CP15-00012 PI16-00860, CIBER (CB06/02/0053), שיתוף מימנה הקרן אזורי אירופה פיתוח ' דרך להשיג אירופה"(ERDF). ג'אי נתמך על-ידי התוכנית Atracción דה talento של ממשלת האזור של מדריד (2016-T1/ביו-1105) ואני + D Excelencia של הספרדים Ministerio דה Economía, תעשייה y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM נתמך על-ידי מלגת Servet מיגל דה אינסטיטוטו סאלוד Carlos III (MS15/00012) שיתוף הממומן על ידי הקרן החברתית האירופאית "השקעה בעתיד שלך" (ESF) ו ERDF.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ThermocyclerBioRadC1000
ElectroporatorBiorRad1652660
קובטות אלקטרופורציהSigma-AldrichZ706078
NanoDrop 2000/2000cThermo Fisher ScientificND-2000קבע את איכות ה-DNA ומדידת יחסי הספיגה 260 ננומטר/280 ננומטר ו-260 ננומטר/230 ננומטר
אינקובטורMemmertUF1060
אינקובטור (שייקר)Cole-Parmer LtdSI500
ספק כוחBioRad1645070Agarose ג'ל אלקטרופורזה
תא אלקטרופורזהBioRad1704405Agarose ג'ל אלקטרופורזה
פיפטותBiohit725020, 725050, 725060, 725070
פיפטותרב ערוציותBiohit728220, 728230,
728240
קורא צלחות SynergyHTX BioTekBTS1LF
לולאות חיסוןSigma-AldrichI8388
96 בארות צלחותFalcon351172
LBBD DifcoDF0446-17-3
LB אגרפישר מדעיBP1425-500
Phusion פולימראזתרמו פישר מדעיF533S
גיבסון הרכבהניו אינגלנד BiolabsE2611S
אנזימי מחיקהתסיסה FastDigest
אנטיביוטיקהסיגמא-אולדריץ'
QIAprep ספין Miniprep ערכתQiagen27104ערכת מיצוי פלסמיד
אשף ערכת טיהור DNA גנומיערכת מיצויפרומגהA1120
DNeasy דם & ערכות רקמותQiagen69506gDNA ערכת מיצוי
אלקטרופורציה קובטותסיגמא-אולדריץ'Z706078
צלחות פטריSigma-AldrichD9054
CryotubesClearLine390701
צלחות 96 בארות (-80º אחסון C)Thermo Fisher Scientific249945
מערכת QuantiFluor dsDNA PromegaE2670כימות של ריכוז DNA
AgaroseBioRad1613100אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
50x מאגר TAEBioRad1610743אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
T4 פולינוקלאוטיד קינאזתרמו פישר סיינטיפיקEK0031
T4 DNA ליגאזתרמו פישר מדעיEL0014
gDNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
  2. Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
  3. M....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multicopy PlasmidsAntibiotic ResistanceExperimental EvolutionEscherichia coliGene Copy NumberPlasmid ConstructionDeep DNA SequencingEvolutionary RescueAntibiotic SelectionMutation Analysis

Related Articles