כאן נתאר שיטת הדמיה כולה-הר ברזולוציה גבוהה בעור האוזן והעכבר כולו למבוגרים, אשר מאפשרת לנו לדמיין מורפוגנזה מסעף והמתבנת של העצבים ההיקפיים, כלי הדם, כמו גם התפלגות תא החיסון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעור מבוגר האוזן: מערכת מודל ללמוד מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון
במאמר זה
סיכום
תקציר
כאן, אנו מציגים פרוטוקול של עור האוזן למבוגרים כולה-הר של הדמיה טכניקה ללמוד מקיף תלת מימדי מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית ו המתבנת, וכן חלוקת תא החיסון ברמה התאית. הניתוח של היקפי עצבים, כלי דם מבנים אנטומיים של רקמות בוגרות מספק כמה תובנות להבנת חיווט נוירו-וסקולרית פונקציונלי והתנוונות נוירו-וסקולרית במצבים פתולוגיים כגון ריפוי הפצע. כמערכת מודל מאוד אינפורמטיבי, אנחנו התמקדו המחקרים שלנו בעור האוזן למבוגרים, אשר נגיש עבור ניתוח. פרוטוקול לשחזור ופשוט שלנו מספק תיאור מדויק של הרכיבים הסלולר של העור כולו, כגון העצבים ההיקפיים (אקסונים סנסוריים, סימפטי אקסונים ו תאי שוואן), כלי הדם (תאי אנדותל ותאים השריר החלק בכלי הדם ), ותאים דלקתיים. אנו מאמינים שפרוטוקול זה יסלול את הדרך לחקור ליקויים מורפולוגי של העצבים וכלי הדם, כמו גם הדלקת בעור האוזן למבוגרים תחת מצבים פתולוגיים שונים.
מבוא
העור מורכב משלוש שכבות: אפידרמיס, דרמיס ובהיפודרמיס. זה שימש כמערכת מודל לחקר תאי גזע תחזוקה, בידול, מורפוגנזה פיתוח וכן התחדשות, tumorigenesis, וכן דלקת למבוגרים. העור הוא בעושר vascularized, innervated כך ההתפתחות של מערכת העצבים ההיקפית, מערכת כלי הדם היא מתואמת היטב.
בעבר הראו טכניקת דימות של העור מתחלקים כולה-הר עם תיוג מרובים ללמוד העצבים ההיקפיים שלמים וכלי הדם כולל את מרכיבי התא1,2,3, 4: אקסונים סנסוריים אקסונים סימפטי, שוואן תאי העצבים, תאי אנדותל, pericytes, תאי השריר החלק בכלי הדם (VSMCs) בכלי הדם. במהל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בסעיף זה בוצעו תחת אישור מן הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (NHLBI) חיה אכפת לי שימוש הוועדה.
1. בגיר העכבר האוזן העור אוסף
- המתת חסד עכברים בוגרים על ידי חשיפה פחמן דו-חמצני (CO2) בתוך תא סגור ולאחר מכן לאשר את המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם.
הערה: הניסוי מלווה מנחה לאומי מכונים לבריאות (NIH) עבור שיטת המתת חסד. - לנתח את האוזן מבסיס ולמקם אותו 35 x 10 מ מ2 פטרי המכילות 2 מ"ל מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק). בקצרה לקצץ שערות עם מספריים.
- לקלף את העור האחורי ועור הקדמי משם בקפידה הסחוס להתערב.
הערה: סחוס מייחסת העור הקדמי. - להעביר את ישבנה ואת העור הקדמי בנפרד כדי בגודל 2....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עור אחורי האוזן העכבר למבוגרים (איור 1 א') והעור באוזן קדמית (איור 1B) היו immunostained עם נוגדנים αSMA (אדום), Tuj1 (ירוק), ו- PECAM-1 (כחול). העור האחורי היה immunostained ללמוד נוירו-החיסון הפצה באמצעות נוגדנים CD11b (אדום) ו MBP (ירוק), יחד עם Tuj1 (כחול) (איור 2 א). חלוקת CD11b+ תאים דלקתיים, כולל מקרופאגים זוהה ברזולוציה הסלולר יחיד (איור 2B).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר את כולה-הר immunonohistochemical הדמיה של האוזן למבוגרים עור לניתוח של המבנים הנוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון. אנו מאמינים שבשיטה זו יש יתרונות רבים ניסיוני לחוקרים ללמוד מורפוגנזה מסעף ו את המתבנת של העצבים וכלי הדם, כמו גם תלת מימדי הפצה של רכיבי העור כולל תאים חיסוניים ושיער זקיקי. ניתן לכמת את התוצאות של ההדמיה באמצעות תוכנות דימות לצורך ניתוח כמותי נוסף.
הכנה נכונה של העור האוזן הינה קריטית להצלחת פרוטוקול זה. ראשית, בעור האוזן צריך גזור בקפידה זמן קצר לאחר המתות חסד העכב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים ק' גיל לניהול מעבדה, תמיכה טכנית, ג'יי הוקינס, הצוות של נבחרת מכונים לבריאות (NIH) בניית מתקן בעלי חיים 50 על הסיוע עם העכבר, והטיפול ר ריד, פ Baldrey לסיוע מינהלי. תודה גם Motegi ס ו מ Udey עבור שיתוף שלהם האוזן העור לנתיחה פרוטוקול, כוויות (ש ע) עזרה העריכה, חברים של המעבדה של תאי גזע וביולוגיה נוירו-וסקולרית לקבלת עזרה טכנית ודיון מתחשב. ט יאמזאקי נתמכה על ידי החברה יפן עבור NIH-KAITOKU קידום המדע (JSPS). עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מחקר מגזר של הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (HL005702-11 כדי עיון)
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10 x פוספט חוצץ | מלח KD רפואי | RGE-3210 | PBS, ללא Ca2+/Mg2+ |
| Hank' s תמיסת מלח מאוזנת | Gibco | 14025-092 | HBSS, עם Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, מקבע, מדולל ב-PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | חומר ניקוי |
| רגיל סרום עיזים | Gibco | 16210064 | רכיב של מאגר חסימה/כביסה |
| רגיל סרום חמור | ג'קסון מחקר חיסוני | 017-000-121 | רכיב של מאגר חסימה/כביסה |
| פינצטה עדינה מעוקלת | Dumont | RS-5047 | |
| פינצטה מעוקלת | Integra Miltex | Vantage V918-782, V918-784 | |
| יחידת סינון 0.45 מ"מ | Thermo Scientific | 157-0045 | לסינון |
| 1 מ"ל מזרק | Coviden | 8881501400 | עבור |
| סינון מסנן מזרק יחידה 0.22 מ"מ | Millex-GV | SLGVR04NL | לסינון |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | נגד דהייה הרכבה בינונית |
| לק | אלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences | 72180 | לאיטום |
| חיתוך מיקרוסקופ | Leica | MZ95 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | תוכנת עורך הגרפיקה | של Adobe | |
| Illustrator CC 2017 | תוכנת עורך הגרפיקה | של Adobe | |
| Image J | NIH | תוכנת עיבוד תמונה | |
| נוגדן Anti-PECAM-1 (CD31) | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, סמן תאי אנדותל כלי דם, נוגדן 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, סמן תאי אנדותל של כלי הדם, 1:300 |
| נוגדן Anti-αSMA מצומד עם cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, סמן תאי שריר חלק בכלי הדם, 1:500 |
| נוגדן Anti-EphB1 | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, סמן תאי אנדותל ורידי, 1:100 |
| אנטי-נוירונים ספציפיים Class III β-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, IgG פוליקלונלי של ארנב, סמן פאן-אקסונלי, 1:500 |
| נוגדן נגד Tuj1 | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, סמן פאן-אקסונלי, 1:500 |
| נוגדן נגד MBP | Abcam | AB40390 | IgG פוליקלונלי של ארנב, סמן מיאלינציה, 1:200 |
| נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאז | Chemicon | AB152 | ארנב פוליקלונלי, סמן נוירון סימפתטי, 1:500 |
| נוגדן נגד פריפרין | Chemicon | AB1530 | ארנב פוליקלונלי, סמן נוירונים היקפי, 1:1000 |
| נוגדן Anti-CD11b | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, סמן תאים דלקתיים (מקרופאגים), 1:50 |
| נוגדן Anti-CD45 | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, סמן תאים פאן-המטופויאטיים, 1:500 |
| נוגדן Anti-CD3 | Bio-Rad | MCA1477T | חולדה IgG1, סמן תאי חיסון, 1:100 |
| נוגדן Anti-CD45R (B220) Thermo | Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, סמן תאים דלקתיים, 1:200 |
| נוגדן נגד GFP | Thermo Fisher Scientific | A11122 | ארנב פוליקלונלי, 1:300 |
| נוגדן נגד GFP | Abcam | Ab13970 | פוליקלונל עוף, 1:500 |
| נוגדן Anti-β-gal | Cappel | 55976 | ארנב פוליקלונלי, 1:5000 |
| נוגדן נגד RFP | Abcam Ab62341 | ארנב פוליקלונלי, 1:300 | |
| עיזים נגד ארנב IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | נוגדן משני פוליקלונלי ארנב, 1:250 |
| נוגדן נגד אוגר עיזים IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | נוגדן משני רב-שבטי של אוגר, 1:250 |
| עיזים נגד חולדות IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno Research | 112-585-167 | נוגדן משני פוליקלונלי של חולדות, 1:250 |
| נוגדן משני נגד עכבר עיזים IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | נוגדן משני IgG2a עכבר, 1:250 |
מקורות
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
