קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע ירידה לפרטים פרוטאז ברקמת העכבר גולמי תמציות באמצעות ספקטרומטר MALDI-TOF.

תקציר

פרוטאזות יש כמה פונקציות ביולוגיות, כולל הפעלה/איון חלבון ועיכול המזון. המזהה פרוטאז ירידה לפרטים חשוב לחשוף פרוטאז פונקציה. השיטה המוצעת במחקר זה קובע פרוטאז ירידה לפרטים על ידי מדידת משקל מולקולרי של סובסטרטים ייחודי באמצעות מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה זמן-של-טיסה (MALDI-TOF). סובסטרטים מכילים iminobiotin, בעוד האתר cleaved מורכב חומצות אמינו, מרווח מורכב פוליאתילן גליקול. המצע cleaved יפיק משקל מולקולרי ייחודי בעזרת של חומצת אמינו cleaved. אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי זה יכול להתבצע בסיר אחד באמצעות דגימות גולמי, הוא גם מתאים להערכת מספר דוגמאות. במאמר זה, אנו מתארים שיטה ניסיונית פשוטה ממוטבת עם דגימות שחולצו מן העכבר רקמת הריאה, כולל רקמות החילוץ, השמה של סובסטרטים עיכול לתוך דגימות, טיהור של סובסטרטים העיכול בתנאים שונים pH , או מידה של משקל מולקולרי של סובסטרטים באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. לסיכום, טכניקה זו מאפשרת זיהוי היחודיות פרוטאז בדגימות גולמי נגזר תמציות רקמות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף, אשר יכול בקלות להיות יורה לעיבוד דגימה מרובות.

מבוא

פרוטאזות לווסת תהליכים פיזיולוגיים על ידי ביקוע חלבונים, הייזום של פעילות פרוטאז לתשמיש, המיקומים מוסדר¹. לכן חשוב לזהות את הביטוי ואת הפעילות של רקמות שמווסתים באופן מקומי, וכן לפתח שיטה לגילוי פרוטאזות. פעולת השירות המוצע במחקר זה שמטרתו לזהות ירידה לפרטים פרוטאז במקביל גילוי פרוטאזות.

ישנן כמה שיטות לגילוי פרוטאז ירידה לפרטים. שיטת azocasein הינו ידוע בשל השימוש בו הגילוי של פרוטאזות² . מוגבלת יכולתו להשיג עוד מידע Zymography הוא שיטה לזיהוי פרוטאז מקיפה אחרת זה יכול לשמש כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של פרוטאזות³, אבל זה לא יכול לשמש כדי לבחון המצע ירידה לפרטים. ירידה לפרטים פרוטאז יכול להיקבע על ידי מבחני spectrometric, באמצעות סובסטרטים כגון p-nitroanilide⁴, מבחני fluorometric, באמצעות קומרין סובסטרטים⁵ או מבחני פלורסצנטיות תהודה אנרגיה העברה (סריג)⁶. שיטות אלה מאפשרות זיהוי חד-ירידה לפרטים של סובסטרטים הכלול לבאר בודדת. במחקר הנוכחי, יחודיות פרוטאז של רקמות תמציות נבדק בתנאים שונים, כמו תמציות אלה מכילים פרוטאזות מרובים. פרוטאז פעילות מוסדר על ידי מספר גורמים, כולל ה-pH, קואנזימים, prosthetic קבוצות של יון כוח. לאחרונה, שיטות מבוססות פרוטאומיקס שימשו לזיהוי פרוטאז ירידה לפרטים; לדוגמה, שיטת שדווחו על-ידי Biniossek et al. ⁷ משתמש את פרוטאום כדי לקבוע ירידה לפרטים המצע אפילו בתמציות גולמי ומאפשר נחישות מדויק של הפעילות המחשוף של פרוטאזות לזהות רצפים מרובים של חומצת אמינו⁸. עם זאת, שיטה זו אינו מתאים לניתוח של דוגמאות רבות. לעומת זאת, השיטה שלנו מאפשר עיבוד סימולטני של דגימות מרובות ושימוש של Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון זמן-של-טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה לניתוח מדגם מקלה על זיהוי מהיר וקל של cleaved מצעים.

מאמר זה מתאר שיטה להעריך ירידה לפרטים פרוטאז באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף כדי למדוד את המשקל המולקולרי של מצעים ייחודי. הצורות מולקולרית של מצעים cleaved, יחד עם משקולות מולקולרית התיאורטי שלהם, מוצגים באיור 1 ושל טבלה 1. מחקרים קודמים השתמשו סובסטרטים המכיל מפרידי polyglycine וביוטין⁹; עם זאת, אלה סובסטרטים מתגברת כי ייתכן ביקע את רצף polyglycine על ידי אנזימים לזהות את רצף גליצין. בנוסף, בזיקה גבוהה בין אבידין ביוטין עלול להוביל קצב החלמה נמוכים. כדי לשפר את החסרונות האלה, במחקר זה שאנו מסונתז מצע ייחודי, אשר הולחן של פוליאתילן גליקול (PEG), iminobiotin, חומצת אמינו שיכול לזהות את האתר המחשוף (איור 1). להפלות בין חומצות אמינו של משקולות מולקולרי דומה, D-סרין נוסף בין חומצת אמינו ביותר באתר cleaved את מרווח פג.

N-מסוף של המצע סומן עם iminobiotin, המאפשרת טיהור זיקה מדגימות גולמי. השימוש iminobiotin במקום ביוטין הוא קריטי; ביוטין יש זיקה חזקה עם אבידין, דבר המתבטא המחירים נמוך השחזור של התווית על-ידי ביוטין מצעים מ שרף אבידין, בזמן אהדה של iminobiotin אבידין יכולים להשתנות על ידי ה-pH. התווית על-ידי Iminobiotin סובסטרטים יהיה לאגד אבידין בתנאים לעיל pH 9, בעוד אבידין משחרר התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים בתנאים להלן pH 4. לכן, iminobiotin שימש לטיהור זיקה¹⁰. לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לגילוי פרוטאז ירידה לפרטים באמצעות מצעים ייחודי.

פרוטוקול

פרוטוקולים ניסויים בבעלי חיים אושרה על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה פרמצבטיקה ניהון וביצע בהתאם להנחיות על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של האוניברסיטה פרמצבטיקה ניהון. הפרוטוקול הותאם עבור רקמות תמציות נגזר ICR עכברים. עכברים ICR נרכשו מ ניפון SLC בע מ (שיזוקה, יפן)

1. הכנת המצע התווית על-ידי Iminobiotin

המצע עובר סינתזה מוצק-שלב באמצעות קבוצה 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-מוגן חומצות אמינו כמפורט להלן¹¹. השתמש בטבלה 2 כדי לקבוע המתחם-Fmoc נעשה שימוש, בהתאם להזמנה חומצת אמינו שלב של סינתזה.

1. סיפוריכם 0.2 גר' Fmoc-NH-סאל שרף עם 10 מ"ל של N, N-dimethylformamide (DMF) בעמודה סינתזה.
2. הוסף 5 מ של 30% פיפרידין DMF. רוק הפתרון עבור 10 דקות לדבוק Fmoc-הקבוצה.
3. בדוק Fmoc מחשוף עם החומצה trinitrobenzenesulfonic (TNBS) מבחן¹²: צינור TNBS DMF ו 10 µL של diisopropylethylamine (DIPEA) 10 x 75 מ מ² מבחנה, ואז העברת כמות קטנה של שרף הזכוכית להוסיף 10 µL של 1%. שרף ביקע Fmoc לפתח צבע כתום.
   1. חזור על שלבים 1.2-1.3 אם התוצאה היא שלילית.
4. לשטוף את השרף שלוש פעמים עם 5 מיליליטר DMF.
5. הוסף 5 מ של DMF המכיל mmol 0.3 של המתחם Fmoc המפורטים בטבלה מס ' 2 (החל מהמתחם נעשה שימוש בשלב 1), 0.3 mmol של O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), 0.3 mmol של 1- הידרוקסי-1H-benzotriazole, monohydrate (HOBt) ו- 0.6 mmol של diisopropylethylamine (DIPEA). רוק הפתרון למשך 30 דקות לשלב זאת עם השרף.
   1. בדוק שלב זה עם הבדיקה TNBS. אם התוצאה היא חיובית, משמעות התגובה לא התקדם במידה מספקת, יש לחזור על שלב זה.
6. לשטוף את השרף שלוש פעמים עם 5 מיליליטר DMF.
7. חזור על התגובה התארכות מאת וחזור על שלבים 1.2-1.6, שינוי Fmoc-המתחם בשימוש בשלב 1.5 על פי בטבלה 2.
8. להוסיף 1 מ"ל של מים 2.5%, 1% triisopropylsilane (TIS), ו- 2.5% ethanedithiol (EDT) בחומצה trifluoroacetic כדי לדבוק פפטידים מקבוצות שרף והגנה. רוק הפתרון עבור 60 דקות.
9. לסנן, ולאסוף את פילטרט של צינור 50-mL.
10. להוסיף 40 מ"ל אתנול diethyl קר, חנות בן לילה ב-20 ° C.
11. צנטריפוגה g 4,000 x ב-20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לאסוף את גלולה.
12. השתמש של desiccator עבור 3 שעות כדי להסיר את דיאתיל אתר.
13. להוסיף 1 מ"ל של 50% acetonitrile מים, לפזר את פפטידים גולמי. Lyophilize הפתרון כדי להסיר חומצה trifluoroacetic. חזור על פעולה זו מספר פעמים.
14. לטהר את פפטידים משתמש בעמודה מחסנית סי18.
    1. הפעל את השרף בעמודה מחסנית סי18 באמצעות 3 מ"ל של acetonitrile (לחצן מצוקה).
    2. Equilibrate עם 5 מיליליטר 5% לחצן מצוקה, 0.1% TFA H₂O.
    3. לטעון את peptides סינתטי גס לתוך העמודה מחסנית סי18.
    4. לשטוף עם 10 מ"ל של 5% לחצן מצוקה, 0.1% TFA H₂O.
    5. Elute את הדגימות עם 3 מ"ל של 60% לחצן מצוקה, 0.1% TFA H₂O.
15. בדוק את פפטידים על ידי מדידת משקל מולקולרי שלהם באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF.
    1. פיפטה 1 µL של eluent על צלחת היעד. מיד להוסיף רוויה α-cyano-4-hydroxycinnamic תמיסה חומצית (CHCA) ב- 50% acetonitrile בחומצה trifluoroacetic 0.1%
    2. יצירת גביש את התערובת על-ידי air-drying.
    3. רוכשים ספקטרה המונית של דוגמאות על פי הפרוטוקול של היצרן מכשיר.
       1. להגדיר באופן ידני MALDI-TOF ספקטרומטר מסה כדי חיובית לשקף מצב.
       2. לכייל את ספקטרומטר המסה באמצעות CHCA, bradykinin קטע 1-7 (משקל מולקולרי monoisotopic = 756.3997 Da), ו אנגיוטנסין II (monoisotopic משקל מולקולרי = 1,045.5423 Da).
       3. לרכוש את ספקטרום המונית של peptides סינתטי ולאחר מכן להעריך על-ידי השוואתה עם משקל מולקולרי תיאורטי.

2. הכנת תמציות רקמות

1. עזים ומתנגד זכר ICR עכברים בתוך תא שאיפה איזופלוריין ואמת הרדמה עומק באמצעות הבוהן צביטה. המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם.
2. בעזרת מספריים, עושים חתך בבטן קו האמצע באמצעות הרחבת העור עד הסרעפת.
3. לחתוך דרך הסרעפת ולאסוף את כל רקמת הריאה. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות.
4. לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם סליין באגירה טריס כקרח 50 מ מ (pH 7.4).
5. שוקלים את רקמות ואת העברת כ 100 מ ג של רקמות שפופרת זכוכית² 12 x 75 מ מ.
6. הוסף mL 0.3 המאגר החילוץ (50 מ מ טריס-מאגר, pH 7.4, המכיל 0.1% פולי (oxyethylene) octylphenyl אתר).
7. Homogenize הדגימות רקמת הריאה באמצעות מהמגן ערבוב.
   1. מגניב הדגימות על קרח.
   2. Homogenize את הדגימות-20,000 סל ד ל 30 s בבלנדר. חזור על שלב זה עד הדגימות הומוגנית לחלוטין.
      הערה: לא homogenize עבור יותר מ 1 דקה ללא הרף, על מנת למנוע עלייה בטמפרטורה.
8. העברת 1,000 µL של homogenate צינור 1.5 מ ל ו צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 10,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
9. העברת µL 500 של תגובת שיקוע צינור פלסטיק 1.5 מ.
10. השתמש µL 10 המדגם כדי לקבוע ריכוז חלבון, שימוש בשיטות כגון bicinchoninic חומצה (BCA) או בשיטה Coomassie מבריק כחול (CBB).
11. למניעת קיפאון, להוסיף 80% גליצרול הדגימות עבור ריכוז סופי של 50% גליצרול.
12. לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש נוסף.

3. העיכול של מצעים בשנת המודל פרוטאז ותמציות רקמות

1. להוסיף 10 µL של 0.1 µg µL של N-tosyl-L-פנילאלנין chloromethyl קטון (TPCK)-טריפסין, 0.1 µg µL של Staphylococcus aureus V8 פרוטאז או µg 10/µL של רקמת תמציות לתוך µL 890 של מאגר לעיכול.
   1. כדי להבהיר את ההבדל בין ירידה לפרטים פרוטאז בהתאם רמת החומציות, השתמש מאגרי להתאים ל- pH 3, 5, 7 ו- 9. ההרכב של המאגר עיכול מוצג בטבלה3.
   2. לבצע את פקד שליליים באמצעות פרוטאז לא פעיל בתמציות רקמות, שהוכנו על ידי דגירה מים רותחים (או חימום ב 100 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.
2. להוסיף 10 µL של סובסטרטים התווית על-ידי iminobiotin (מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), הריכוז הסופי = 100 µL pmol/10).
3. תקופת דגירה של 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס לעכל את התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים.
4. לאחר דגירה, לעצור את העיכול של מצעים עם מים רותחים (או על ידי חימום ב 100 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.
5. Centrifuge של סובסטרטים מתעכל למשך 5 דקות ב 10,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
6. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 mL החדש.

4. טיהור של המצע התווית על-ידי Iminobiotin

1. להוסיף µL 50 streptavidin 50% sepharose החרוזים 1 מ' טריס-buffer (pH 9) המכיל 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl אתר.
   1. השתמש בנייר בדיקת pH כדי להבטיח כי הפתרון הוא סביב ה-pH 9. אם ה-pH של התמיסה נמוכה, להתאים אותו כ ה-pH 9 על-ידי הוספת 1 מ' טריס-buffer (pH 9) המכיל 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl אתר. שלב זה חשוב, כפי שהוא כרוך קשירה של המצע התווית על-ידי iminobiotin כדי streptavidin.
2. דגירה בין לילה ב 4 ° C עם ערבוב עדין רציפה על גלגל מסובב כדי לאגד את התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים streptavidin. החרוזים צריכים להישאר מושהה במהלך הדגירה.
3. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 10,000 ג'י x ב- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.
4. לשטוף את החרוזים חמש פעמים כדלקמן:
   1. להוסיף 1,000 µL של חיץ לשטוף (50 מ מ טריס-buffer, pH 9) החרוזים.
   2. רחץ 10 דקות ב 4 ° C עם ערבוב עדין רציפה על גלגל מסובב. החרוזים צריכים להישאר מושהה במהלך הדגירה.
   3. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- g x 10,000 ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע.
5. להוסיף 100 µL של 0.2% חומצה trifluoroacetic החרוזים.
   1. השתמש בנייר בדיקת pH כדי להבטיח כי הפתרון הוא מתחת pH 2. אם ה-pH של התמיסה גבוה, להתאים את רמת החומציות אל מתחת 2 על-ידי הוספת חומצה trifluoroacetic 1%.
6. תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין רציפה על גלגל מסובב.
7. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- g x 10,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ.

5. לטעום והכנה לייזר בסיוע מטריקס Desorption/יינון זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF ספקטרומטר מסה)

הערה: כל הפתרונות בשלבים הבאים צריכים להיות מוכנים עם ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC)-מים רצף-כיתה כיתה או חומצת אמינו.

1. פיפטה 500 µL של acetonitrile על גבי שרף סי18 כדי להפעיל אותו. הסר את acetonitrile משומשים. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
2. Equilibrate שרף סי18 עם 100 µL של 0.1% חומצה trifluoroacetic. להסיר את eluent. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
3. כדי לטעון את הדגימות, לאגד את הדגימות שרף באמצעות פיפטה.
4. לשטוף את השרף עם 20 µL של 0.1% חומצה trifluoroacetic. חזור על שלב זה חמש פעמים.
5. Elute את הדגימות עם 3 µL של 60% acetonitrile בחומצה trifluoroacetic 0.1%. Pipette את eluent על צלחת היעד עבור ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. מיד להוסיף רוויה α-cyano-4-hydroxycinnamic תמיסה חומצית (CHCA) ב- 50% acetonitrile בחומצה trifluoroacetic 0.1%.
6. יצירת גביש את התערובת על-ידי air-drying.
7. רוכשים ספקטרה המונית של דוגמאות על פי הפרוטוקול של יצרן כלי.
   1. להגדיר באופן ידני MALDI-TOF ספקטרומטר מסה כדי חיובית לשקף מצב.
   2. לכייל את ספקטרומטר המסה באמצעות CHCA, bradykinin קטע 1-7 (משקל מולקולרי monoisotopic = 756.3997 Da), ו אנגיוטנסין II (monoisotopic משקל מולקולרי = 1,045.5423 Da).
   3. רוכשים את ספקטרום המונית של דגימות, הקדשת תשומת לב ספקטרום המונית בין 700 ל 900 Da עבור הטופס cleaved של סובסטרטים התווית על-ידי ביוטין.
8. לזהות את הפסגות שזוהו באמצעות טבלה 1. זיהוי של משקל מולקולרי המתאים מציין המחשוף ב C-הסופית של חומצת אמינו רלוונטי ביותר.

תוצאות

הערכה של השיטה לזיהוי היחודיות פרוטאז על ידי מודל פרוטאז

היעילות של מערכת זו הוערך באמצעות TPCK-טריפסין ו- V8 פרוטאז, specificities המצע אשר התקבלו. TPCK-טריפסין, V8 פרוטאז הוערך כדי לבקע את רצף חומצות אמיניות בטרמינל-C של משקעי ליזין, ארגינין, על הצד carboxy של חומצה אספרטית, חומצה גלוטמית משקעים, בהתאמה. טבלה 1 מציגה את המשקל המולקולרי תיאורטי של המצע, מתעכל שברי ביקע על ידי פרוטאזות ספציפיים. המצע העיכול באמצעות...

דיון

פרוטוקול זה משתמש ספקטרומטר מסה MALDI-TOF לזיהוי ירידה לפרטים פרוטאז בדגימות גולמי נגזר תמציות רקמות, יכול בקלות להיות יורה לעיבוד דגימה מרובות. בפרט, אנו מניפולציות pH כדי לגרום לשינוי במצב המצע ירידה לפרטים.

אבידין-ביוטין מורכבים (ABC) השיטה, אשר כבר בשימוש נרחב בביוכימיה עקב ירידה לפרטים שלה מחייב, היה מנוצל פרוטוקול שלנו. בשל בזיקה חזקה של ABC, הכריכה של אבידין כדי ביוטין הוא כמעט בלתי הפיך. זיקה טיהור על ABCs לכן מאוד לא יעיל. מסיבה זו, אנו מדווחים כי שיעור שחזור עבור התווית על-ידי ביוטין...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שרף Fmoc-NH-SAL (-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00102
N, N-dimethylformamide (DMF)	Watanabe כימיקלים ושות', בע"מ	A00185
פיפרידין	וואטאנאבה כימית ושות', בע"מ	A00176
חומצה טריניטרובנזנסולפונית (TNBS)	WAKO כימית	209-1483
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00067
1-הידרוקסי-1H-בנזוטריאזול, מונוהידראט (HOBt)	Watanabe כימיקלים ושות', בע"מ	A00014
diisopropylethylamine (DIPEA)	Watanabe כימיקלים ושות', בע"מ	A00030
triisopropylsilane (TIS)	Watanabe כימיקלים ושות', בע"מ	A00170
ethanedithiol (EDT)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00057
חומצה טריפלואורואצטית (TFA)	Millipore	S6612278 403
אצטוניטריל	Kokusan Chemical	2153025
C18 עמוד מחסנית	Waters	WAT051910
poly (oxyethylene) octylphenyl ether	WAKO Chemical	168-11805	Triton X-100
ערבוב הומוגנייזר	Kinematica	PT3100	הומוגנייזר פוליטרון
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250	Nakarai Chemical	094-09
גליצרול	Nakarai Chemical	170-18
N-tosyl-L-פנילאלנין כלורו-מתיל קטון (TPCK)-טריפסין	סיגמא-אולדריץ'	T1426
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	WAKO Chemical	043-07216
סטרפטווידין ספרוז	GE Healthcare	17-511-01
ZipTipC18	Millipore	ZTC18S096
&אלפא;-ציאנו-4-חומצה הידרוקסיצינמית (CHCA)	Sigma-Aldrich	C2020
MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה	Bruker Daltonics, גרמניה	autoflex
2-iminobiotin	Sigma-Aldrich	I4632
חומצות אמינו Fmoc	Watanabe Chemical Co., Ltd.