פורמלין-קבוע דגימות פרפין-מוטבע מהווים מקור חשוב של סמנים מולקולריים של מחלות אנושיות. כאן אנו מציגים פרוטוקול הכנה ספריית cDNA מבוסס המעבדה, בתחילה עוצב עם RNA טריים קפואים, באופן מיטבי עבור הניתוח של מיקרו Rna בארכיון של רקמות מאוחסן עד 35 שנים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות
במאמר זה
סיכום
תקציר
– בארכיון, קלינית מסווגים פורמלין-קבוע פרפין-מוטבע רקמות (FFPE) יכול לספק חומצות גרעין ללימודי מולקולרית רטרוספקטיבה של התפתחות סרטן. באמצעות נגעים לא פולשנית או טרום ממאיר של חולים אשר מאוחר יותר לפתח מחלה פולשנית, ניתוחים ביטוי גנטי עשוי לעזור לזהות שינויים מולקולריים מוקדם שגורמים את הסיכון לסרטן. זה טוב תואר חומצות גרעין התאוששה FFPE רקמות עברו נזק פיזי חמור, שינויים כימיים, אשר תעשה שלהם ניתוח קשה ודורש בדרך כלל מבחני מותאם. מיקרו Rna (miRNAs), עם זאת, אשר מייצגים את שיעור קטן של מולקולות RNA פורש רק עד ~ 18 – 24 נוקלאוטידים, הוכחו לעמוד לאחסון לטווח ארוך, יש נותחו בהצלחה בדגימות FFPE. כאן אנו מציגים 3' לבר-קוד משלים דנ א (cDNA) ספריית הכנה פרוטוקול במיוחד ממוטבים לניתוח של RNAs קטן שחולצו מן הרקמות שאוחסנו בארכיון, אשר הודגם לאחרונה להיות חזקים מאוד לשחזור בעת שימוש בארכיון דגימות קליניות מאוחסן עד 35 שנים. הכנת ספריה הוא מותאם לניתוח מולטיפלקס של החומר נחשף/השפיל בהם דוגמאות RNA (עד 18) מאתרים עם מתאמי לבר-קוד בודדות 3', ואז איחדו יחד על ההכנות אנזימטי וביוכימי עוקבות לפני ניתוח. כל purifications מתבצעים על ידי לזיהוי בג'ל (עמוד), אשר מאפשר הבחירות הספציפיות גודל ו enrichments מינים RNA קטנים לבר-קוד. הכנת ספריית cDNA הוא מותאם תשומות RNA דקה, כמו טייס תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) מאפשרת קביעה של מעגל הגברה מסוימת לייצר סכומי מיטביים של חומר עבור הדור הבא רצפי (הגדרות). גישה זו היה מותאם לשימוש של RNA מפורק FFPE של דגימות בארכיון עד 35 שנים ומספק ביותר לשחזור נתונים המיתרים.
מבוא
miRNAs ההכפלה שמורים להפליא היטב פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) דגימות1,2,3. העבודות הקודמות הוכיחה כי הביטוי של אלה קצרה תקינה ללא קידוד יחיד נטושים מולקולות RNA יכול בהצלחה להעריך באמצעות RNA הכולל מדגימות FFPE, לספק נתונים ביטוי גנים הרלוונטיים בהשוואה הטרייה המקורי רקמות4,5,6,7,8. בהשוואה RNAs שליח גדול, אשר הוכחו להיות מושפעת באופן ביקורתי עיבוד רקמות (פורמלדהיד, חום, לייבוש, וכו ') FFPE, RNases אנדו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת כל ריאגנטים, תחל
- להזמין כל תחל ומתאמי כמתואר באיור1.
-
הכינו כיל המקנה קוקטייל, אשר עלה בכל מצדו בודדים.
- Resuspend oligonucleotide המוביל (איור 1) 0.5 מיקרומטר עם RNase ללא מים. Resuspend את oligonucleotides כיל 10 (איור 1) 100 מיקרומטר באמצעות הפתרון oligonucleotide 0.5 מיקרומטר המוביל.
- לשלב 10 µL של כל אחד כיילים 10 ב microcentrifuge siliconized לרכוש מניות כיל קוקטייל 100 מיקרומטר, ולהכין פתרון nM 0.026 לאחסון ב-20 ° C.
- לדלל את המתאמים 3' ייחודי, lyophilized, adenylated 20 במים נטולי RNase ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כפי שמתואר כאן, השיטה סך של 18 דגימות FFPE RNA בודדים (100 ng בכל) מוגדרים צינורות נפרדת לעבור 3' adenylated לבר-קוד oligonucleotide T4 מצדו בן לילה. למחרת, תגובות אנזימטיות בוטלה-חום, בשילוב, זירז צינור יחיד. בגדר RNA הוא resuspended ומופרדים מולקולות RNA מחוברים ב- 15% denaturing לזיהוי ג'ל (עמוד), שבו סמני גודל oligonucleotide RNA אשר נדד בבארות סמוכים של הג'ל דף, משמשים כדי לבחור את בגודל מתאים 3' לבר-קוד RNAs קטן (איור 2). היצירה ג'ל נכרת מודגרת בפתרון N.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול הכנה ספריית cDNA חזקים הדירים מאוד עבור הגדרות של RNAs קטן בארכיון ב- FFPE RNA דגימות מוצג פרוטוקול זה, אשר היא גרסה שהשתנתה וממוטב של ההליך המתואר על ידי Hafner. et al. 22
כל השלבים של פרוטוקול זה מוטבו לשימוש עם בוגרים RNA הכולל, בארכיון, פרוץ התאוששה FFPE דגימות. השלב מפתח של פרוטוקול זה, לעיבוד כמויות קטנות של FFPE RNA, שוכן איגום של כל הדגימות RNA (קרי, 18 בודדים 100 ננוגרם FFPE RNA דגימות) לאחר ligations בודדים עם לבר-קוד המתאמים ייחודי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים רוצה לחשוף כי פרסום המכיל חלק מהנתונים שהוצגו בכתב יד זה יצא לאור כתב העת הבינלאומי למדעי מולקולרית על ידי. Loudig et al. 21.
תודות
אנו מודים ד ר תומאס Tuschl, ראש המעבדה לביולוגיה מולקולרית RNA, כמו גם חברי המעבדה שלו על תמיכתם ועל שיתוף הטכנולוגיה שפותחה מעבדה ועל מתן גישה הצינור RNAworld. אנו מודים גם ד ר מרקוס Hafner שיתוף הפרוטוקול, לספק תיאורים מפורטים על כל השלבים הביוכימי, אנזימטי היה בהליך הראשוני שלו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | אמביון | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt סולם | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20 מ"ג/מ"ל סרום בקר אלבומין | סיגמא | B8894-5ML | |
| 50X טיטניום טאק | מעבדות קלונטק | 639208 | |
| אמוניום פרסולפט | פישר סיינטיפיק | 7727-54-0 | |
| BRL מערכת אלקטרופורזה אנכית ג'ל עם לוחות זכוכית ומסרקים | GIBCO | V16 | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| מיקרוצנטריפוגה אפנדורף 5424R | ארה"ב מדעית | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | ארה"ב מדעי | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand ™ צינורות מיקרוצנטריפוגה בעלי שימור נמוך סיליקון 1.5 מ"ל | פישר סיינטיפיק | 02-681-320 | |
| צינור מפסק ג'ל 0.5 מ"ל | IST Engineering Inc,3388-100 | ||
| מכשיר אלקטרופורזה ג'ל 7 ס"מ x10 ס"מ- תא מיני תת GT עם מגשי ג'ל ומסרקים | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| ג'רזי-קוט | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | אמביון | AM9640G | |
| MgCl2 1M | אמביון | AM9530G | |
| מיניפוגה צנטריפוגה אישית עם רוטור כפול | ארה"ב מדעי | 2641-0016 | |
| דגם V16 מכשיר אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד, משקפיים, מסרקים ומרווחים | Ciore Life Science | 21070010 | |
| אוליגונוקלאוטידים | IDT | מוגדר במהלך ההזמנה | |
| ינשוף EasyCast B2 מיני מערכת אלקטרופורזה - עם מגשי ג'ל ומסרקים | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick ערכת מיצוי ג'ל | Qiagen | 28704 | |
| אנזים הגבלה PmeI | NEB | R0560S | |
| מים ללא RNase | אמביון | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 משדר אור כחול | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| ערכת תמלול הפוך Superscript III | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 קטום K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler עם מכסה מחומם | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel מערכת תרכיז, מדלל וחוצץ | לאומי דיאגנוסטיקה | EC-833 |
מקורות
- Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
- Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
