JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Genetics

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

Published: May 05, 2018
doi:
10.3791/57471
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Summary

פורמלין-קבוע דגימות פרפין-מוטבע מהווים מקור חשוב של סמנים מולקולריים של מחלות אנושיות. כאן אנו מציגים פרוטוקול הכנה ספריית cDNA מבוסס המעבדה, בתחילה עוצב עם RNA טריים קפואים, באופן מיטבי עבור הניתוח של מיקרו Rna בארכיון של רקמות מאוחסן עד 35 שנים.

Abstract

– בארכיון, קלינית מסווגים פורמלין-קבוע פרפין-מוטבע רקמות (FFPE) יכול לספק חומצות גרעין ללימודי מולקולרית רטרוספקטיבה של התפתחות סרטן. באמצעות נגעים לא פולשנית או טרום ממאיר של חולים אשר מאוחר יותר לפתח מחלה פולשנית, ניתוחים ביטוי גנטי עשוי לעזור לזהות שינויים מולקולריים מוקדם שגורמים את הסיכון לסרטן. זה טוב תואר חומצות גרעין התאוששה FFPE רקמות עברו נזק פיזי חמור, שינויים כימיים, אשר תעשה שלהם ניתוח קשה ודורש בדרך כלל מבחני מותאם. מיקרו Rna (miRNAs), עם זאת, אשר מייצגים את שיעור קטן של מולקולות RNA פורש רק עד ~ 18 – 24 נוקלאוטידים, הוכחו לעמוד לאחסון לטווח ארוך, יש נותחו בהצלחה בדגימות FFPE. כאן אנו מציגים 3′ לבר-קוד משלים דנ א (cDNA) ספריית הכנה פרוטוקול במיוחד ממוטבים לניתוח של RNAs קטן שחולצו מן הרקמות שאוחסנו בארכיון, אשר הודגם לאחרונה להיות חזקים מאוד לשחזור בעת שימוש בארכיון דגימות קליניות מאוחסן עד 35 שנים. הכנת ספריה הוא מותאם לניתוח מולטיפלקס של החומר נחשף/השפיל בהם דוגמאות RNA (עד 18) מאתרים עם מתאמי לבר-קוד בודדות 3′, ואז איחדו יחד על ההכנות אנזימטי וביוכימי עוקבות לפני ניתוח. כל purifications מתבצעים על ידי לזיהוי בג’ל (עמוד), אשר מאפשר הבחירות הספציפיות גודל ו enrichments מינים RNA קטנים לבר-קוד. הכנת ספריית cDNA הוא מותאם תשומות RNA דקה, כמו טייס תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) מאפשרת קביעה של מעגל הגברה מסוימת לייצר סכומי מיטביים של חומר עבור הדור הבא רצפי (הגדרות). גישה זו היה מותאם לשימוש של RNA מפורק FFPE של דגימות בארכיון עד 35 שנים ומספק ביותר לשחזור נתונים המיתרים.

Introduction

miRNAs ההכפלה שמורים להפליא היטב פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) דגימות1,2,3. העבודות הקודמות הוכיחה כי הביטוי של אלה קצרה תקינה ללא קידוד יחיד נטושים מולקולות RNA יכול בהצלחה להעריך באמצעות RNA הכולל מדגימות FFPE, לספק נתונים ביטוי גנים הרלוונטיים בהשוואה הטרייה המקורי רקמות4,5,6,7,8. בהשוואה RNAs שליח גדול, אשר הוכחו להיות מושפעת באופן ביקורתי עיבוד רקמות (פורמלדהיד, חום, לייבוש, וכו ‘) FFPE, RNases אנדוגני, הגיל של דגימות, גודל קטן של miRNAs (~ 18 – 24 נוקלאוטידים) מופיעה כדי שיהיו עמידים בפני השפלה וגמיש לאחסון לטווח ארוך, גם הדגימו באמצעות מחקרים ביטוי miRNA לפעול טוב יותר תפוקה גבוהה לימודי ה-mRNA דגימות בארכיון9. miRNA ביטוי מחקרים באמצעות דגימות קליניות בארכיון, אשר רובם בוצעו בניתוח בקנה מידה קטן, הפגינו הסינגל או מרובב מבחני ה-PCR כמותי, סוגים שונים של טכנולוגיות microarray, ולאחרונה המיתרים יכול ניתן להשתמש כדי להעריך את הביטוי של miRNAs נשמר לאחר אופטימיזציה של אלה מבחני10,11,12,13,14.

בהתחשב בכך dysregulation של הביטוי miRNA היה קשור עם פיתוח מגוון רחב של גידולים ממאירים האנושית, שיש כאן פוטנציאל אטומטי העצום של קלינית מבואר דגימות בארכיון, זה הפך להיות לכאורה כי אלה RNA קטנים מולקולות מייצגים מבטיח מקור פוטנציאלי סרטן סמנים ביולוגיים15,16,17,18. השימוש בטכנולוגיה ביטוי גנים תפוקה גבוהה כגון הגדרות יש את היתרון של מתן הערכה גלובלית של כל הפרוטוקולים miRNA בהשוואה לטכנולוגיות יישוב כגון PCR ו/או מיקרו-מערכים19. מסיבה זו, פרוטוקול ממוטבת, ובמחיר בקלות החלים על הכנה ספריית cDNA של RNAs קטנים של מבוגר דגימות בארכיון עבור הגדרות אופטימלי כדי לאפשר מחקרים רטרוספקטיבית רחבת היקף20.

הקמנו בעבר פרוטוקול מיצוי RNA/DNA סימולטני להתאוששות נפרדים של RNA ו- DNA דגימות בארכיון בוגרים, אשר מצאנו כדי לפעול טוב יותר עכשווי קיטים מסחריים21. באמצעות פרוטוקול זה החילוץ, כדי להשיג RNA הכולל רקמות FFPE בארכיון לתקופה ממושכת של פעמים, אנו אופטימיזציה ההכנה של ספריות cDNA המיתרים של miRNAs המשומרים דגימות קליניות עד 35 שנים. יתרה מכך, במחקר שפורסם לאחרונה שבו הכנו cDNA ספריות קרצינומה ductal קלינית מסווג , באתרו (DCIS) דגימות, זיהינו באופן שונה ביטוי miRNAs היו לאימות על ידי PCR כמותי, אשר הצביע כי שינויים בביטוי miRNA מסוימים עשויים להיות לזיהוי בנגעים DCIS מחולים מי לפתח סרטן השד בהשוואה ל- DCIS נגעים של חולים אשר אינם מפתחים סרטן השד.

בהתחשב העלות של ערכות מסחריות להכנה של ספריות cDNA RNA קטנים, את הפוטנציאל שלהם הפסקה, כמו גם את השימוש ריאגנטים המוגנים בזכויות יוצרים/פטנט שלא יכול להיות מוטב, החלטנו להתאים שפורסמו בעבר מבוסס המעבדה ונטולת ערכת 3′ לבר-קוד cDNA ספריית הכנת פרוטוקול עבור הגדרות של RNAs קטן בארכיון ב FFPE דגימות, המאפשר ניתוח בו זמנית של 18 דוגם22. פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב אידיאלי וחזק עם הערכה הטכניים מחסומים, שהיו קריטי עבור ההסתגלות דגימות FFPE RNA, ויש לו פוטנציאל חזק עבור יישום למקורות אחרים של פרוץ או קשה כדי להשתמש בחומר RNA. הישימות של הפרוטוקול המקורי היה משופר על ידי החלפת סמני גודל radioactively שכותרתו עם פלורסנט (למשל, זהב SYBR) לזיהוי סמני גודל של RNA, בשימוש במהלך הבחירה של ספריות מחוברים על גדול לזיהוי ג’לים. פרוטוקול ממוטבת זה מסתמך על מצדו של 3′ מתאמי לבר-קוד כדי 18 דגימות FFPE RNA בודדים, אשר ואז איחדו יחד לעבור 5′ מתאם מצדו, הפוכה-תמלול ולאחר ניתוח PCR פיילוט עבור המותאמים הגברה של cDNA סופית ספריית לפני בקנה מידה גדול PCR הגברה טיהור, המיתרים על ברצף תפוקה גבוהה.

Protocol

1. הכנת כל ריאגנטים, תחל

  1. להזמין כל תחל ומתאמי כמתואר באיור1.
  2. הכינו כיל המקנה קוקטייל, אשר עלה בכל מצדו בודדים.
    1. Resuspend oligonucleotide המוביל (איור 1) 0.5 מיקרומטר עם RNase ללא מים. Resuspend את oligonucleotides כיל 10 (איור 1) 100 מיקרומטר באמצעות הפתרון oligonucleotide 0.5 מיקרומטר המוביל.
    2. לשלב 10 µL של כל אחד כיילים 10 ב microcentrifuge siliconized לרכוש מניות כיל קוקטייל 100 מיקרומטר, ולהכין פתרון nM 0.026 לאחסון ב-20 ° C.
  3. לדלל את המתאמים 3′ ייחודי, lyophilized, adenylated 20 במים נטולי RNase ריכוז סופי של 50 מיקרומטר (איור 1).
    הערה: מומלץ להכין 2.5 µL aliquots מ בכל מתאם צינורות בודדים siliconized ולאחסן אותם ב- 80 ° C עד 2 שנים.
  4. Resuspend desalted 19 nt-3′ מתאם ו- nt 24-3′ מתאם גודל סמן oligonucleotides כדי 250 ננוגרם למ”ל (איור 1).
  5. Resuspend המתאם מטוהרים 5′ HPLC 100 מיקרומטר עם RNAse ללא מים. Resuspend 5′ ו 3′ תחל PCR ל-100 מיקרומטר באמצעות מים נטולי RNase (איור 1).
    הערה: Aliquot כל oligonucleotides בכמויות הדרושות 1 – 2 ניסויים וחנות ב-80 מעלות צלזיוס.
  6. להכין את לזיהוי denaturing ג’ל (במספר דוכנים) טוען צבע על-ידי שילוב formamide 98.8%, 1% (v/v) 0.5 M נה2H2 EDTA, pH 8.0 וכחול bromophenol 0.2% וקבע 1 מ”ל aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
    1. הכינו את הפתרון EDTA 0.5 M נה2H2 על-ידי הוספת 18.6 גר’ נה2H2 EDTA אבקה 50 מ של מים נטולי נוקלאז. להוסיף כדורי NaOH להגיע pH 8.0. לכוון את עוצמת הקול כדי 100 מ ל להשיג 0.5 M נה2H2 EDTA, פתרון מניות pH 8.0.
    2. שוקל 15 מ ג של bromophenol כחול בשפופרת נפרד 15 מ”ל. הוסף µL 600 של נוקלאז ללא מים. הוסף 14.25 מיליליטר formamide מיוננים. להוסיף 150 µL של 0.5 M נה2H2 EDTA, פתרון ה-pH 8.0.
    3. Aliquot הפתרון הסופי במספר דוכנים של 15 מ ל 1 מ”ל aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
  7. להכין 5 x agarose ג’ל בטעינת צבע על ידי שילוב של כחול bromophenol 0.2% 0.2% קסילן cyanol FF, 50 מ מ נה2H2 EDTA, pH 8.0, 20% סוג Ficoll-400.
    1. Resuspend g 1.86 נה2H2-EDTA ב 50 מ של מים נטולי נוקלאז בתוך 400-mL-פגים בטמפרטורת החדר (RT). להוסיף כדורי NaOH להגיע pH 8.0. מוסיפים מים נטולי נוקלאז להגיע 100 מ ל. להשיג 50 מ מ נה2H2 EDTA פתרון.
    2. שוקל 20 מ ג של אבקת bromophenol כחול, 20 מ ג של קסילן cyanol FF אבקת ו- 2 גר’ אבקה סוג Ficoll-400, resuspend ב 5 מ של 50 מ מ נה2H2 EDTA.
    3. מערבולת הצינור המכיל את שלושת צבעי ולהוסיף 5 מ של 50 מ מ נה2H2 EDTA. לערבב לצבוע 5 x agarose ג’ל הטעינה, להכין aliquots 1 מ”ל ו לאחסן ב- 80 ° c

2. להגדיר את 3′ לבר-קוד מתאם Ligations עם דוגמאות בודדות RNA 18

  1. לזהות דגימות RNA בודדים 18 (pre-aliquoted ב-100 ng ב- 9.5 µL של מים נטולי נוקלאז 1.5 mL siliconized microcentrifuge צינורות), ולהגדיר הצינורות על הקרח להפשיר במשך 10 דקות.
  2. הכינו את 10 x RNA מאגר ליגאז (ללא ATP) טריים.
    1. בצינור microcentrifuge 1.5 mL siliconized, לשלב µL 343 RNase ללא מים, µL 500 של טריס 1 מ’ pH 7.5, 100 µL של 1 מ’ MgCl2, µL 50 של אלבומין שור 20 מ”ג/מ”ל ו µL 7 של 14 מ’ מרקפטואתנול. מיקס על ידי מצליף את הצינור, צנטריפוגה 2 s-2000 x g ו RT ו- set על קרח.
      הערה: כל השלבים פרוטוקול זה להצביע על “צנטריפוגה 2 s” מבוצעות ב- microcentrifuge benchtop-RT, מהירות מירבית של 2,000 x g לאסוף פתרונות לחלק התחתון של הצינורות.
  3. להכין מלאי דימתיל סולפוקסיד מימית 50% על-ידי הוספת 1 מ”ל של RNase ללא מים 1 מ”ל של דימתיל סולפוקסיד צינור microcentrifuge siliconized 2 מ”ל, לעטוף את הצינור בנייר אלומיניום ו לאחסן ב- RT.
  4. להפשיר את הקוקטייל כיל 0.026 ננומטר על קרח במשך 10 דקות להכין תערובת מצדו מאסטר ע י שילוב של הסדר הבא בצינור microcentrifuge 1.5 mL siliconized: 40 µL של 10-מאגר ליגאז RNA ו- 120 µL של 50% דימתיל סולפוקסיד מימית באמצעות פיפטה של 200 מ ל , ולהוסיף 10 µL של כיל nM 0.026 קוקטייל באמצעות פיפטה של 10 µL. קפיצי צינור 1.5 mL כדי לערבב, צנטריפוגה עבור s 2, והינו ממוקם זה על קרח.
  5. הוסף µL 8.5 של מיקס מאסטר מצדו לכל אחת הדגימות FFPE RNA בנפרד aliquoted 18, קפיצי בעדינות את הצינורות, צנטריפוגה 2 s ו החנות על קרח.
  6. הפשרה 2.5 aliquots µL מכל לבר-קוד המתאמים 3′ 18, ומניחים על הקרח להפשיר במשך 20 דקות.
    1. להשתמש על פיפטה 3-µL כדי להעביר µL 1 של כל מתאם הדגימות FFPE RNA המתאימים המכיל RNA ומיקס מאסטר מצדו (קרי, 9.5 µL + 8.5 µL).
    2. לא פיפטה למעלה ולמטה, פשוט לוותר על תוך הנוזל, להוציא את הטיפ. הקפד לשנות את עצות בין דגימות FFPE RNA. לסגור כל שפופרת, קפיצי לערבב, צנטריפוגה עבור 2 s, ו- set על קרח.
  7. Denature את התגובות על ידי הנחת הצינורות 18 על גוש חום ב 90 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה ולאחר מכן מקם באופן מיידי על קרח.
  8. הכן הפתרון אנזים מצדו על ידי המדללת µL 10 K227Q קטום T4 רנ א ליגאז 2 עם µL 10 של RNase ללא מים לתוך צינור microcentrifuge טריים siliconized 1.5 mL.
  9. להשתמש על פיפטה 3 µL להעביר µL 1 של האנזים מצדו מדולל לתוך כל הדגימות RNA 18 (לא פיפטה למעלה ולמטה, ולהחליף טיפים בין כל שפופרת). להגדיר את ligations 18 על קרח ומניחים בתוך חדר קר 4 ° C דגירה לילה של 18 h.

3. טיהור של RNAs קטנים מחוברים

  1. לבטל את תגובות מצדו על-ידי הנחת הצינורות 18 עבור 1 דקות על גוש חום ב 90 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להחזיר קרח למשך לפחות 2 דקות להתקרר.
  2. הכינו את התמהיל משקעים מאסטר על-ידי הוספת 1 µL של צבע כחול covalently קשורה גליקוגן ל 26 µL של 5 מ’ RNase ללא NaCl לתוך צינור microcentrifuge siliconized טריים.
    1. העברת µL 1.2 של המיקס משקעים מאסטר לתוך כל הצינורות 18. להוסיף כל אחד הצינורות 18 µL 63 של 100% אתנול. לסגור כל שפופרת, קפיצי כדי לערבב, צנטריפוגה עבור 2 s והמקום הצינורות על קרח. לשלב את התוכן של כל הצינורות 18 לתוך צינור 1.5 מ ל יחיד siliconized.
    2. לסגור את הצינור, היפוך שלוש פעמים כדי לערבב, צנטריפוגה s 2, ואת המקום על קרח למשך 60 דקות לזרז.
  3. היכונו גדולים (16 x 20 ס מ2) 15% לזיהוי ג’ל דף.
    1. שני cast siliconized צלחות זכוכית (שטופלו אלטרנטיבה בטוחה ציפויים silane) עם מפרידי 0.1 ס”מ.
    2. לשלב 9 מ של מערכת diluent, 18 מ של רכז מערכת, 3 מ”ל של מערכת מאגר, 240 µL של APS (9%) ו- µL 12 של TEMED בשפופרת 50 מ.
    3. להעביר את הפתרון ג’ל דף בין צלחות זכוכית באמצעות פיפטה של 30-mL, להוסיף מסרק 14-טוב (0.1 ס מ עבה), והנח את הג’ל לחזק ב- RT למשך 30 דקות.
  4. Centrifuge ברכבת התחתית 1.5-mL עם ligations במאגר-16,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  5. הסר את המסרק. לנקות את הבארות בשפע במים נטולי RNase באמצעות בקבוק מים עם טיפ 200 µL בקצה שלו כדי להגיע בתוך הבארות, כוח האו ם polymerized אקרילאמיד החוצה (באר אחת בכל פעם) מעל הכיור. הגדרת ה-15% דף על מנגנון ג’ל, למלא את המאגרים 0.5 x טריס-בוראט EDTA (TBE) פתרון, ולהפעיל מראש את הג’ל במשך 30 דקות ב-450 V.
  6. להתאושש ברכבת התחתית עם ligations במאגר לצנטריפוגה ויבש בקפידה בגדר RNA.
    1. הסר את תגובת שיקוע עם טיפ 1-mL פיפטה אך נוזל בחלק התחתון. להטות את הצינור ולהשתמש פיפטה 20 מ”ל כדי להסיר את תגובת שיקוע שנותרו בלי לגעת בגדר. אבק לשאוב את הצינורית באמצעות פיפטה של פסטר עם טיפ 10-µL על קיצה, מבלי לגעת בגדר.
    2. Resuspend בגדר RNA ב 20 µL של מים נטולי RNase על ידי מצליף את הצינור. הוסף 20 µL של ג’ל במספר דוכנים טעינת פתרון resuspend של RNA, קפיצי לערבב, צנטריפוגה 2 ישב RT, ולא להגדיר את הצינור ºC 90 דקות 1 ולאחר מכן מקם מיד על קרח.
  7. החלף 0.5 x TBE על מנגנוני ג’ל עם טרי 0.5 x TBE, העומס הסולם, סמני גודל, מחוברים miRNAs במרכז של הג’ל, להשאיר ריק 2 בארות משני הצדדים (איור 2).
  8. להפעיל את הג’ל ב-450 V (35 mA) עבור 60 דקות, להשהות במנוסה למשך 10 דקות להתקרר, ולהפעיל שוב ב- 520 V (25 מא) עבור מינימום 60 עוד Uncast של 15% דף על-ידי הסרת באחד הזכוכיות.
  9. בקלילות לרסס את הג’ל יושב על לוח הזכוכית הפלורסנט פתרון (10 µL) ב 25 מ של 0.5 x TBE, ולתת אותו לשבת במול במשך 5 דקות בחושך.
  10. להניח את הכוס עם הג’ל על transilluminator אור כחול, וליישר שני 19 nt ו- 24 סמני גודל nt עם סרגל לכוון הכריתה של RNAs קטנים מחוברים (איור 2). לסלק את הג’ל.
  11. מקם את הג’ל נכרת בשפופרת 0.5 mL, שנועדה קטע פרוסות ג’ל, ממוקם היטב לתוך צינור 1.5-mL siliconized microcentrifuge. Centrifuge ב 16,000 x g למשך 3 דקות ב- RT. Resuspend את הג’ל מפוצלים עם µL 300 400 מ מ פתרון NaCl, סגור את הצינור ולאחר לאטום אותו עם הסרט פרפין.
  12. להגדיר את הצינורית על עצבנות-thermomixer-1,100 סל ד חדר קר 4 ° C דגירה לילה (h 16-17).

4. מצדו של המתאם 5′

  1. להעביר את הפתרון ואת ג’ל מפוצלים למסנן 5 מיקרומטר צינור יושבים בתוך צינור 1.5 mL siliconized לאטום עם סרט פרפין, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 2,300-g ו- RT.
  2. להוסיף µL 950 של 100% אתנול הפתרון מסוננים, לסגור את הצינור, ‘ היפוך ‘ כדי לערבב, צנטריפוגה 2 s, לאטום את הצינור עם סרט פרפין, וקבעו בקרח לשעה.
  3. הכן של % 12 דף ג’ל כפי שמתואר בשלב 3.3, אבל לשלב 12.6 מ של diluent, 14.4 מ ל תרכיז, 3 מ”ל של מאגר 240 µL APS, 12 µL של TEMED לתוך צינור 50 מ. מראש להפעיל את 12% דף ג’ל למשך 30 דקות ב-450 V (~ 35 mA) ב- 0.5 x TBE.
  4. Centrifuge הפתרון מטוהרים RNA קטנים ב g 16,000 x עבור 60 דקות ב 4 º C.
  5. פיפטה בזהירות החוצה תגובת שיקוע באמצעות פיפטה 1 מ”ל להסיר את עיקר הפתרון ולהשתמש פיפטה 200-mL כדי להסיר את הפתרון הנותרים, מבלי לגעת בגדר.
  6. בזהירות באמצעות פיפטה של פסטר עם טיפ 10 מ”ל בקצה שלו מחובר flask ואקום, יבש בגדר מבלי לגעת בו.
  7. Resuspend בגדר ב 9 µL של מים נטולי RNase ללא pipetting למעלה ולמטה, אבל על ידי מצליף בקלילות את הצינור, צנטריפוגה עבור 2 s, ולהגדיר הצינורית על קרח.
  8. הכן את 10 x RNA מאגר ליגאז (עם ATP) טריים על ידי שילוב של 500 µL של 1 מ’ טריס pH 7.5, 100 µL של 1 אם MgCl2, µL 50 של 20 מ”ג/מ”ל acetylated BSA, 200 µL 10 מ מ ATP, 7 µL של מרקפטואתנול 14 מ’ , ואת µL 143 RNase ללא מים.
  9. לערבב את 10 x RNA מאגר ליגאז (עם ATP) על ידי מצליף את הצינור, צנטריפוגה 2 s כדי לאסוף את הפתרון בתחתית הצינורית.
  10. הגדר את מתאם מצדו 5′ על-ידי הוספת 2 µL של 10 x RNA מאגר ליגאז (עם ATP), µL 1 מיקרומטר 100 5′ מתאם ו 6 µL 50% מימית דימתיל סולפוקסיד µL 9, 3′ לבר-קוד קטן RNA פתרון.
  11. קפיצי צינור בקלילות כדי לערבב, צנטריפוגה 2 s כדי לאסוף את הפתרון, למקם את הצינורית על גוש חום ב 90 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, חזרה על קרח למשך לפחות 2 דקות.
  12. להוסיף 2 µL של T4 רנ א ליגאז 1 בתוך תמיסת (לא פיפטה למעלה ולמטה), קפיצי ברכבת התחתית, צנטריפוגה 2 s, יושבים צינור צף לארון תקשורת בתוך אמבט מים 37 º C למשך 60 דקות.
  13. במקביל, להגדיר שני ligations בין 19 nt-3′ מתאם מתאם 5′ ואת שני ligations בין nt 24-3′ מתאם ואת המתאם 5′.
    1. לשלב 2 µL של 19nt-3′ מתאם (250 ng/µL) או nt 24-3′ מתאם (250 ng/µL) עם: 2 µL של 5′ מתאם (100 מיקרומטר), 2 µL של 10 x RNA מאגר ליגאז (עם ATP), µL 6 של 50% דימתיל סולפוקסיד מימית, µL 6 RNase ללא מים , ו- 2 µL של T4 רנ א ליגאז 1 צינור microcentrifuge 1.5 mL siliconized.
    2. קפיצי הצינורות כדי לערבב, צנטריפוגה 2 s, ואת מערכת הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  14. להוסיף 20 µL מאגר Denaturing על כל ligations (מטוהרים RNAs קטן, ligations 2 עם 19nt-3′ מתאם ולאחר ligations 2 עם 24nt-3′ מתאם).
    1. מיקס על ידי מצליף הצינורות, צנטריפוגה 2 s, דגירה הצינורות על גוש חום ב 90 ° C עבור 1 הגבלת העברת צינורות כל לקרח, ואת להכין סולם (3 מ”ל של סולם עם 20 µL של במספר דוכנים).
  15. לרוקן את המאגר העליון של המנגנון ג’ל עם הפעלה מראש 12% עמוד ג’ל, ולהוסיף טריים-0.5 x TBE פתרון מתחת לרמת הבארות (בארות מתרוקנות עם פיפטה עצה ארוך, דק).
    1. לטעון את הדגימות עם טיפ פיפטה דק, כמתואר באיור3.
    2. שימוש 0.5 טריים x TBE למלא בארות בודדים לחלק העליון של הג’ל.
    3. להוסיף 0.5 טריים x TBE למאגר המים מעל בארות ולהתחיל אלקטרופורזה של 12% הדף עבור 60 דקות ב-450 V (~ 35 אמא).
    4. השהה ההפעלה בכך שאכבה את הגנראטור בשביל 10 דקות להתקרר הג’ל. הפעל מחדש את הגנרטור ולהפעיל את הג’ל במשך 60 דקות-520 V (~ 25 מא).
  16. לעצור את הגנרטור, לרוקן את מאגרי מים על-ידי היפוך המנגנון מעל הכיור ואת uncast של % 12 דף על-ידי הסרת באחד הזכוכיות.
  17. שב הזכוכית עם הג’ל שטוח, לרסס את הג’ל עם 10 µL של הפלורסנט ב 25 מ ל 0.5 x TBE, דגירה בחושך במשך 5 דק להניח את הכוס עם הג’ל על transilluminator אור כחול, ואני ישר שני 19 nt ושני 24 nt גודל הסמנים עם סרגל לכוון הכריתה של RNAs קטנים מחוברים (איור 3).
    1. לסלק את הג’ל ולהעביר את החתיכה ג’ל נכרת לתוך צינור מפסק 0.5 מ ל ג’ל. לסגור את הפקק של הרכבת התחתית מפסק ג’ל, הגדר לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL siliconized ומאובטחת עם סרט פרפין. הסר את הצינור מפסק ג’ל, להוסיף 300 µL של 300 מ”מ NaCl, µL 1 של 100 מיקרומטר 3′ ה-PCR פריימר החלקים ג’ל כתוש צינור 1.5 מ.
    2. חותם את הצינור עם פרפין סרט על עצבנות-thermomixer-1,100 סל ד ב 4 מעלות צלזיוס, למשך הלילה (17 – 18 h) בחדר קר.

5. הפוך שעתוק של 5′ מאתרים ו 3′ RNAs קטנים לבר-קוד טהור

  1. אחזר הצינור מן thermomixer מסנן לטהר את הפתרון עם צינור מסנן 5 מיקרומטר.
    1. שימוש פיפטה 1 מ”ל להעביר את הפתרון על גבי צינור מסנן 5 מיקרומטר מוכנס לתוך mL 1.5 siliconized נטולת RNase אוסף שפופרת. Centrifuge את הצינור למשך 3 דקות על 2,300-g ו- RT.
    2. למחוק את הצינור מסנן ולהוסיף µL 950 של 100% אתנול הצינור microcentrifuge 1.5 mL אוסף המכיל את פתרון מסונן. היפוך צינור כדי לערבב, צנטריפוגה s 2, ואת המקום על קרח במשך 60 דק התמיסה הרנ א הצניפה מאת צריך שתוציאו את הצינור ב- 16,000 x g ו- 4 ° C עבור 1 h.
  2. יבש בגדר RNA.
    1. פתח את הפקק, הסר בזהירות את תגובת שיקוע עם פיפטה 1-mL, עוזב נוזל בחלק התחתון.
    2. השתמש פיפטה 20 µL כדי להסיר כל תגובת שיקוע שנותרו בלי לגעת בגדר. להטות את הצינור כדי לאפשר פתרון לשבת בצד הנגדי של בגדר.
    3. השתמש פיפטה של פסטר עם טיפ לא מסונן פיפטה של 10 מ”ל וארוקן את תגובת שיקוע, יבש בגדר באמצעות ואקום.
  3. Resuspend בגדר RNA ב- 5.6 µL RNase ללא מים.
    1. להפשיר את ריאגנטים שעתוק במהופך על הקרח במשך 15 דקות להגדיר את תגובת שעתוק במהופך על-ידי הוספת 3 µL של 5 x מאגר µL 4.2 של 10 x deoxynucleotide טריפוספט (dNTPs) (כל 2 מ”מ), 1.5 µL של dithiothreitol (DTT) µL 5.6 של RNase-חופשית resuspended גלולה.
    2. קפיצי בעדינות את הצינור כדי לערבב את התגובה, צנטריפוגה 2 s כדי לאסוף את הפתרון. להגדיר את התגובה על גוש חום ב 90 מעלות צלזיוס במשך 30 בדיוק s והעברת ואז ישירות על גבי thermomixer ב- 50 מעלות צלזיוס.
    3. להשאיר את הצינור thermomixer למשך 2 דקות כך הטמפרטורה equalizes. הוסף µL 0.75 של האנזים שעתוק במהופך ישירות פתרון, פליק בעדינות כדי לערבב, ולהגדיר הצינור בחזרה thermomixer ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות מיד.
  4. לאחר 30 דקות, להעביר את הצינור גוש חום ב 95 ° C עבור 1 דקות להפסיק שעתוק במהופך. להוסיף µL 95 נטול RNase מים ישירות שעתוק במהופך, קפיצי צינור כדי לערבב, ולהגדיר אותו ישירות על קרח למשך 2 דקות.
  5. תווית ברכבת התחתית עם מזהה ספריית המלאי ואת ספריית cDNA

6. טייס ה-PCR ו- PCR בקנה מידה גדול הגברה

  1. להכין מאגר x PCR טרי 10 על-ידי הוספת µL 304 RNase ללא מים, µL 125 של 2 מ’ אשלגן כלורי, µL 50 של 1 מ’ טריס pH 8.0, µL 10 של 1 מ’ MgCl2, 5 µL של 1% טריטון µL X-100, ו- 6 של 1 מ’ מרקפטואתנול, צינור siliconized microcentrifuge , ולשמור על RT.
  2. להרכיב את התגובה PCR טייס על ידי שילוב של µL 67 RNase ללא מים, µL 10 של 10 x מאגר ה-PCR, 10 µL 10 x dNTPs, µL 0.5 מיקרומטר 100 5′ PCR פריימר, 0.5 µL של 100 מיקרומטר 3′ ה-PCR פריימר, 10 µL של cDNA ספריית המלאי ו 2 µL של 50 x Taq פולימראז.
    1. להגדיר את שני ה-PCR מחזורים על thermocycler כדלקמן: קובץ 1: 94 ° C עבור 45 s, 50 ° C עבור 85 s, ו-72 מעלות 60 s 10 מחזורים, להחזיק ב 4 ° C; קובץ 2: 94 ° C עבור 45 s, 50 ° C עבור 85 s, ו-72 מעלות 60 s עבור 2 מחזורים, להחזיק ב 4 º C. להגדיר את התגובה PCR טייס ב thermocycler ולהתחיל קובץ 1.
    2. בסוף הקובץ 1, פתח הצינור PCR ולאחר באמצעות פיפטה 20 µL, העברה µL 12 מן התגובה PCR הטייס לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL המכיל 3 µL של 5 x ג’ל בטעינת צבע, לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה, לסגור את הצינור , עם מדבקה “10 מחזורים”.
    3. לסגור את הצינור טייס PCR ולהתחיל קובץ 2 על thermocycler. בסוף הקובץ 2, פתח צינור PCR להשתמש פיפטה 20 מ”ל להעביר µL 12 של פתרון לתוך צינור 1.5-mL microcentrifuge עם 3 µL של 5 x צבע הטעינה ג’ל ו באותיות”12 מחזורים”.
    4. חזור על השלבים המתוארים בשלבים 6.2.2 ו 6.2.3 לאסוף 12 מוצרים PCR µL מן התגובה טייס PCR-PCR מחזורים 14, 16, 18, 20. להוסיף 3 µL של 5 x צבע ג’ל הטעינה לכל אחד aliquots ה-PCR µL 12, עם הסולם nt 20 המכילה 3 µL של הסולם, µL 9 RNase ללא מים.
  3. הכנת ג’ל agarose 2.5% עם 0.5 x TBE.
    1. שוקל 2.5 גר’ agarose בתוך נקי ולהוסיף 100 מ של 0.5 x TBE. לחמם את הפתרון במיקרוגל עד הלילה. הסר את הפתרון של המיקרוגל, מערבולת את הבקבוק כדי לערבב את agarose, להוסיף 4 μL של אתידיום ברומיד (10 mg/mL), ולהעביר את הפתרון למגש 7 x 10 ס מ2 אלקטרופורזה, סגורים משני הכיוונים עם קלטת.
    2. הגדר את המסרק 8-ובכן ולתת את הג’ל agarose לחזק ב- RT. העברת agarose הקרושה ג’ל לתוך מכשירים אלקטרופורזה מלא 0.5 x TBE.
  4. לטעון את הסולם ודוגמאות PCR על הג’ל agarose, ולהפעיל אותו למשך 30 דקות-120 V.
  5. להעריך את הג’ל על קופסת UV כדי לזהות מחזור PCR אופטימלית (איור 4A).
    הערה: הגודל של הלהקות PCR הצפויה מוצג באיור 4B.
    1. להתבונן שתי הלהקות PCR בכל אחד מן הבארות שונים (הלהקה העליון: ספריית ה-DNA, הלהקה התחתון: פריימר הדימרים).
    2. לזהות את מחזור PCR נאותה עבור הגברה cDNA על-ידי בחירת מחזור שבו ספריית cDNA גלוי, אך הדימרים פריימר הם בקושי נצפות.
      הערה: בדרך כלל, מחזור PCR נאותה נבחרה בין 12-16 מחזורים. על דמות 4A, מחזור PCR נאותה עבור ספריה זו הוא 14.
  6. להגדיר את תגובות PCR בקנה מידה גדול (6 x 100 µL) עבור agarose ג’ל ספריית טיהור.
    1. להכין את שפופרת טריים של 10 x מאגר ה-PCR בעקבות צעד 6.1.
    2. הכינו את התמהיל PCR מאסטר בקנה מידה גדול צינור 1.5 mL על ידי שילוב של µL 435.5 של מים נטולי RNase, 65 µL 10 x PCR מאגר, 65 µL של 10 x dNTPs, 3.25 µL של 5′ PCR פריימר, 3.25 µL של ה-PCR פריימר 3′ ו pipetting למעלה ולמטה כדי לערבב.
    3. העברת µL 88 של המיקס PCR מאסטר לתוך 0.5 mL שש המבחנות. העברת µL 10 של cDNA ספריית המלאי (מאוחסן על קרח), להוסיף 2 µL של 50 x Taq פולימראז לתוך כל אחד המבחנות 6, פיפטה לערבב.
    4. הכן צינור התגובה PCR שלילי על ידי שילוב של µL 77 RNase ללא מים, 10 µL 10 x PCR מאגר, 10 µL של 10 x dNTPs, 0.5 µL של ה-PCR פריימר 5′, 0.5 µL של ה-PCR פריימר 3′ ו 2 µL של פולימראז x Taq 50, פיפטה לערבב.
    5. מקם את המבחנות thermocycler באמצעות מחזור PCR שמתואר בשלב 6.2.1 ולהגדיר המספר האופטימלי של הגברה מחזורים. הכנת ג’ל agarose 2.5% באמצעות 0.5 x TBE, כפי שמתואר בשלב 6.3.
  7. לאחר הגברה PCR, להעביר 9 µL מ כל שפופרת PCR לתוך 6 צינורות microcentrifuge 1.5 mL המכיל 3 µL של 5 x ג’ל הטעינה לצבוע.
    1. הכן סולם nt 20 על ידי שילוב של 3 מ”ל של הסולם לתוך µL 9 של מים נטולי RNase הוספת ג’ל 3 µL בטעינת צבע לתוך צינור 1.5 מ.
    2. לטעון את הסולם, שליטה PCR שלילי ומוצרים 6 PCR על גבי הג’ל agarose, ולהפעיל את הג’ל במשך 30 דקות-120 V.
    3. ודא אחידות amplifications ה-PCR בין נתיבים על תיבה UV (קח תמונה).
    4. שלב 3 תגובות PCR לתוך 1.5 mL siliconized שני microcentrifuge tube (3 x 91 µL), מוסיפים µL 27 של 5 M NaCl 950 µL של 100% אתנול. היפוך הצינורות כדי לערבב להגדירם ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כדי לזרז את המוצרים ה-PCR.

7. cDNA ספריית טיהור והערכה

  1. Centrifuge שני צינורות עם תגובות PCR-16,000 g x עבור 60 דקות ב 4 º C.
  2. להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה 1 מ”ל, ולאחר מכן להטות את הצינור עם בגדר בצד העליון ונוזלים בצדו התחתון, ולהשתמש פיפטה פסטר מחובר flask ואקום עם אמבט, תשאף נוזל עם טיפ 10 מ”ל בסוף פיפטה פסטר.
  3. להגדיר את התקציר PmeI.
    1. Resuspend אחד של כדורי ה-PCR עם µL 17.5 נוקלאז ללא מים, ולהעביר בגדר resuspended בגדר PCR השני. להוסיף 2 µL של 10 x מאגר ו- 0.5 µL של האנזים PmeI, ולהגדיר לעכל את אמבט מים עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
    2. הכנת ג’ל agarose 2.5% באמצעות 0.5 x TBE (שלב 6.3). להוסיף 6 µL של 5 x צבע ג’ל הטעינה התקציר. העברת µL 13 של כל תקציר לתוך שתי בארות סמוכים של הג’ל agarose, לטעון את הסולם גודל nt 20 ב הבארות קצה, ולהפעיל את הג’ל במשך 90 דקות ב 150 V (איור 4D).
    3. בלו הלהקות PCR העליון של הג’ל על הקופסא UV, להעביר את החלקים ג’ל לתוך צינור microcentrifuge טרי שנשקל mL 1.5 ולאחר שוקל החלקים ג’ל בקנה מידה.
  4. לטהר ספריית cDNA מוגבר PCR נכרת באמצעות ערכת חילוץ ג’ל ההוראות של היצרן. לכמת את ספריית cDNA באמצעות DNA כימות assay בכלי, ההוראות של היצרן.
  5. להעריך את גודל ואת הטוהר של ספריית cDNA עם שבב דנ א רגישות גבוהה על Bioanalyzer (איור 5). רצף ספריית cDNA באמצעות מערכת תפוקה גבוהה. להעביר את קובץ הנתונים FASTQ הצינור RNAworld עבור מתאם חיתוך ויישור כדי הגנום האנושי כדי לזהות את רצפי miRNA.

Representative Results

Discussion

פרוטוקול הכנה ספריית cDNA חזקים הדירים מאוד עבור הגדרות של RNAs קטן בארכיון ב- FFPE RNA דגימות מוצג פרוטוקול זה, אשר היא גרסה שהשתנתה וממוטב של ההליך המתואר על ידי Hafner. et al. 22

כל השלבים של פרוטוקול זה מוטבו לשימוש עם בוגרים RNA הכולל, בארכיון, פרוץ התאוששה FFPE דגימות. השלב מפתח של פרוטוקול זה, לעיבוד כמויות קטנות של FFPE RNA, שוכן איגום של כל הדגימות RNA (קרי, 18 בודדים 100 ננוגרם FFPE RNA דגימות) לאחר ligations בודדים עם לבר-קוד המתאמים ייחודי 3′ 18. שלב קריטי זה מאפשר הדגימות FFPE RNA 18 לעבור בצורה אחידה לכל הביוכימי, אנזימטי והשלבים הכרחי עבור הכנה של ספריית cDNA RNA קטנים. בנוסף, שלב זה מגדיל את כמות ה-RNA שעברו precipitations ו- purifications ג’ל על ידי שיפור ההשפעה המוביל של מולקולות RNA קטנות על ידי הקלת הצניפה תצפית ג’ל בחירות. תכונת מפתח נוספת של פרוטוקול זה, אשר בהמשך מדגיש צדדיות שלה בעת עבודה עם כמויות קטנות של FFPE RNA, נמצא כי תגובת ה-PCR פיילוט משמש לזיהוי מחזור הגברה אופטימלית של ספריית cDNA. שלב זה גם מספק תובנות לתוך הדינמיקה של הגברה ספריית לעומת פריימר דיימר הגברה, אשר חיוני בעת הכנת התגובה PCR בקנה מידה גדול וטיהור הספרייה RNA קטנים על agarose ג’ל. הנתונים שיתווספו פרוטוקול זה להפגין הפארמצבטית של גישה זו בין קפוא ושה FFPE דגימות, וגם המדגישות את תחולתן ל RNA FFPE בוגרים דגימות של דגימות בארכיון עד 35 שנים.

פרוטוקול זה שונה מן הגירסה המקורית שלה, אז זה ממוטב עבור הכנה של ספריות RNA קטנים זני התחתון האיכות והכמות של RNA FFPE כימית שונה ולא פרוץ. היבט אחד של הליך זה שונה כדי בהצלחה מאתרים ומפסיקים ומגבירים RNAs קטן מ FFPE דגימות מתייחס לסכום של כיל קוקטייל עלה במהלך ראשוני 3′ לבר-קוד מתאם מצדו, אשר קלט נתקף 0.026 nM כדי למנוע תחרות עם מצדו של abundancy נמוך RNAs קטן מציגים דוגמאות FFPE RNA. שינוי חשוב נוסף להליך המקורי היה הסרת כל radioactively שכותרתו גודל-סמני בשימוש במהלך מבחר RNAs קטנים מחוברים על ג’לים דף. השימוש הגודל-סמנים radiolabeled אלה מוגבלת לא רק את הישימות של גישה זו מעבדות מוסמך עבור השימוש איזוטופים רדיו אבל גם מנעו התבוננות המוצרים RNA ג’לים. במקום זאת, בפרוטוקול זה אופטימיזציה, סמני גודל לרוץ בבארות הסמוכים לספרייה, על הג’ל דף, דמיינו ישירות הפלורסנט לכוון כריתה של RNAs קטנים מחוברים. חשוב, הפלורסנט בקלילות ריססו על הג’ל כדי למנוע דיפוזיה של מוצרי ה-RNA, אז דמיינו על קופסת אור כחול. לאחר מכן, כאמצעי של אמצעי זהירות, כדי לשפר פעפוע של RNAs קטנים מחוברים הכלול השברים ג’ל דף נכרת, שפופרות ג’ל-מפסק משמשים בצורה אחידה לרסק את הג’ל לפני הדגירה בפתרון NaCl בן לילה ב 4 ° C תחת עצבנות. כל הצעדים הללו הוערכו בקפידה כדי לעבוד עם כמויות קטנות יותר של חומר.

פרוטוקול זה הוחל על דגימות FFPE RNA ממקורות שונים (איברים ומוסדות) שאוחסנו עבור כמויות שונות של זמן. הבדיקות חשף את הפארמצבטית גבוהה של רצף RNAs קטן מ דגימות טריים וקפואים, בעת שימוש זה אופטימיזציה בהליך. ניתוחים נוספים באמצעות בוגרים דגימות FFPE בארכיון, מאוחסן עד 35 שנים, הפגינו יותר ישימות העצום של הפרוטוקול כדי דגימות קליניות. הדרישה המינימלית FFPE RNA קלט עבור דגימות FFPE הוצגה 100 ng. דרישה נמוכה זו מאפשרת הישימות של פרוטוקול זה מגוון של נגעים בגדלים שונים ובעלי זמינות, אך לא תאפשר הניתוח של תא בודד FFPE RNA. חשוב לציין, עם זאת, כי זה אופטימיזציה פרוטוקול שימש גם עם הכולל RNA מופק במחזור exosomes עם כניסות של פחות מ 1 ng מוצגים לספק לשחזור מאוד קטן RNA ביטוי פרופילים (נתונים לא מוצג). קלט נמוך זה מרמז כי RNAs קטן בדגימות FFPE, למרות נציג של הרקמה טריים המקורי, נמצאים הרבה הפרופורציות נמוכה יותר מאשר ב- RNA הכולל מלהסתובב exosomes.

העבודה האחרונה, שבו פרוטוקול ממוטבת זה היה מוחל על דגימות DCIS FFPE קלינית מסווגים, התברר כי הבדלים בביטוי miRNA המזוהה על-ידי הגדרות של ספריית cDNA יכול לאמת על ידי ה-PCR כמותי. עבודה זו הפגין את הכדאיות של שימוש DCIS נגעים רקמות בארכיון ממוסדות שונים ללימודים רטרוספקטיבית רחבת היקף [20]. מחקר זה מודגש גם את היציבות של הכנת ספריית cDNA כאשר מבוצעת במועדים שונים (במרווחים של כמה שבועות), מבלי להתפשר על הפארמצבטית ורגישות של וזמינותו.

בהתחשב כמות עצומה של דגימות קליניות מסווג FFPE בארכיון, פרוטוקול ממוטבת זה מספק כלי חזקים עבור הכנת cDNA ספריות בניתוח רטרוספקטיבי בקנה מידה גדול, זיהוי פוטנציאל של סמנים ביולוגיים miRNA הקשורים לפיתוח סרטן21.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Materials

1% Triton x-100InvitrogenHFH10
10mM ATPAmbionAM8110G
10X dNTPsAmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14M MercaptoethanolSigmaO3445I-100
20 nt ladderJena BioscienceM-232S
20mg/ml Bovine Serum AlbumineSigmaB8894-5ML
50X Titanium TaqClontech Laboratories639208
Ammonium PersulfateFisher Scientific7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combsGIBCOV16
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppndorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5mlFisher Scientific02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 mlIST Engineering Inc,3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combsBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Jersey-CoteLabScientific, Inc1188
KcL 2MAmbionAM9640G
MgCl2 1MAmbionAM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifugeUSA scientific2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacersCiore Life Science21070010
OligonucleotidesIDTDefined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combsThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Extraction kitQiagen28704
Restriction enzyme PmeINEBR0560S
RNase-free waterAmbionAM9932
Safe Imager 2.0Life TechnologiesG6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminatorThermofisherG6600
SeaKem LE agaroseLonza50002
Superscript III reverse transcription kitInvitrogen18080-044
SybrGoldLife TechnologiesS11494
T4 RNA Ligase 1NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227QNEB0351L
TEMEDFisher ScientificO3446I-100
Themocycler with heated lidApplied Biosystem4359659
Tris 1M pH 7.5Invitrogen15567027
Tris 1M pH8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and bufferNational DiagnosticsEC-833
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure–DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
  3. Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).
  4. Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
  5. Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
  6. Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
  7. Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
  8. Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).
  9. Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
  10. Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
  11. Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
  12. Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
  13. Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
  14. Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
  15. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  16. Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  17. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  18. Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
  19. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
  20. Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
  21. Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).
  22. Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
  23. Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).

Tags

MicroRNASequencingCDNA LibraryFormalin-fixed Paraffin-embeddedRNAProtocolLigationAdapterPrecipitationCentrifugation
Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image