ExCYT: ממשק משתמש גרפי עבור התייעלות ניתוח של נתוני Cytometry גבוהה-ממדי

Summary

ExCYT הוא MATLAB מבוסס גרפי וממשקי משתמש (GUI) המאפשר למשתמשים לנתח את הנתונים cytometry זרימה שלהם דרך כלל המועסקים בשיטות אנליטיות עבור נתונים גבוהה-ממדי כולל הפחתת dimensionality באמצעות t-סנה, מגוון אוטומטיות וידניות קיבוץ באשכולות שיטות heatmaps, זרימה גבוהה-ממדי הרומן חלקות.

Abstract

עם כניסתו של זרימה cytometers מסוגל מדידת מספר גדל והולך של פרמטרים, המדענים ממשיכים לפתח לוחות גדולים יותר לחקור phenotypically מאפייני דוגמאות הסלולר שלהם. עם זאת, הפיתוחים הטכנולוגיים האלה תשואה גבוהה-ממדי בערכות נתונים הפכו להיות יותר ויותר קשה לנתח באופן אובייקטיבי בתוך תוכניות המגביל מבוססות ידנית מסורתית. כדאי לנתח, להציג נתונים, מדענים משתפים פעולה עם bioinformaticians עם מומחיות בניתוח נתונים גבוהה-ממדי כדי לנתח את הנתונים שלהם cytometry זרימה. בעוד ששיטות אלה הוכחו להיות חשוב מאוד ללמוד cytometry זרימה, הם טרם ניתן לשלב בחבילה פשוטה, קלה לשימוש עבור המדענים חסרי התמחות חישובית או תכנות. כדי לטפל צורך זה, פיתחנו ExCYT, MATLAB מבוסס גרפי וממשקי משתמש (GUI) המייעל את הניתוח של נתוני cytometry זרימה גבוהה-ממדי על-ידי יישום שיטות אנליטיות הנפוצות עבור נתונים גבוהה-ממדי כולל הפחתת dimensionality על ידי t-סנה, מגוון רחב של שיטות קיבוץ באשכולות אוטומטיות וידניות, heatmaps זרימה גבוהה-ממדי הרומן חלקות. בנוסף, ExCYT מספק אפשרויות המגביל המסורתי של אוכלוסיות נבחרות עניין נוסף t-סנה, קיבוץ באשכולות ניתוח, כמו גם את היכולת להחיל גייטס ישירות על t-סנה חלקות. התוכנה מספקת את היתרון הנוסף של עבודה עם גם פיצוי כספי או הקבצים FCS uncompensated. בכל מקרה שבו נדרש פיצוי שלאחר הרכישה, המשתמש יכול לבחור לספק התוכנית ספרייה של כתמי יחיד דוגמה וללא רבב. התוכנית מזהה אירועים חיוביים של כל הערוצים ומשתמש בחר נתונים לחישוב המטריצה פיצוי באופן יותר אובייקטיבי. לסיכום, ExCYT מספק קו צינור ניתוח מקיף לקחת נתונים cytometry זרימה בצורה של FCS הקבצים ולאפשר כל אדם, ללא קשר אימונים חישובית, להשתמש הגישות אלגוריתמית האחרון בהבנת הנתונים שלהם.

Introduction

ההתקדמות cytometry זרימה, כמו גם כניסתו של cytometry המוני אפשרה רופאים ומדענים לזהות במהירות ולאפיין phenotypically דגימות ביולוגית, קלינית מעניין עם רמות חדשות של רזולוציה, יצירת גדול ערכות גבוהה-ממדי נתונים המהווים מידע עשיר^1,2,3. בעוד בשיטות המקובלות לניתוח נתונים cytometry זרימה כגון gating ידני כבר יותר ישירה עבור ניסויים בהם קיימות בכמה חוטים או הסמנים יש אוכלוסיות ניכרת באופן חזותי, גישה זו יכול להיכשל ליצור תוצאות לשחזור בעת ניתוח ערכות נתונים-ממדים או אלה עם סמנים מכתים על הספקטרום. לדוגמה, במחקר רב מוסדיים, היכן התוך תאית מכתים (ICS) מבחני היו המבוצעת כדי להעריך את הפארמצבטית של quantitating תגובות תא T אנטיגן ספציפי, למרות דיוק inter-laboratory טוב, ניתוח, במיוחד gating, הציג מקור לא מבוטל של השתנות⁴. יתר על כן, תהליך ידני gating אוכלוסייה של אינטרסים, מלבד היותו סובייקטיבית הוא מאוד זמן רב, עבודה אינטנסיבית. עם זאת, הבעיה של ניתוח ערכות נתונים גבוהה-מימדי בצורה איתנה, יעיל ומתוזמן אינה אחד חדש מחקר למדעים. מחקרים ביטוי גנים לעיתים קרובות ליצור ערכות נתונים מאוד גבוהים-ממדי (לעיתים קרובות גודל מאות גנים) איפה הטפסים ידנית של ניתוח יהיה פשוט באמצעות חישוב. על מנת להתמודד עם הניתוח של ערכות נתונים אלה, יש כבר הרבה עבודה בפיתוח bioinformatic כלים לניתוח נתונים של ביטוי גנים⁵. גישות אלה אלגוריתמית רק לאחרונה שאומצו בניתוח נתונים cytometry מספר הפרמטרים גדל, הוכיחו להיות בעל ערך לצורך הניתוח של אלה^6,גבוהה ערכות נתונים תלת-ממדי⁷.

למרות הדור של יישום מגוון רחב של חבילות תוכנה מאפשרות להחיל גישות אלה bioinformatic גבוהה-ממדי על הנתונים שלהם cytometry זרימה והאלגוריתמים, שיטות אנליטיות אלה עדיין נשארים בעיקר שאינם בשימוש. בעוד שיכול להיות מגוון גורמים מוגבל של אימוץ נרחב של גישות אלה נתונים cytometry⁸, מכשול גדול אנחנו חושדים להשתמש גישות אלה על ידי מדענים, חוסר הידע חישובית. למעשה, רבים של אלה חבילות תוכנה (קרי, flowCore, flowMeans ו OpenCyto) נכתבות ניתן ליישם תכנות כגון R עדיין דורשים ידע בתכנות מהותית. חבילות תוכנה כגון FlowJo מצאו בקרב מדענים בשל הפשטות של השימוש, הטבע 'הכנס-הפעל', כמו גם תאימות עם מערכת ההפעלה במחשב. על מנת לספק מגוון רחב של שיטות אנליטיות מקובל ובעל ערך על תיכנות לא מוכר המדען, פיתחנו ExCYT, ממשק משתמש גרפי (GUI) שניתן בקלות להתקין ב- PC/Mac שמושכת הרבה בטכניקות האחרונות הפחתת dimensionality להמחשת אינטואיטיבי, מגוון שיטות קיבוץ באשכולות המצוטטים בספרות, יחד עם תכונות הרומן לחקור את הפלט של אלה כולל קיבוץ באשכולות אלגוריתמים עם heatmaps, רומן מתווה בקופסה זרימה גבוהה-ממדי.

ExCYT הוא ממשק משתמש גרפי שנבנה ב- MATLAB, ולכן ניתן גם להפעיל בתוך MATLAB ישירות או מתקין מסופק זה יכול לשמש כדי להתקין את התוכנה על כל PC/mac. התוכנה זמינה במלון https://github.com/sidhomj/ExCYT. אנו מציגים פרוטוקול מפורט כיצד לייבא נתונים, לעבד אותו מראש, לערוך רדוקציה dimensionality t-סנה, נתוני אשכול, מיון & לסנן אשכולות בהתבסס על העדפות משתמשים, הצגת מידע על האשכולות עניין באמצעות heatmaps ו הרומן זרימה גבוהה-ממדי/תיבת חלקות (איור 1). צירים ב- t-סנה חלקות שרירותית ובלתי ביחידות שרירותי, וככזה כפי שמוצג לא תמיד הדמויות לפשטות של המשתמש בממשק. צביעה של נקודות נתונים ב- "Heatmaps t-סנה" היא כחול צהוב המבוססת על האות של סמן המצוין. בקיבוץ באשכולות פתרונות, הצבע של נקודת הנתונים מבוסס שרירותי על מספר האשכולות. כל החלקים של זרימת העבודה יכולה לצאת לפועל שבלוח יחיד GUI (איור 2 & טבלה 1). לבסוף, אנו נדגים את השימוש ExCYT על נתונים שפורסמו בעבר לחקור את הנוף המערכת החיסונית של קרצינומה של תאי הכליה בספרות, נותחו גם בשיטות דומות. ניתן למצוא את ערכת הנתונים לדוגמה שהשתמשנו כדי ליצור את הדמויות בכתב היד יחד עם פרוטוקול למטה ב https://premium.cytobank.org/cytobank/projects/875, בעת רישום חשבון.

Protocol

1. איסוף והכנת Cytometry נתונים

1. במקום כל כתמי יחיד בתוך תיקיה על-ידי עצמם ותווית בשם ערוץ (על ידי fluorophore, לא סמן).

2. הנתונים היבוא & עיבוד קדם

1. כדי להשהות או לשמור לאורך צינור ניתוח זה, השתמש בלחצן שמירת סביבת עבודה בפינה השמאלית התחתונה של התוכנית כדי להציל את סביבת העבודה כמו '. מחצלת ' קובץ אותו ניתן לטעון מאוחר יותר באמצעות לחצן עומס סביבת עבודה . אין להפעיל יותר ממופע אחד של התוכנית במועד. לכן, בעת טעינת סביבת עבודה חדשה של, הקפד לבדוק אין מופע אחר של ExCYT פועל.
2. כדי להתחיל ניתוח צינור, ראשית בחר סוג cytometry (Flow Cytometry או מסה Cytometry – CYTOF), תחת המספר בחר קובץ בחירת הפרמטרים של אירועים כדי לדגום הקובץ (לשימוש זו דוגמה 2,000). לאחר הנתונים יובאו בהצלחה, תיבת דו-שיח תופיע כעת שתודיע למשתמש כי הנתונים יובא בהצלחה.
3. לחצו על כפתור Auto-פיצוי לבצע צעד אוטומטי אופציונלי-פיצוי, כפי שנעשה על ידי באגוול & אדמס⁹. בחר את הספריה שמכילה את כתמי יחיד. בחר את הדגימה מוכתם בתוך הדיאלוג ממשק המשתמש.
   1. במקום שער קדימה/צד-פיזור על כל הדגימות בספריה זו שישמש כדי לבחור אירועים לחישוב המטריצה פיצוי. מומלץ להשתמש המדגם מוכתם למטרה זו. בשלב זה, אלגוריתם יושם לקבוע ספי עקבי^{במאיון ה 99 המדגם מוכתם להגדיר אירועים חיוביים בכל אחד הכתמים יחיד לחישוב המטריצה פיצוי} . כאשר הוא סיים, תיבת דו-שיח ליידע את המשתמש כי בוצעה הפיצוי.
4. בשלב הבא, לחץ על האוכלוסייה שער ובחר באוכלוסיות של תאים מעניינים, כמו האמנה לזרום cytometry ניתוחים. כאשר אוכלוסיית תאים נבחר, הזן מספר האחוז של ניתוח אירועים במורד הזרם (באירועים זה 10,000).
5. בשלב הבא, בחר את הערוצים מספר שישמש עבור ניתוח בתיבת הרשימה בבקצה השמאלי של תיבת מראש עיבוד (השתמש הערוצים ספציפי בדוגמה).

3. t-סנה ניתוח

1. לחץ על לחצן t-סנה כדי לקבל את התוכנית להתחיל התחלה כדי לחשב את ערכת הנתונים dimensionality מופחת להמחשת בחלון מתחת ללחצן t-סנה. כדי לשמור תמונה של t-סנה, הקש על להציל את התמונה TSNE. על מכונה עם 8 CPU @ 3.4 GHz ו- GM 8 RAM שלב זה צריך לקחת כ 2 דקות לאירועים 10,000, 10 דקות לאירועים 50,000 ו-20 דקות לאירועים 100,000.
2. כדי ליצור heatmap אל-סנה ', כפי שניתן לראות מספר CYTOF פרסומים^10,11, בחר באפשרות מתוך התפריט הנפתח סמן ספציפיים t-סנה (השתמש את סמני ספציפי CD64 או CD3 כמוצג בדוגמה). דמות יופיע מציג ייצוג heatmap של העלילה t-סנה שניתן לשמור לדור איור.
3. בחר תחומי עניין ב- t-סנה החלקות על-ידי המשתמש עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים באמצעות לחצן שער t-סנה .

4. אשכול ניתוח

1. כדי להתחיל קיבוץ באשכולות ניתוח, בחר אפשרות מתוך הרשימה שיטת אשכולות (בדוגמה זו לנו DBSCAN עם מקדם מרחק של 5 בדיאלוג התיבה בצד ימין של תיבת הרשימה). לחץ על לחצן אשכול .
2. השתמש באחת האפשרויות הבאות עבור אוטומטית אלגוריתמים קיבוץ באשכולות המופיעים בחלונית ' 'פרמטרים קיבוץ באשכולות אוטומטיות' ':
   1. KMEANS קשה (על t-סנה): להחיל k-אמצעי קיבוץ באשכולות על הנתונים מופחת 2-ממדי t-סנה ודורש מספר אשכולות שיסופק אלגוריתם¹².
   2. KMEANS קשה (על נתונים HD): להחיל k-אמצעי קיבוץ באשכולות בנתונים המקוריים גבוהה-ממדי שניתן האלגוריתם t-סנה. שוב, המספר של אשכולות צריך להינתן בעזרת אלגוריתם.
   3. DBSCAN: להחיל את השיטה קיבוץ באשכולות של קיבוץ באשכולות, נקראת צפיפות מבוסס שירות האשכולות המרחבי של יישומים עם רעש¹³ אשכולות הנתונים מופחת 2-ממדי t-סנה ודורש גורם שאינו-ממדי המרחק קובע את גודל כללי אשכולות. סוג זה של אלגוריתם קיבוץ באשכולות הוא גם מתאים לאשכול ההפחתה t-סנה כפי שהוא מסוגל לאשכול spheroidal אשכול כי קיימים לעתים קרובות בייצוג t מופחתת-סנה. בנוסף, בשל העובדה כי היא פועלת על הנתונים 2-ממדי, זה לאחד האלגוריתמים האשכולות מהר יותר.
   4. קיבוץ באשכולות היררכי: השיטה המקובלת קיבוץ באשכולות הירארכי חלות על הנתונים גבוהה-ממדי שבו המטריצה כולה מרחק אוקלידי מחושבת בין כל האירועים לפני מתן האלגוריתם פקטור המרחק קובע את גודל האשכול.
   5. רשת גרף- בסיס: להחיל פעולת שירות האשכולות כבר הציג לאחרונה לתוך ניתוח נתונים cytometry זרימה כאשר יש subpopulations נדיר המשתמש שרוצה לזהות^11,14. שיטה זו מתבססת על הראשון יוצר גרף הקובע את החיבורים בין כל האירועים ב הנתונים. שלב זה כולל מתן פרמטר ראשונית ליצירת התרשים, שהוא מספר השכנים k-הקרוב. פרמטר זה שולט בדרך כלל בגודל של האשכולות. בשלב זה, תיבת דו-שיח אחרת יצוץ שמבקשת מהמשתמש להעסיק אחד של 5 אשכולות אלגוריתמים שהוחל על הגרף. אלה כוללות אפשרויות 3 כדי למקסם את המודולריות של הגרף, השיטה דנון ספקטרלי קיבוץ באשכולות אלגוריתם^{14,15,16,17,18}. אם אחד לא רוצה פתרון בדרך כלל מהר יותר קיבוץ באשכולות, אנו ממליצים קיבוץ באשכולות ספקטרלי או את מהר חמדן מודולריות למיקסום. בעוד השיטות למיקסום מודולריות יחד עם שיטת דנון לקבוע את מספר אופטימלי של אשכולות, קיבוץ באשכולות ספקטרלי דורש מספר אשכולות תינתן לתוכנית.
   6. עצמית מאורגן מפה: מעסיקים של רשת עצבית מלאכותית כדי אשכול הנתונים גבוהה-ממדי.
   7. GMM – למיקסום ציפייה: ליצור מודל תערובת גאוסיאנית בטכניקה ציפייה מקסום (EM) כדי אשכול הנתונים גבוהה-ממדי. ¹⁹ זה סוג של שיטת האשכולות גם דורש מהמשתמש קלט מספר אשכולות.
   8. היסק בייסיאניות הווריאציה עבור GMM: ליצור מודל תערובת לפי עקומת גאוס אבל בניגוד EM, זה אפשרות לקבוע אוטומטית את מספר ה ק' רכיבי התערובת²⁰ בזמן התוכנית לדרוש מספר אשכולות תינתן (גדול יותר צפוי מספר אשכולות), האלגוריתם יקבע המספר האופטימלי בכוחות עצמו.
3. ללמוד תחום מסוים של העלילה t-סנה, לחץ על לחצן בחר אשכול באופן ידני כדי לצייר קבוצת אשכולות על-ידי המשתמש. ראוי לציין, אשכולות יכול לשתף חברים (קרי, כל אירוע יכול להשתייך רק לאשכול 1).

5. אשכול סינון

1. ולתקשר של אשכולות מזוהה גם באופן ידני או באמצעות אחת השיטות אוטומטי המתואר לעיל ניתן לסנן באמצעות כדלקמן.
   1. כדי למיין אשכולות (בחלונית ' מסנן אשכול ) על ידי כל אחד הסמנים שנמדד בניסוי, בחרו אפשרות מהתפריט הנפתח מיון . כדי לקבוע אם הצו הוא בסדר עולה או יורד, לחץ על הלחצן סדר עולה/יורד בצד ימין של התפריט הנפתח מיון . זה לעדכן את רשימת אשכולות בתיבת הרשימה 'אשכולות (סינון)', סדר יורד של אשכול החציוני הבעת את הטוש אותם. האחוז מסומן בתיבת הרשימה 'אשכולות (סינון)' מציין את אחוז האוכלוסייה המייצג את האשכול הזה.
   2. כדי להגדיר ערך סף המינימום עבור מקבץ מסוים על פני ערוץ מסוים, בחרו אפשרות מהתפריט הנפתח הסף (בדוגמה זו לנו סמן CD65 ואת ערכת סף-0.75). הקלד ערך בתיבה מספריים מתחת לגרף או השתמש במחוון-כדי לקבוע סף. ברגע סף מוגדר, הקש להוסיף מעל הסף או להוסיף מתחת לסף כדי לציין את הכיוון של הסף. לאחר שהמכסה הוגדר, הוא יוצג בתיבה ספי שליד החלונית ' 'אשכול מסנן' ' איפה את הסמן את ערך הסף, הכיוון יפורטו כך שהמשתמש מודע איזה ספי כעת מוחלים. לבסוף העלילה t-סנה יעדכן על ידי טשטוש החוצה אשכולות שאינם עונים על הדרישות של הסינון, תיבת הרשימה 'אשכולות (סינון)' יעדכן להראות אשכולות העונים על הדרישות סינון.
   3. כדי להגדיר סף המינימום עבור התדירות של אשכול, הזן של ניתוק מספריים האשכול תדירות סף (%) התיבה בלוח של מסנן אשכול (בשדה זו דוגמה לשימוש 1%).

6. אשכול ויזואליזציה ואנליזה

1. כדי לבחור אשכולות על ניתוח נוסף ופריטים חזותיים, בחר אשכולות אשכולות (סינון) הרשימה ולחץ על לחצן א' בחר כדי להעביר אותם אל הרשימה לנתח את האשכול .
2. כדי ליצור heatmaps של אשכולות, בחר האשכולות עניין בתיבת הרשימה אשכול לנתח ולחץ על לחצן HeatMap של אשכולות . בעת לחיצה על לחצן זה, דמות יופיע המכיל מפת חום יחד עם dendrograms על הצירים אשכול ופרמטר. Dendrogram בציר האנכי יקבץ אשכולות על-ידי אלו קשורים קשר הדוק בזמן dendrogram האופקי ציר יקבץ סמני הקשורות משותפת. כדי לשמור heatmap, הקש קובץ | ייצוא ההתקנה | ייצוא-
3. כדי ליצור 'גבוהה ממדי התיבה מגרש' או 'גבוהה ממדי לזרום מגרש', בחר האשכולות עניין בתיבת הרשימה אשכול לנתח ולחץ על לחצן גבוהה מגרש תיבת תלת-ממדי או לחצן גבוהה ממדי לזרום עלילה . חלקות אלה ניתן להשתמש כדי להעריך באופן חזותי את ההפצה של נתן ערוצים של אשכולות שונים על פני כל הממדים.
4. כדי להציג אשכולות ב זרימה 2D מסורתיות חלקות, בחר את השינוי (ליניארי, log10, arcsinh), ערוץ מגרש זרימה קונבנציונאלי החלונית, הקש עלילה זרימה קונבנציונאלי.

Results

על מנת לבדוק את השימושיות של ExCYT, ניתחנו את ערכת נתונים אצר בהוצאת שוורייה. ואח שכותרתו "המערכת החיסונית אטלס של ברור כליות קרצינומה של תאים' איפה הקבוצה נערך ניתוח CyTOF עם לוח המערכת החיסונית מקיף על גידול דגימות שנלקחו 73 חולים¹¹. שני לוחות נפרדים, לוח מיאלואידית, הלימפה, שימשו phenotypically לאפיין את microenvironment הגידול. מטרת המחקר שלנו היתה לסכם את התוצאות של t-סנה שלהם אשכול ניתוח, מראה כי ExCYT יכול לשמש כדי להגיע לאותן המסקנות, כמו גם להראות...

Discussion

כאן אנו מציגים ExCYT, ממשק משתמש גרפי הרומן פועל אלגוריתמים מבוססי-MATLAB כדי לייעל את ניתוח של נתוני cytometry גבוהה-ממדי, המאפשר לאנשים ללא רקע לתיכנות ליישם את המילה האחרונה נתונים גבוהה-ממדי ניתוח אלגוריתמים. הזמינות של תוכנה זו על הקהילה המדעית רחבה יותר יאפשר למדענים לחקור את הנתונים שלהם cytometry זרימה זרימת עבודה אינטואיטיבי וישיר. דרך ביצוע הפחתה dimensionality t-סנה, החלת שיטת האשכולות, להיות מסוגל מיון/סינון דרך אלה אשכולות במהירות, ולעשות heatmaps גמיש, ניתן להתאמה אישית, זרימה גבוהה-ממדי/תיבת חלקות, מדענים ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
בנייה מותאם אישית	SuperMicro שולחני		המשמש להפעלת ניתוח
MATLAB	Mathworks	N/A	תוכנה המשמשת לפיתוח ExCYT