אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

Akira Muto; Koichi Kawakami

doi:10.3791/57485

מאמר שיטה

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

DOI:

10.3791/57485

⸱

2 ביוני 2018

Akira Muto¹ , Koichi Kawakami¹

¹Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, Department of Genetics, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ablate של subpopulation שכותרתו גנטית של נוירונים על ידי לייזר שני הפוטונים מן דג זברה הזחלים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לזהות את התפקיד של subpopulation של נוירונים בהתנהגות, זה חיוני כדי לבדוק את ההשלכות של חסימת פעילותו בבעלי חיים. אבלציה לייזר של נוירונים היא שיטה יעילה למטרה זו כאשר נוירונים מסומנות באופן סלקטיבי עם הגששים פלורסנט. במחקר הנוכחי, מתוארים פרוטוקולי לייזר ablating של subpopulation של הנוירונים באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים ובדיקות של השלכותיה פונקציונלי והתנהגותיים. במחקר זה, התנהגות לכידת הטרף דג זברה הזחלים משמש כמודל המחקר. המעגל pretecto-היפותלמי ידוע מונחת ביסוד זה טרף מונחה באופן חזותי לתפוס התנהגות. דג זברה pretectum היו ablated לייזר, נבחנה פעילות. עצבית באונה נחות של ההיפותלמוס (ILH; היעד של התחזית pretectal). התנהגות לכידת הטרף לאחר אבלציה pretectal נבחנה גם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבין איך התנהגות נובעת פעילות. עצבית במוח, יש צורך לזהות את המעגלים העצביים המעורבים הדור של התנהגות זו. בשלב הזחל, מספק דג זברה במודל חיה אידיאלית עבור לומדים של תפקוד המוח הקשורים להתנהגות כי המוח שלהם קטן, שקופים מאפשרים לחקור פעילות. עצבית ברזולוציה הסלולר באזור רחב של המוח תוך כדי התבוננות של התנהגות¹. הדמיה של פעילות. עצבית בנוירונים מסוים הפך אפשרי דרך ההמצאה של אינדיקטורים מקודדים גנטית סידן (Ca) (GECIs) כגון GCaMP². דג זברה מהונדס GCaMP הוכיחו להיות שימושי עבור שיוך המעגל עצבית תפקודית התנהגות על-ידי עריכת Ca הדמיה ב מתנהג בעלי חיים³.

בעוד דימות Ca יכולים ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. אבלציה של Subpopulation של נוירונים באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

הערה: אם משתמשים מתכנן להופיע Ca אבלציה הבאים הדמיה, להשתמש UAShspzGCaMP6s קו²¹. אם משתמשים מתכננים ביצוע הקלטה התנהגותי אחרי אבלציה, השתמש הקו UAS:EGFP, כפי אבלציה של תאים EGFP-חיובי קל יותר לביצוע מאשר התאים לבטא GCaMP6s.

התחל על-ידי הגדרת את ההזדווגות של קו Gal4 שמתייג נוירונים ספציפיים להילמד, UAS:EGFP או UAShspzGCaMP6s. הקפד להשתמש ברקע נאקרה עבור שני ההורים כך ניתן להשיג homozygotes נאקרה .
הערה: Homozygotes של נאקרה מכילים אין melanophores על פני הגוף (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירונים ספציפיים גנטית עם תווית עם EGFP או GCaMP6s, אשר הביטוי גורשו בקווים Gal4 GSAIzGFFM119B קו Gal4 שימשה תווית גרעין באזור pretectal (הזרם שטחית pretectal גרעין), subpopulation של הנורה הריח נוירונים. קו Gal4 אחר, hspGFFDMC76A, שימש כדי לתייג את ILH. אנחנו לייזר-ablated הנוירונים pretectal דו צדדיים (איור 2א פאנל שמאלי), גם ablated נוירונים בהנורה הריח דו צדדיים כפקד (לוח נכוןאיור 2א ) בדג ז.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שני הפוטונים הלייזר יש רזולוציה מרחבית מעולה כדי במיוחד ablate נוירונים בודדים, נהדר זהירות יש לנקוט כדי למנוע נזק בלתי רצויה על רקמת המוח עקב חום. הצעד החשוב ביותר לניסוי אבלציה היא לקבוע את כמות לייזר הקרנה אופטימלית. הקרנה לא מספיקות נכשלת להרוג את הנוירונים. הקרנה מדי יהיה חום-פגיעה ברקמות שמסביב, אשר תגרום תופעות לוואי. הטווח האופטימלי של לייזר הקרנה (תחומי ROIs, מספר חזרות, ומהירות סריקה) נראה צר. מספר גורמים משפיעים על יעילות הטיפול.

ראשון, באמצעות הכתב שונה פלורסנט חלבונים, התנאי.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לדווח.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים אלה, במימון מענקים שהתקבלו מן MEXT, JSPS KAKENHI גרנט מספרים JP25290009, JP25650120, JP17K07494, JP17H05984.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
NuSieve GTG Agarose	Lonza	Cat.#50080	טמפרטורת התכה נמוכה אגרוז
6 ס"מ צלחת	פטרי FALCON	מוצר#:351007
מחט ניתוח	AS ONE Corporation	Cat. מס' 2-013-01	https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP	קארל זייס		מיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטוני
W Plan-Apochromat 63x/1.0	Carl Zeiss		63X עדשת אובייקטיבית
Imager.Z1	Carl Zeiss		מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי
ZEN	Carl Zeiss		תוכנת רכישת תמונה למיקרוסקופים קונפוקליים
אטם תא היברידיזציה Secure-Seal, 8 תאים, קוטר 9 מ"מ x 0.8 מ"מ עומק	בדיקות מולקולריות	# S-24732	משמש כתא הקלטה בתאי הדמיה של Ca
	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5	משמש כסכין כירורגית תא הקלטה התנהגותי
סכין		עיניים MANI MST15
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	דגם: C11440-22CU	מצלמת CMOS מדעית
HCImage	Hamamatsu Photonics		תוכנה לעיבוד תמונה
מודול הקלטת דיסק קשיח	Hamamatsu Photonics		מודול תוכנה המאפשר שמירת קבצי הסרט על כונן דיסק קשיח תוך זמן קצר
סטריאוסקופ	SZX7	Olympus
DF PL 0.5X	Olympus		עדשת אובייקט עבור SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 מגה פיקסל מונו USB3 Visio	FLIR Systems, Inc.	מס' מוצר GS3-U3-41C6NIR-C	CMOS מצלמת
XIMEA xiQ מצלמה	XIMEA	מס' מוצר	מצלמת CMOS
טבעת אור LED	CCS	דגם: LDR2-100SW2-LA	לבן LED

רשת ניילון 32µ m	מסך טוקיו	N-No.380T	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
רשת ניילון 13&מיקרו; m	Tokyo Screen	N-No. 508T-K	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
מתכת seive 150 מיקרון צמצם	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
מתכת seive 75 מיקרון	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS	Asahi Food & בריאות ושות' בע"מ		שמרי בירה יבשה
LabVIEW	National Instruments		סביבת פיתוח משולבת לתכנות
Mai-Tai HP	Spectra Physics		לייזר דו-פוטוני

קטלוג MQ042RG-CM

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Z Stack

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים