מאמר שיטה

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

DOI:

10.3791/57485

⸱

2 ביוני 2018

 , 
1Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, Department of Genetics, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ablate של subpopulation שכותרתו גנטית של נוירונים על ידי לייזר שני הפוטונים מן דג זברה הזחלים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לזהות את התפקיד של subpopulation של נוירונים בהתנהגות, זה חיוני כדי לבדוק את ההשלכות של חסימת פעילותו בבעלי חיים. אבלציה לייזר של נוירונים היא שיטה יעילה למטרה זו כאשר נוירונים מסומנות באופן סלקטיבי עם הגששים פלורסנט. במחקר הנוכחי, מתוארים פרוטוקולי לייזר ablating של subpopulation של הנוירונים באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים ובדיקות של השלכותיה פונקציונלי והתנהגותיים. במחקר זה, התנהגות לכידת הטרף דג זברה הזחלים משמש כמודל המחקר. המעגל pretecto-היפותלמי ידוע מונחת ביסוד זה טרף מונחה באופן חזותי לתפוס התנהגות. דג זברה pretectum היו ablated לייזר, נבחנה פעילות. עצבית באונה נחות של ההיפותלמוס (ILH; היעד של התחזית pretectal). התנהגות לכידת הטרף לאחר אבלציה pretectal נבחנה גם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבין איך התנהגות נובעת פעילות. עצבית במוח, יש צורך לזהות את המעגלים העצביים המעורבים הדור של התנהגות זו. בשלב הזחל, מספק דג זברה במודל חיה אידיאלית עבור לומדים של תפקוד המוח הקשורים להתנהגות כי המוח שלהם קטן, שקופים מאפשרים לחקור פעילות. עצבית ברזולוציה הסלולר באזור רחב של המוח תוך כדי התבוננות של התנהגות1. הדמיה של פעילות. עצבית בנוירונים מסוים הפך אפשרי דרך ההמצאה של אינדיקטורים מקודדים גנטית סידן (Ca) (GECIs) כגון GCaMP2. דג זברה מהונדס GCaMP הוכיחו להיות שימושי עבור שיוך המעגל עצבית תפקודית התנהגות על-ידי עריכת Ca הדמיה ב מתנהג בעלי חיים3.

בעוד דימות Ca יכולים להדגים מתאמים בין פעילות. עצבית והתנהגות, להראות סיבתיות, דיכוי פעילות. עצבית ובדיקה שלו consequence(s) על התנהגות הם צעדים חשובים. ישנן מספר דרכים להשיג זאת: שימוש מוטציה גנטית שמשנה את המעגלים העצביים ספציפי4, ביטוי של רעלנים עצביים ב-5,נוירונים ספציפיים6, שימוש בכלים optogenetic כגון halorhodopsin7, ו לייזר אבלציה של נוירונים יישוב8,9. אבלציה לייזר מתאים במיוחד עבור ביטול פעילות במספר קטן יחסית של נוירונים ספציפיים. חיסול בלתי הפיך של פעילות. עצבית על ידי הריגת נוירונים מקלה על הערכת השלכות התנהגותיות.

התנהגות מעניין אחד זה יכול להיות שנצפו בשלב הזחל בתוך דג זברה היא ללכוד את הטרף (איור 1א'). התנהגות זו מונחה באופן חזותי, מכוון מטרה מספק מערכת ניסויית רייטינג לצורך המחקר של זיהוי של התפיסה החזותית, טרנספורמציה visuomotor11,12,13, חדות הראייה10 אובייקטים14,15,16,17,18, קבלת החלטות19. איך טרף מזוהה על ידי טורפים, כיצד זיהוי הטרף מוביל טרף לתפוס התנהגות כבר בשאלה מרכזית neuroethology20. בנייר זה, אנו מתמקדים התפקיד של המעגל pretecto-היפותלמי הנוצרת על-ידי הקרנות של גרעין ב pretectum (גרעין pretectalis השטחי pars magnocellularis, בעתיד, פשוט ציינו גם pretectum) כדי ILH. לייזר-אבלציה של pretectum הוצגה להפחית את פעילות ללכוד טרף, לבטל את הפעילות העצבית ILH המשויך תפיסה חזותית טרף21. כאן, פרוטוקולים לביצוע לייזר השפעתו באמצעות Ca2 + הדמיה והקלטה התנהגותית דג זברה הזחלים מתוארים אבלציה ובדיקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. אבלציה של Subpopulation של נוירונים באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

הערה: אם משתמשים מתכנן להופיע Ca אבלציה הבאים הדמיה, להשתמש UAShspzGCaMP6s קו21. אם משתמשים מתכננים ביצוע הקלטה התנהגותי אחרי אבלציה, השתמש הקו UAS:EGFP, כפי אבלציה של תאים EGFP-חיובי קל יותר לביצוע מאשר התאים לבטא GCaMP6s.

  1. התחל על-ידי הגדרת את ההזדווגות של קו Gal4 שמתייג נוירונים ספציפיים להילמד, UAS:EGFP או UAShspzGCaMP6s. הקפד להשתמש ברקע נאקרה עבור שני ההורים כך ניתן להשיג homozygotes נאקרה .
    הערה: Homozygotes של נאקרה מכילים אין melanophores על פני הגוף (איור 1B). בהווה מחקר, gSAIzGFFM119B קו של Gal4 (אשר מתייג את pretectum) ואני עוד Gal4 קו hspGFFDMC76A (אשר מתייג את ILH) נמצאים בשימוש21.
  2. ביום הבא של ההתקנה ההזדווגות, לאסוף את הביצים דג זברה, להעלות אותם הזחל ובשלב הנוירונים עניין יביעו כתבים פלורסנט.
  3. הר הזחל דג זברה ב 2% נקודת התכה נמוכה-agarose (איור 1B).
    1. בגין על-ידי הכנת 2% agarose מניות פתרון: לפזר 2 גרם של אבקת agarose נקודת ההיתוך הנמוכה במים מערכת 100 מ ל (כלומר, המים המשמשים כדי לשמור על דג זברה בוגרת במערכת המים במחזור)22 או E3 מים23, על ידי הבאת המים רותחים טעם מיקרוגל ולערבב נמרצות.
    2. מיקרוגל את המניה agarose נקודת ההיתוך הנמוכה של 2% עד הלילה. יוצקים מ 3.5-4.0 ל agarose על גבי המכסה של צלחת פטרי 6 ס מ. לחכות עד agarose מתקרר כך שזה חם למגע לפני שתמשיך.
    3. בשלב הבא, מקום זחל בודד (לא מרדימים בשלב זה) agarose. לשמור על התאמת את המיקום והכיוון של הזחל כך הוא זקוף, בעזרת מחט ויבתר (איור 1C), עד agarose עפור כדי להבטיח את מיקום מתאים של הזחל.
      הערה: הזחל ימשיכו לשחות בזמן עפור agarose.
    4. מרגע הזחל ממוקם, תאפשר 5 דקות עבור agarose שבמהלכו לחלוטין.
    5. 5 מ של tricaine פתרון (0.4%-1 x ריכוז בעבודה) שופכים agarose.
      הערה: כדי למנוע תנועות מאת הזחלים במהלך אבלציה לייזר, הזחלים חייב להישמר anesthetized לאורך כל ההליך אבלציה.
  4. Ablate הזחל באמצעות הפונקציה הלבנת במערכת מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר.
    1. מקום הזחל agarose-מוטבע תחת מיקרוסקופ סורק לייזר שני הפוטונים ולהתחיל למערכת מיקרוסקופ.
    2. להפעיל את התוכנה רכישת התמונה, ולחץ על הלחצן "על" בכרטיסיה "לייזר" כדי להפעיל את הלייזר (איור 1D). לחכות "המצב" של הלייזר כדי לשנות מן "עסוק" "ננעלת במצב".
    3. בכרטיסיה "ערוצים", קבע את אורך הגל של הלייזר-880 ננומטר (כוח מרבי: כ 2,300 mW) EGFP אבלציה, או 800 nm (כוח מרבי: כ 2,600 mW) עבור GCaMP אבלציה.
    4. בחר את העדשה המטרה X 20 על-ידי הזזת באופן ידני את האקדח העדשה. לחץ על הכרטיסיה 'אתר', לחץ על "GFP" כדי לשנות את המסלולים אופטי, ולהציג ישירות על ידי קרינה פלואורסצנטית לפי העין.
    5. לאתר דג זברה המוח זחל במרכזו של נוף; לאחר מכן לחץ על הכרטיסיה "רכישת" לחזור מיקרוסקופ שני הפוטונים.
    6. כרשומה של המצב 'לפני אבלציה', לקחת תמונה z-מחסנית עם העדשה המטרה X 20-סריקה-מהירות גבוהה (כדי למנוע נזק חום). מאוחר יותר להשוות את התמונות שצולמו לפני וגם אחרי אבלציה ניסויים (איור 2א). כדי להשיג z-מחסנית, לחץ על "Z-מחסנית" בחר באפשרות z-מחסנית ולהרחיב את הכרטיסיה הגדרת הגבול התחתון (לחץ "הגדר הראשון" לחצן") לאחר התמקדות בצד הגחוני של המוח זחל, וקבעו את הגבול העליון (לחץ על לחצן"הגדר האחרונה") אחרי התמקדות הגבי ביותר-השטח של המוח. לאחר מכן, לחץ על לחצן "להתחיל ניסוי" כדי להפעיל את רכישת התמונה z-מחסנית.
    7. בחר את העדשה המטרה X 63 על ידי הזזת באופן ידני את האקדח העדשה.
    8. לחץ על הכרטיסייה "אתר" לעבור מיקרוסקופ epi-פלורסנט, לאתר את התאים כדי להיות ablated במרכז התצוגה לפי העין, ואז לחץ על הכרטיסייה "רכישת" לחזור לייזר מיקרוסקופ סריקה.
  5. בכרטיסיה "מצב רכישה", להגדיר את "גודל המסגרת" 256 x 256. לחץ על "לחיות" ולבחון את הנוירונים עניין.
  6. החל מן הצד הגבי ביותר, למצוא מטוס מוקד שבו התאים כדי להיות ablated הם בפוקוס.
  7. סמן על שטח קטן, עגול בגודל כשליש של התא קוטר על כל נוירון כאזור עניין (ROI) באמצעות הפונקציה "אזורים".
  8. הגדר את מהירות סריקה s/256 13.93 x 256 פיקסלים (מיקרומטר 134.42 x 134.42 מיקרומטר), המתאים זמן להתעכב לייזר של 200 µs לפיקסל, או 200 µs/0.5 מיקרומטר. בנוסף, להגדיר 4 חזרות (' המעגל איטרציה: 4'). לחלופין, למטב את מספר איטראציות ומהירות סריקה כך אבלציה מספיק מושגת.
  9. לבצע את הפונקציה 'Bleaching' עבור אבלציה, בשילוב עם 'סדרת הזמן (2 מחזורים)' כדי תמונת מדגם (לפני ואחרי אבלציה) וגם 'אזורי' (כדי להגדיר את ROIs) או פונקציות שווי ערך בתוכנה המשמשת (איור 1D).
  10. על-ידי השוואת בתמונה הראשונה (לפני אבלציה), את התמונה השניה (אחרי אבלציה) בסדרה בזמן מחזור, להבטיח כי לאחר ניקוי הפנים, על ידי קרינה פלואורסצנטית ב ירידות לתאים ממוקד לזה שנצפה באותה רמת רקע (איור 2B).
  11. אם הוא עדיין נוכחים לאחר אבלציה, להגדיל את מספר האיטראציות.
  12. בשלב הבא, להזיז את מוקד המטוס מעט יותר עמוקים (כלומר, כלפי הצד הבטני), ובחר המטוס מוקד הבא שבו תאים ablated משולחים שאינם מופיעים.
  13. לבצע את הפונקציה הלבנת כמתואר לעיל (שלב 1.9). חזור על שלבים אלה עד יש כבר ablated כל התאים במבנה עצבית של ריבית.
  14. לאחר שעברו כל המטוסים מוקד המכסים את המבנים העצביים כדי להיות ablated, לבדוק את התאים עבור קרינה פלואורסצנטית ביטל. אם נמצאו תאים מסוימים עדיין להיות פלורסנט עקב מחסור אבלציה, לייזר-להאיר אותם שוב כמפורט לעיל.
  15. אם הזחל צריך להיות התאושש מן agarose לאחר הקרנה לייזר, אל תנסו את זה ממך בכוח agarose כי זה עלול לפגוע הזחל. במקום זאת, בזהירות לבצע חתכים קטנים בתוך agarose סביב הזחל בניצב פני השטח של הגוף שלו. ואז, חכו הזחל לשחות מחוץ agarose בכוחות עצמו כאשר ההרדמה מתנדף.
  16. להמשיך הזחל הבא עבור אבלציה או לבצע ניסויים שליטה באמצעות עוד אוכלוסיה של נוירונים שאינם מעורבים בהתנהגות תחת חקירה.
    הערה: כאן, כמו פקד, הריח הנורה נוירונים ב- UAS:EGFP; הזחלים gSAIzGFFM119B היו לייזר ablated שימוש באותו פרוטוקול המתואר לעיל (איור 2א, נכון).
  17. לאפשר מספר שעות או יום 1 עבור שחזור לפני שתמשיך Ca הדמיה (סעיף 2) או התנהגותיים הקלטה (סעיף 3). במהלך תקופה זו התאוששות, לבדוק את תקינות זחל (קרי, שחייה ספונטנית רגיל, אין לכאורה חום-נזק סביב אזור ablated, וכו) ולהסיר את הזחלים מראה סימנים של בריאות לקויה.

2. סידן הדמיה להקליט את הטרף-עורר פעילות. עצבית הזחלים Pretectum ablated דג זברה

  1. כדי להכין חדר הקלטה, לשים אטם קאמרית הכלאה מאובטחת-חותם על משטח זכוכית, עם דבק בצד הפונה על הזכוכית, ולהסיר את החותם העליון.
    הערה: זה יוצר חדר הקלטה קטן זה 9 מ מ קוטר ו- 0.8 מ מ עומק (איור 3א).
  2. לאחר מכן, מניחים רשת ניילון (בגודל של הפתיחה: מיקרומטר 32) על שפופרת 50-mL שיש בתחתית לחתוך. השתמש את הכובע כדי לחבר את רשת השינוי על המרקע (איור 3ב).
  3. הכינו את paramecia (שהיא הטרף כדי לשמש את הגירוי החזותי פגית).
    הערה: להכין את התרבות סנדלית (שלבים 2.3.1 ו 2.3.2) מראש.
    1. להשיג paramecia זרע תרבות ממקורות מסחריים או ביו אקדמי-משאב מרכזי24 מראש.
    2. תרבות סנדלית במשך מספר ימים במים המכילה אורז בלוק קש, גלולה של בירה-שמרים יבשים22 (איור 3ג').
    3. יוצקים את התרבות סנדלית באמצעות הנפות 2 במרוכז (אחד עם צוהר 150-מיקרומטר, ואחריו עם צוהר 75-מיקרומטר) כדי להסיר את הלכלוך מתרבות.
    4. לאסוף paramecia ב הזרימה דרך מהשלב הקודם על רשת ניילון (13-מיקרומטר צמצם).
    5. מחדש להשעות את paramecia על רשת ניילון לתוך גביע זכוכית באמצעות בקבוק לחיץ מערכת מים (איור 3ד').
  4. יש לשטוף את רשת השינוי (איור 3ב) במים מערכת 2 x (איור 3E).
    הערה: מטרת שלב זה היא להסיר את כל odorants אפשרי, tastants הכלול המדיום תרבות סנדלית , כמו מטרת המחקר הנוכחי היא לבחון באופן חזותי מונע פעילות. עצבית.
  5. מקום זחל דג זברה הפתרון tricaine עזים ומתנגד.
  6. הר זחל בודד ב- 2% agarose נקודת ההיתוך הנמוכה.
    1. ראשית, מיקרוגל agarose נקודת ההיתוך הנמוכה 2% ומוסיפים נפח 1/10 של 10 x tricaine מרוכז agarose.
    2. במקום טיפה אחת של agarose המכילות tricaine אל תא הקלטה (איור 3א).
    3. לאחר שאישרת agarose ולא חם מידי, למקם את הזחל anesthetized (מתוך שלב 2.5) agarose, מיד הסרת agarose עודף כל כך פני השטח של agarose נראית מעט קמורה.
    4. אוריינט במהירות הזחל למצב אנכי עם מחט ויבתר (איור 1C).
      הערה: הליכים אלה חייב להסתיים תוך מספר שניות לפני agarose עפור.
    5. מרגע הזחל ממוקם כראוי, תאפשר 5 דקות עבור agarose שבמהלכו לחלוטין. לאחר מכן, יוצקים טיפת 1 פתרון x tricaine על agarose.
  7. להסיר את agarose סביב ראשו של הזחל דג זברה ופנה מקום סנדלית לשחות בעזרת סכין כירורגית. כדי לעשות זאת, ראשית, להפוך כמה חתכים קטנים בתוך agarose (איור 3F). לאחר מכן, בזהירות להסיר את עודף agarose על ידי בעדינות לשפוך מערכת מים על החדר.
    הערה: בשלב זה, יהיה שטף את tricaine.
  8. בשלב הבא, לשים אחד סנדלית לחדר ההקלטה לשמש גירוי חזותי.
    הערה: כאשר סנדלית שוחה בקרבת ראש הזחל דג זברה, זה לעורר תגובה עצביים (איור 3G).
  9. המקום לחדר ההקלטה תחת מיקרוסקופ epi-זריחה מצויד with a מצלמה CMOS מדעי (איור 3H) ובחר 2.5 X עדשה אובייקטיבי (איור 3אני).
  10. לאסוף את ההקלטות בצילום מואץ של האותות זריחה GCaMP.
    1. הפעל את היישום רכישת התמונה למצלמה מאובזר.
    2. לחץ על "רצף חלונית" ובחר "דיסק קשיח שיא" בחלונית. במקטע הגדרות סריקה, להגדיר "מסגרת הרוזן" ל 900 או כל מסגרת הכולל מספר אחר הרצוי.
      הערה: אם הוא זמין, השתמש בתוכנת הקלטה בצילום מואץ עם מודול (כאן, "דיסק קשיח להקליט") המאפשר חיסכון יעיל של הנתונים על גבי כונן קשיח.
    3. בחלונית "ללכוד", הגדר את זמן החשיפה ב 30-ms (קרי, 33.3 fps), ו- Binning 2 x 2.
    4. המיקרוסקופ שליטה לוח מגע, בחר מסנן עבור ה-GFP, כמו GCaMP יש ספקטרום עירור/הפליטה דומה ל GFP.
    5. לחץ על "לחיות" על חלונית הלכידה כדי לאתר את הזחל לתצוגת המצלמה ואת המיקוד (איור 4א), לחץ על "להפסיק לחיות" ואז לחץ על לחצן "התחל". שמור את הסרט .cxd או כל פורמט אחר המכיל מידע אודות המצב רכישה.
  11. לאחר ההקלטות, לנתח אותות פלואורסצנט את GCaMP6s (Ca אותות) על ידי קבלת ערכי הפיקסלים הממוצע עבור ההחזר על מבנה המוח בסרט זמן לשגות שימוש בתוכנה חופשית פיג'י25.
    הערה: פיג'י הוא גרסה של ImageJ עם רבים שימושי plug-in של קדם-ההתקנה, באפשרותך לקרוא קבצי תמונה בפורמט .cxd עם הביו-התבניות יישום plug-in.
  12. אם הזחל להזיז מעט במהלך ההקלטה, לבצע רישום תמונה על-ידי הפעלת יישום plug-in TurboReg26 בפיג'י. בתפריט, בחר "תוספים" 'רישום', 'TurboReg'.
  13. שקול כיצד לנתח את הנתונים לפי מטרת המחקר. הרשימה הבאה היא דוגמה.
    1. לחשב את F/F0 (קרינה פלואורסצנטית בעוצמה כל הזמן, מחולק על ידי עוצמת קרינה פלואורסצנטית במנוחה או לפני כל ארעי Ca אירעה) כדלקמן:
    2. להגדיר ROIs את pretectum או את ILH באמצעות מנהל רועי: בתפריט, בחר "לנתח," "כלים", "רועי מנהל", ו "Add" לרשימת ROIs (איור 4א).
    3. לחישוב ערכי הפיקסלים הממוצע ROIs (כלומר., עוצמות קרינה פלואורסצנטית GCaMP6s) על-ידי בחירת בלוח רועי מנהל: "יותר," "מידה מרובה", "אישור." לשמור את התוצאות כקובץ גיליון אלקטרוני.
    4. כל האותות הם רועשים, ממוצע את האותות עבור 11 זמן-נקודות (ממוצע נע) באמצעות יישום יכול להתמודד עם הנתונים בגיליון האלקטרוני.
    5. F (עוצמות קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן) מתחלק F0 (עוצמת קרינה פלואורסצנטית ברמת הבסיס) כדי לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמל. כמו דוגמה של ויזואליזציה של נתונים, שינויים מנורמל עוצמת קרינה פלואורסצנטית GCaMP6s את pretectum, את ILH קטגוריות מקודדות לפי צבעים, ממופה על מסלולים סנדלית (איור 4B - D).

3. הערכה של השלכות התנהגותיות בעקבות אבלציה לייזר

  1. להתקין מערכת הקלטה התנהגות המורכב סטריאוסקופ מצויד עם מצלמת וידאו. להשתמש במצלמה עם התמונה המתאימה רכישת תוכנה, מסחרי או בהזמנה אישית (איור 5א).
  2. למטב את תנאי תאורה כך סנדלית ניתן להבחין באמצעות עיבוד תמונה. לדוגמה, השתמש אור LED טבעת לבנה עם כרווח (איור 5B).
    הערה: את המרחק, ואת הזווית, ה-LED משפיע על המראה של הדגימה (קרי, בהיר על רקע כהה או כהה ברקע בהיר), ועל כן, קריטי עבור עיבוד תמונה מוצלחת. לקבוע את גובה הכי טוב מרווח (איור 5C).
  3. מקום זחל דג זברה (התאוששה הניסוי אבלציה לייזר המתוארים בסעיף 1) בחדר ההקלטה התנהגותית (אשר צורפה זכוכית) עם המקורי העליון החותם הוסר (איור 5D).
  4. לאסוף 50 paramecia התרבות (שלב 2.3.5) באמצעות micropipette ומניחים אותם בתא ההקלטה.
  5. המקום מכסה מעל לחדר ההקלטה. לשים טיפה קטנה של מים על תגית כיסוי לפני הנחת על פני מים לחדר ההקלטה כדי למנוע החדרת אוויר בבית הבליעה.
    הערה: בשלב זה, לי מים עם paramecia גלישה מן החדר הקלטה. מספר paramecia בתא ההקלטה יהיה כ- 30-40.
  6. הכנס לחדר ההקלטה (מכיל זחל, ו paramecia) מערכת תאורה (איור 5D).
  7. להתחיל את ההקלטה בצילום מואץ על 10 fps עבור 11 דקות (6,600 מסגרות).
  8. (אופציונלי) עבור כל זחל שבו נבדקה על התנהגות, להתבונן על ידי קרינה פלואורסצנטית האזורים ablated לייזר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר את האפקטיביות של הלייזר-אבלציה (קרי, היעדרות או מופחתת באופן משמעותי מספר, פלורסנט תאים ב לייזר-מוקרן האזור).
    הערה: גם לאחר הקרנה, כמה תאים פלורסנט יכול עדיין להיות שנצפו בשל תחילת מאוחר יותר Gal4 ביטוי גנים בתאים הבדיל לאחר אבלציה27.
  9. לאחר הקלטת ההתנהגות של הזחל, כדי לפצות על חוסר אחידות ברקע, לבצע חלוקה על ידי פיקסל פיקסל של כל מסגרת על-ידי תמונה ממוצעת בפיג'י: לחץ על 'תהליך', 'תמונות ' מחשבון' ', ' מבצע: לחלק ' ' 32 סיביות (float) תוצאה ', ו ' אישור '. כדי להפוך תמונה ממוצעת, לחץ על 'תמונה' 'ערימות', 'Z-פרוייקט', 'עוצמת ממוצע', 'אישור' (איור 5E, F).
  10. ספירת מספר paramecia נשאר בתא על-ידי לחיצה על 'ניתוח', 'חלקיקים לנתח', הגדרת טווח האזור שמכסה כל את paramecia, בודק את תיבת הסימון 'הצג: מסכות' ולחיצה על 'אישור'. האפשרות 'הצג: מסכות' יספק תמונה שחולצו paramecia (איור 5גרם), עם רשימה של מספר חלקיקים (paramecia) בכל מסגרת.
  11. להתוות את מספר paramecia שמאלה בבית הבליעה הקלטה לאורך זמן. בגלל ההערכות של מספר paramecia רועש, אנו ממליצים על ביצוע ממוצע נע על כל נקודה במגוון רחב של מסגרות 600 (1דקות.) בגיליון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירונים ספציפיים גנטית עם תווית עם EGFP או GCaMP6s, אשר הביטוי גורשו בקווים Gal4 GSAIzGFFM119B קו Gal4 שימשה תווית גרעין באזור pretectal (הזרם שטחית pretectal גרעין), subpopulation של הנורה הריח נוירונים. קו Gal4 אחר, hspGFFDMC76A, שימש כדי לתייג את ILH. אנחנו לייזר-ablated הנוירונים pretectal דו צדדיים (איור 2א פאנל שמאלי), גם ablated נוירונים בהנורה הריח דו צדדיים כפקד (לוח נכוןאיור 2א ) בדג ז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שני הפוטונים הלייזר יש רזולוציה מרחבית מעולה כדי במיוחד ablate נוירונים בודדים, נהדר זהירות יש לנקוט כדי למנוע נזק בלתי רצויה על רקמת המוח עקב חום. הצעד החשוב ביותר לניסוי אבלציה היא לקבוע את כמות לייזר הקרנה אופטימלית. הקרנה לא מספיקות נכשלת להרוג את הנוירונים. הקרנה מדי יהיה חום-פגיעה ברקמות שמסביב, אשר תגרום תופעות לוואי. הטווח האופטימלי של לייזר הקרנה (תחומי ROIs, מספר חזרות, ומהירות סריקה) נראה צר. מספר גורמים משפיעים על יעילות הטיפול.

ראשון, באמצעות הכתב שונה פלורסנט חלבונים, התנאי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לדווח.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים אלה, במימון מענקים שהתקבלו מן MEXT, JSPS KAKENHI גרנט מספרים JP25290009, JP25650120, JP17K07494, JP17H05984.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
NuSieve GTG AgaroseLonzaCat.#50080טמפרטורת התכה נמוכה אגרוז
6 ס"מ צלחתפטרי FALCONמוצר#:351007
מחט ניתוחAS ONE CorporationCat. מס' 2-013-01https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MPקארל זייסמיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטוני
W Plan-Apochromat 63x/1.0Carl Zeiss63X עדשת אובייקטיבית
Imager.Z1Carl Zeissמיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי
ZENCarl Zeissתוכנת רכישת תמונה למיקרוסקופים קונפוקליים
אטם תא היברידיזציה Secure-Seal, 8 תאים, קוטר 9 מ"מ x 0.8 מ"מ עומקבדיקות מולקולריות# S-24732משמש כתא הקלטה בתאי הדמיה של Ca
Grace Bio-LabsCoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5משמש כסכין כירורגית תא הקלטה התנהגותי
סכיןעיניים MANI MST15
ORCA-Flash4.0Hamamatsu Photonicsדגם: C11440-22CUמצלמת CMOS מדעית
HCImageHamamatsu Photonicsתוכנה לעיבוד תמונה
מודול הקלטת דיסק קשיחHamamatsu Photonicsמודול תוכנה המאפשר שמירת קבצי הסרט על כונן דיסק קשיח תוך זמן קצר
סטריאוסקופSZX7Olympus
DF PL 0.5XOlympusעדשת אובייקט עבור SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 מגה פיקסל מונו USB3 VisioFLIR Systems, Inc.מס' מוצר GS3-U3-41C6NIR-CCMOS מצלמת
XIMEA xiQ מצלמהXIMEAמס' מוצר מצלמת CMOS
טבעת אור LEDCCSדגם: LDR2-100SW2-LAלבן LED
רשת ניילון 32µ mמסך טוקיוN-No.380Thttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
רשת ניילון 13&מיקרו; mTokyo ScreenN-No. 508T-Khttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
מתכת seive 150 מיקרון צמצםTokyo Screenhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
מתכת seive 75 מיקרוןTokyo Screenhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOSAsahi Food & בריאות ושות' בע"משמרי בירה יבשה
LabVIEWNational Instrumentsסביבת פיתוח משולבת לתכנות
Mai-Tai HPSpectra Physics לייזר דו-פוטוני 
קטלוג MQ042RG-CM

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  3. Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
  4. Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
  5. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  6. Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
  7. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  8. Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
  9. Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
  10. Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
  11. Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
  12. Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86(2013).
  13. Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015(2016).
  14. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  15. Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
  16. Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878(2014).
  17. Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
  18. Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
  19. Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
  20. Ewert, J. -P. Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , Springer Verlag. (1980).
  21. Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029(2017).
  22. Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
  23. Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , University of Oregon Press. (2007).
  24. National BioResource Project Paramecium. , Available from: http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en (2017).
  25. Fiji. , Available from: https://fiji.sc (2017).
  26. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  27. Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
  28. Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66(2005).
  29. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Z Stack

מאמרים קשורים