מאמר שיטה

דור של תאי אפיתל באף אדם Spheroids למחקר הרגולטור מוליכות Transmembrane תגובותיהם סיסטיק פיברוזיס

DOI:

10.3791/57492

⸱

11 באפריל 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים שיטה להפקת ספרואיד תלת מימדי התרבויות של תאי אפיתל באף אדם. Spheroids הם גירוי ואז לנהוג סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR)-יון התלויים, הפרשת נוזלים, לכימות בשינוי הגודל luminal ספרואיד כמדד עבור פונקציה CFTR.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בזמן כניסתה של סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR) אפנן סמים יש מהפכה טיפול ב סיסטיק פיברוזיס (CF), המודל טיפול מכוון גנוטיפ הנמצאות כעת בשימוש יש מספר מגבלות. המוטציה הראשונה, נדיר או understudied קבוצות לא יכללו מניסויים קליניים סופית. יתר על כן, כמו סמים אפנן נוספים להיכנס לשוק, יהפוך קשה למטב את הבחירות אפנן עבור נושא בודדים. שתי בעיות אלו מטופלות עם השימוש של מערכות נגזר החולה, תגובותיהם דגם פרה CFTR פונקציה, אפנון. תאי אפיתל באף אדם (HNEs) הם מקור נגיש בקלות של רקמות הנשימה מודל כזה. במסמך זה, אנו מתארים את הדור של מודל תלת מימדי ספרואיד של CFTR ותפקוד אפנון באמצעות HNEs הראשי. HNEs מבודדים מן הנבדקים בצורה פולשנית, מותנה בתנאי התיכנות, ושדרות נזרע לתוך התרבות ספרואיד. בתוך 2 שבועות של זריעה, ספרואיד תרבויות ליצור spheroids HNE זה יכול להיות מגורה עם 3', אדנוזין 5'-מחזורית monophosphate (מחנה)-יצירת אגוניסטים כדי להפעיל פונקציה CFTR. ספרואיד נפיחות לאחר מכן לכמת כמדד לפעילות CFTR. HNE spheroids לנצל מקור פולשנית, עדיין הנשימה לתאי האף כדי ליצור מודל נגיש, אישית הרלוונטיים האפיתל המשקף המחלה התחלואה והתמותה. לעומת התרבויות HNE אוויר נוזלי ממשק, spheroids הם מהיר יחסית להבשיל, אשר מפחית את שיעור הזיהום הכולל. במתכונתה הנוכחית, הדגם הוא מוגבל על ידי תפוקה נמוכה, למרות זה קוזז על ידי הקלות היחסית רקמות רכישה. HNE spheroids יכול לשמש כדי לכמת באופן אמין ולאפיין CFTR פעילות ברמת הפרט. לימוד מתמשך לקשור את כימות ויוו סמים לתגובה יקבע אם HNE spheroids הם מנבא פרה אמיתי של המטופל בתגובה CFTR אפנון.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה רצסיבי קטלנית, אוטוזומלית משפיע על יותר מ 70,000 אנשים ברחבי העולם1. זו מחלה גנטית של החיים-לקיצור נגרמת על ידי מוטציות בגן מוליכות Transmembrane סיסטיק פיברוזיס הרגולטור חלבון (CFTR)2. CFTR הוא חבר של המשפחה קלטת אדנוזין טריפוספט מחייב, וכן פונקציות כערוץ יון המאפשר תנועה של ביקרבונט הכלוריד על פני הממברנות הפסגה של epithelia מקוטב מרובים כולל של מערכת העיכול, בלוטות זיעה, מערכת הנשימה עץ, בין היתר3,4. ככזה, CFTR לקוי מוביל מכשל בתפקוד אפיתל, עם רוב תמותת הנובעות מחלות נשימה1. CF בריאה, אובדן של דרכי הנשימה מונחה-CFTR משטח נוזלי (ASL) תקנה, ריר שחרור מוביל ריר מעובה, חסימה בדרכי הנשימה, דלקת כרונית, ו שיפוץ דרכי הנשימה מתקדמת ואובדן של הריאה פונקציה1,5.

למרות הזיהוי של תפקוד CFTR סיבת המחלה, טיפולים ב- CF התמקדו באופן מסורתי להפחתת התסמינים (למשל, טיפול בתחליפי האנזים בלבלב, דרכי הנשימה סיווג טיפולים)1. גישה זו הייתה מהפכה לאחרונה על ידי הופעתו של הריפוי, כינה "CFTR מאפננים," שמכוון ישירות CFTR לקוי. גישה זו עברה הנוף קליני של ניהול סימפטום למחלות שינוי מעניין אבל נושאת מספר מגבלות6,7,8,9,10. פעילות אפנן היא ספציפית הפגם חלבון המלווה כל מוטציה CFTR מוגבל לבחירת אוכלוסיות גנטי11. מגבלה זו מונעת על ידי הטבע הטרוגנית של חלבון פגמים, אלא גם את טענותיהם של ניסויים קליניים בקבוצות מוטציה נדירה. בנוסף, בין נושאים עם למד היטב אחרים (למשל, F508del/F508del CFTR, המוטציה CFTR הנפוץ ביותר), יש השתנות רחב במחלת נטל, אפנן תגובה6,7,8 9, ,11.

כדי להתגבר על שתי בעיות אלו, חוקרים הציעו את השימוש הדגמים מותאמים אישית עבור בדיקה פרה12. המושג הזה מנצל החולה הספציפי רקמות כדי ליצור מערכת מודל בפעוט שמחוץ בדיקה מורכבת, חיזוי ויוו נושא התגובה לטיפולים בצורה אישית. לאחר האימות, מודל כזה יכול לשמש על ידי רופאים לטיפול דיוק נסיעה בין גנוטיפ CFTR הבסיסית של המטופל.

האדם הסימפונות (HBE) בתאי אפיתל המתקבל explant רקמות בזמנו של השתלת הריאות הקים את האפשרות של כזה דגם CF13,14. HBEs גדל ממשק אוויר נוזלי (עלי) מאפשרים פונקציונלי כימות CFTR ישירות באמצעות בדיקות electrophysiologic או בעקיפין באמצעות מדדי ASL הומאוסטזיס13,15. מודל זה כבר קריטי להבנת CFTR בביולוגיה, היה נהג מפתח בהתפתחות CFTR מאפננים16. למרבה הצער, מודלים HBE אינם בביאולוגיה כמודל אישית בשל העיקרון החודרני של רכישה (השתלת הריאות או צחצוח הסמפונות) וחוסר דוגמאות עבור אלה עם מוטציות נדירות או מחלה קלה. לעומת זאת, רקמת המעי, המתקבל דגימות ביופסיה רקטאלית או תריסריון, ניתן למדידה הנוכחי מעיים (ICM) או assay תא צורב מבוסס-נפיחות ללמוד בפעוט CFTR פונקציה17,18, 19. מבחני תא צורב, בפרט, הם מאוד רגישים דגמי CFTR פעילות20,21,22. שני הדגמים מוגבלים על ידי מקור רקמות (רקמת המעי, אמנם רוב המחלה פתולוגיה במערכת הנשימה) ושיטת רכישת פולשנית למחצה. לחלופין, מספר חוקרים חקרו האנושי האף (HNE) תאים אפיתל דגם CFTR שיקום23,24,25. HNEs ניתן לקצור בבטחה על ידי מברשת או גרידה נושאים בכל גיל, כאשר תרבותי ב עלי, לסכם מאפיינים רבים של HBEs25,26,27,28. HNE חד שכבתי תרבויות באופן מסורתי הייתה מוגבלת על-ידי שינוי קשקשיים, הרבה זמן הפירעון29. יתר על כן, דיווח קצר מידות הנוכחי HNEs הם קטנים יותר מאלו HBEs, רומז חלון קטן יותר כדי לזהות יעילות טיפולית25.

בהתחשב בצורך מודל תרביות רקמה אישית, לא פולשנית, הנשימה של הפונקציה CFTR, חיפשנו למזג את רגישות assay תא צורב מבוסס-נפיחות, עם אופי פולשני, מערכת הנשימה HNEs. כאן, אנו מתארים את השיטה שלנו של יצירת תלת-ממדי "ספרואיד" תרבויות HNEs למחקר CFTR תגובותיהם ב- מבוסס-נפיחות assay30. HNE spheroids polarize אמינה בעלת אפיתל לכיוון מרכז כדור, או לומן. מודל זה recapitulates מאפיינים רבים אפיתל בדרכי הנשימה התחתונה, מתפתח במהירות רבה יותר מאשר עלי תרבויות. כמו assay פונקציונלי, HNE spheroids לכמת באופן אמין עם טווח של CFTR פונקציה, וכן אפנון בקבוצות מוטציה למד היטב (למשל, F508del CFTR). זה וזמינותו המבוסס על נפיחות יהפוך לרישית על מאפייני התחבורה יון/מלח CFTR, בעקיפין מדידת זרם נוזלים לתוך ספרואיד המים כדלקמן בזרימת מלח הפסגה. בצורה כזאת, spheroids מגורה עם CFTR המתפקד במלואו להתנפח robustly, בעוד אלה עם תפקוד לקוי CFTR להתנפח פחות או לכווץ. זה הוא לכמת באמצעות ניתוח תמונות של טרום ושנה 1 h פוסט-גירוי spheroids, מדידת שטח luminal וקביעת האחוזים. אמצעי זה ניתן להשוות אז קבוצות ניסיוני עבור סמים אתריים באופן ספציפי לחולה מסך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמאות HNE היו שהשגת נושאים גייס דרך לילדים בסינסינטי החולים מרכז רפואי CF מרכז המחקר. כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי המוסדיים סקירה לוח (IRB) של המרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי. הסכמה בכתב היה המתקבלים בכל המקצועות לפני בדיקה.

1. מכינים הרחבה מדיה ומדיה לאנטיביוטיקה

  1. אוסף רכיבי מדיה המפורטים בטבלה1. הפשרת חומרים קפואים בטמפרטורת החדר ולהפוך פתרונות מניות הכרחי כמצוין בטבלה 1 תחת "הרחבת מדיה".
    הערה: נקוט משנה זהירות בעת טיפול רעלן כולרה, שהוא רעיל אם בולעים אותם, הוא עור, עיניים, מגרה בדרכי הנשימה. להפוך ולשלב פתרונות וכל מדיה בתנאים נקיים באבטחה הקבינט.
  2. באמצעות פיפטה serologic 50 מ ל, להסיר ולמחוק 50 מ של בסיס בינוני (Dulbecco ששינה נשר בינוני/F12) של מיכל אחד כדי לפצות על התוספת של חומרים אחרים. שופכים את כל המדיה הבסיס בעבודת יד לתוך בקבוק זכוכית בלוק 1 ליטר.
  3. באמצעות פיפטה serologic 50 מ ל או פיפטה 1 מ"ל המתאימים, להעביר כל הרכיבים הנותרים בחלק"התרחבות המדיה"של טבלה 1 לתוך בקבוק הזכוכית בלוק המכיל את המדיה. מערבולת בעדינות את הבקבוק ביד כדי לערבב.
  4. מדיה לסנן לתוך טרי, עקר 1 ליטר, מיקרומטר 0.22 polyethersulfone (פסי) לסנן את הבקבוק באמצעות הוראות היצרן ומפרשות עם "התרחבות המדיה" והתאריך.
  5. להכין מדיה לאנטיביוטיקה. להפוך את הצורך פתרונות מניות אנטיביוטי כמצוין בטבלה 1 תחת "מדיה לאנטיביוטיקה."
    1. באמצעות פיפטה סרולוגית 50 מ ל, העברה 150 מ ל מדיה הרחבה לבקבוק זכוכית בלוק טריים 250 מ.
    2. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, להוסיף כל הרכיבים בחלק"מדיה לאנטיביוטיקה"של טבלה 1 לתוך בקבוק הזכוכית בלוק המכיל את המדיה. מערבולת ידנית לערבב עד התקשורת יהיה אחיד במראה.
    3. מדיית סינון לתוך טרי, סטרילי 250 מל ', 0.22 מיקרומטר PES מסנן הבקבוק באמצעות הוראות היצרן, ביאור עם "אנטיביוטיקה" ומדיה תאריך.
  6. לאחסן מדיה ב 4 ° C עד לחודש, השמטת אם מעונן, רומז זיהום.

2. מכינים בידול מדיה

  1. אוסף רכיבי מדיה המפורטים בטבלה מס ' 2. הפשרת חומרים קפואים בטמפרטורת החדר ולהפוך פתרונות מניות הכרחי כמצוין בטבלה מס ' 2.
    הערה: נקוט זהירות בעת טיפול חומצה retinoic, אשר הוא רעלן הרבייה, יכול להיות רעיל אם בלע, וגורמת לגירוי העור. להפוך, aliquot, ולשלב את כל פתרונות ומדיה בתנאים נקיים באבטחה הקבינט.
  2. להסיר ולמחוק 52 מ של המדיום הבסיס של מיכל אחד כדי לפצות על התוספת של חומרים אחרים. שופכים את כל המדיה הבסיס לתוך בקבוק זכוכית בלוק 1 ליטר.
  3. באמצעות פיפטה סרולוגית 25 מ ל או פיפטה 1-mL לפי הצורך, להעביר כל הרכיבים הנותרים בטבלה 2 בקבוק הזכוכית בלוק המכיל התקשורת ו מערבולת בעדינות ביד לערבב.
  4. מדיה לסנן לתוך טרי, עקר 1 ליטר, מיקרומטר 0.22 polyethersulfone (פסי) לסנן את הבקבוק באמצעות הוראות היצרן ומפרשות עם "בידול מדיה" והתאריך.
  5. לאחסן מדיה ב 4 ° C עד לחודש, השמטת אם מעונן, רומז זיהום.

3. המעיל תרבות מנות לוח Fibroblasts מזין

הערה: ביצוע כל הצעדים בתנאים נקיים אבטחה בארון.

  1. מערבבים 0.5 מ"ל של קולגן מניות ו- 37.5 מ ל מים סטריליים צינור חרוטי 50 מ.
  2. פיפטה מ ל 4-5 של קולגן פתרון לתוך כל מנה תרבות P100 נקי, הבטחת שהשטח כולו מכוסה.
  3. מכסה מנות בשלמותם, דגירה בין לילה-CO 37 ° C ו-5%2.
  4. ב אבטחה הקבינט, להסיר כל מאכל העפעפיים. מערבולת פתרון מכסים הכלי, ולאחר מכן מחוק לגמרי.
  5. לחטא בחשיפה לאור אולטרה סגול (UV) אור ה' 1 מקום העפעפיים בחזרה על המנות, מנות מחסנית ומכסים ברדיד אלומיניום.
  6. חנות מצופה מנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3-6 חודשים, לחיטוי מחדש תחת UV אור 15-30 דקות לפני השימוש התרבות תאים.
  7. 24 שעות לפני קבלת מדגם HNE, לעקר מאכל מצופה מראש ותווית כמו העכבר מתחלקים פיברובלסט (MEF) ואת התאריך.
  8. הוסף התקשורת הרחבה לכיסוי לצלחת (כ- 5 מ"ל) עם פיפטה serologic.
  9. הפשרה בקבוקון 2 x 106 מוקרן MEFs ב waterbath 37 ° C. ברגע MEFs הם הקרת, להוסיף חצי של הבקבוקון (כ 106 תאים) המנה עם פיפטה 1-mL, מתערבל ביד כדי לפזר.
  10. דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בן לילה כהכנה HNE תרבות.
    הערה: אם נחוץ, הצעדים 3.7-3.10 יכול להיות הופיעה מאוחר ככל 60 דקות לפני ציפוי תאים, אבל בן לילה הוא אידיאלי.

4. לקבל ולעבד מדגם HNE

  1. ודא שאושרו על-ידי IRB הסכמה/סילוק מתקבל על כל הנושאים.
  2. יש אף מכה החולה כדי לנקות את הריר רופף.
  3. הצג באופן חזותי נחות turbinate משתמש של rhinoscope. להבטיח אין נגעים או פוליפים הם המתנה שאת עשויה למנוע איסוף הדגימה.
  4. לאסוף תאים האף בנחיר הראשון על ידי גרידה או צחצוח.
    1. גרידה: עיקול מגרד-האמצע שלה כדי ליצור קלה, ~ 135° זווית בעלת מן הכוס מגרד. הכנס את מגרד לתוך הנחיר ולקדם בגביע מגרד מתחת turbinate נחותים. הקש את גביע מגרד נגד נחותים turbinate ובעדינות לגרד את turbinate על ידי משיכת מגרד את קדימה, חוזר 3 - 4 פעמים בסך הכל.
    2. מברשת: מעבר ציטולוגיה מברשת מתחת נחותים turbinate, ואז לסובב ולהזיז המברשת פנימה והחוצה מעט 4 - 5 פעמים, מבלי לצאת הנחיר.
  5. המקום מגרד/מברשת ב 15 מ"ל חרוט ממולא מדיה לאנטיביוטיקה. חזור על הצעדים 4.3-4.4 בנחיר השני, הצבת מגרד/המברשת לתוך הצינור חרוט אותו.
  6. חנות חרוט על הקרח עד מוכן לעיבוד. ודא כי העיבוד מתבצע בתוך 4 שעות רכישת המדגם אבל יכול להתרחש מאוחר ככל 24 שעות לאחר הרכישה במידת הצורך.

5. תהליך ולהרחיב את התאים HNE במנות

הערה: ביצוע כל הצעדים בתנאים נקיים אבטחה בארון.

  1. באמצעות פיפטה 1-mL מדיה מדגם חרוט, לשטוף כל התאים מחוץ curettes/ציטולוגיה מברשות לתוך הצינור חרוט אותו. ברגע נקי, למחוק curettes / מברשות.
  2. צנטריפוגה חרוט ב 360 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. תגובת שיקוע וביופסיה, דואגת שלא להפריע בגדר התא.
  4. מחדש להשעות בגדר תא ב- 3 מ"ל של פתרון ניתוק התא, pipetting עם טיפ 1 מ"ל כדי homogenize את התערובת.
  5. צנטריפוגה חרוט ב 360 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  6. חזור על שלבים 5.3-5.5 פעם אחת.
  7. האחות תגובת שיקוע הנותרים, דואגת שלא להפריע בגדר התא.
  8. מחדש להשעות את צניפה ב 1 מ"ל ספירת תאים עם hemocytometer ומדיה לאנטיביוטיקה.
  9. באמצעות פיפטה של 1-mL, צלחת תאים dropwise לתוך קערה מצופה, נזרע פיברובלסט מוכן בשלב 3.10. הוסף מדיה אנטיביוטי מלא מכסים את הכלי, לפזר את התאים על פני השטח. תווית תבשיל עם התוכן ותאריך, דגירה-CO 37 ° C ו-5%2.
  10. לאחר 48 שעות, ודא כי התאים מחוברים לצלחת תרבות. האחות התקשורת והחלף מדיה לאנטיביוטיקה טריים מספיק כדי לכסות את הצלחת.
  11. לשנות מדיה 3 x שבועי, כ רפה בעברית המדיה הישנה עם קו ואקום, פסטר פיפטה, החלפת מדיה טריים מספיק כדי לכסות את הצלחת. לאחר 5 ימים במדיה לאנטיביוטיקה, לשנות את המדיה במדיה הרחבה, ממשיכים להחליף שלוש פעמים בשבוע.
    הערה: זיהום הסיכון הוא גבוה בשבוע הראשון של תרבות. לשמור דגימות טריות מגשים נפרדים כדי למזער את הסיכון של זיהום צולב.
  12. בדוק את צמיחת תאים מספר פעמים בשבוע. לאחר תאים כ 70-80% confluent, להמשיך מעבר תאים.

6. מעבר HNE תאים

  1. להכין פתרון טריפסין 0.1% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA).
    הערה: לנקוט זהירות בטיפול טריפסין, אשר הוא העור, מערכת הנשימה, ו עין מגרה.
    1. שוקל 15 מ ג של טריפסין מהלבלב חזירי צינור חרוטי.
    2. שוקל 56 מ"ג של EDTA צינור חרוטי נפרדים.
    3. בארון אבטחה, להעביר טריפסין, EDTA לתוך בקבוק זכוכית בלוק 250 מ. להשתמש aliquot קטן של מלח סטרילית באגירה פוספט (PBS) כדי לשטוף את הצינורות טריפסין/EDTA כדי להבטיח להשלים את ההעברה.
    4. הוסף PBS סטרילי כדי להביא את הפתרון הכולל 150 מ. סגור את מכסה הדוק.
    5. דגירה טריפסין פתרון waterbath 37 ° C עד התפרקה לחלוטין. בדוק כל 15 דקות ולהסיר מיד פעם התפרקה.
      הערה: אל תשאירו לא מסומן לתקופות ממושכות של זמן (למשל, בין לילה), כמו טריפסין בפתרון denature אם מחוממים במשך זמן רב מדי.
    6. לנקות את הבקבוק עם 2-3 תרסיסים של 70% אתנול וחוזרים אבטחה הקבינט.
    7. לסנן 0.1% טריפסין-EDTA פתרון לתוך רעננה, סטרילי 250 מל ', 0.22 מיקרומטר PES מסנן הבקבוק באמצעות הוראות היצרן, ביאור עם התוכן ותאריך.
    8. חנות טריפסין-EDTA פתרון ב 4 ° C עד לחודש, השמטת אם מעונן.
  2. להביא לטמפרטורת החדר למעלה מ-30 דקות נקיים עם 70% אתנול וביו -העברה אבטחה נקיים בארון בידול מדיה, פתרון טריפסין-EDTA 0.1% ו- PBS סטרילי.
  3. אבטחה הקבינט, להשתמש פסטר פיפטה ושורה ואקום כדי תשאף ולמחוק מדיה מקערה תרביות רקמה. לשטוף את הצלחת על-ידי הוספת, מתערבל וכ רפה בעברית 5 מ של PBS באמצעות פיפטה נקי סרולוגית.
  4. באמצעות פיפטה סרולוגית 5-mL, הוסף 5 מ של 0.1% טריפסין-EDTA פתרון למנה תרביות רקמה ולחזור החממה-CO של 37 ° C ו- 5%-2 למשך 5 דקות.
  5. דמיינו תאים במיקרוסקופ הפוך ב- X 4-10. בדוק התאים לנתק מתוך קערה, יתעגל, לצוף. טפח בעדינות את הצד של המנה תרבות לסלק תאים, ו/או תקופת דגירה מחדש של 5 דקות נוספות עד רוב התאים הם צמודי קרקע.
    הערה: קח זהירות כדי להסיר במהירות תאים פעם מנותקת המנה תרבות; חשיפה ממושכת 0.1% טריפסין-EDTA יפגום תא הכדאיות.
  6. באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ ל, הוסף 5 מ של התרחבות המדיה למנה ולאסוף כל התוכן נוזלי (סה כ 10 מ"ל) לתוך צינור חרוטי שכותרתו, סטרילי 50 מ.
  7. אם נותרו תאים חסיד לצלחת תרבות, חזור על השלבים 6.6 עד 6.4 שתי פעמים, איסוף התוכן בצינור חרוט אותו.
    1. אם נותרו תאים חסיד לצלחת תרבות אחרי שלושה סיבובים של חשיפה פתרון טריפסין, להשתמש במגרדת תא סטרילי בעדינות להסיר את השאר. לאחר גירוד המנה, לשטוף את המגרד תבשיל עם 5 מ של התרחבות המדיה ולאסוף בצינור חרוט שכותרתו זהה.
      הערה: אם passaging כדי spheroids, לשנות את הליך זה כדי לבצע trypsinization דיפרנציאלית. לאחר הוספת טריפסין פתרון (שלב 6.4.), בדוק את המנה לעתים קרובות עד fibroblasts יש תלושים (בדרך כלל 1-2 דקות), משאיר רק מצולע בתאי אפיתל המצורפת למנה. לאסוף, מניחים בצד זה supernatant, אשר יכול להיות passaged קדימה להרחבת. חזור על שלבים 6.4-6.6 באמצעות הפתרון זהה טריפסין, ולאסוף רק בתאי אפיתל הנותרים לתרבות ספרואיד.
  8. צנטריפוגה חרוט ב g x 360 עבור 5 דקות ו- 4 מעלות צלזיוס. האחות מדיה חרוט.
  9. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של הרחבה מדיה, ספירת תאים באמצעות של hemacytometer.
  10. ברגע לכמת, התאים ניתן לחלק במידת הצורך, גם passaged להעביר על גבי צלחת תרבות חדשה (כולל הכנה של פיברובלסט תרבות משותפת, שלב 3, וציפוי תאים עבור ההרחבה, צעדים 5.9-5.12) או תרבותי כמו spheroids (שלב 7).
    הערה: אם passaging לצלחת תרבות חדשה להרחבת, צפיפות זריעה של 0.5-1 × 106 תאים בצלחת P100 מומלץ.

7. זריעה תאים עבור HNE ספרואיד תרבויות

הערה: לבצע את כל ההליכים בשלב זה, מלבד צנטריפוגה, ב אבטחה נקיים בארון.

  1. הפשרת המטריקס קרום המרתף בקרח לפי הוראות היצרן (100 µL לכל ספרואיד טוב).
    הערה: לשקול ביצוע aliquots 500 µL סטרילי של המטריקס קרום המרתף על קבלה; סכום זה זרע לוח 4-טוב אחד.
  2. הפרד את המספר המתאים של תאים באופן שונה trypsinized, passaged (מתוך שלב 6.9) עבור ריכוז סופי של תאים 500,000 לכל מיליליטר המטריקס. לשימוש צלחת 4-ובכן, תאים 200,000. לאסוף צינור 1.5 מ.
  3. צנטריפוגה תערובת תא ומדיה ב g x 360 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. לגמרי, אבל בזהירות תשאף וזורקים מדיה באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, דואגת שלא להפריע בגדר התא.
  4. באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל, להוסיף µL 100 לכל מתוכנן היטב של המטריקס קרום המרתף כדי הצינור 1.5 mL המכילות את התאים. שמור את הצינורית על קרח.
  5. פיפטה למעלה ולמטה כדי בזהירות, resuspend ביסודיות תאי המטריקס קרום המרתף. לזוז מהר להימנע התמצקות של המטריקס. להימנע לחלוטין ריקון קצהו פיפטה כדי להבטיח בועות אוויר לא הציג לתערובת מטריקס/תא.
  6. זרע 100 µL מטריקס aliquots לתוך כל טוב של צלחת תרבות IVF 4-. טוב.
    1. בעזרת זוג מספריים, לקצץ את מ מ 3-4 דיסטלי של קצה פיפטה 200 µL.
    2. משתמש הקצה החתוך, בזהירות פיפטה µL 100 של תערובת תא/מטריצה לתוך המרכז של כל טוב. פיפטה לאט, עם המטרה של הפיכת מטריצה יחיד "טיפה" במרכז של כל טוב. אל תפיל את צריכה להישאר כדורית, לא צריכים לגעת בצדדים של הבאר. בעת העברת את הצלחת, לעשות אז בזהירות כדי שלא להפריע למטופלים אלה טיפות.
    3. דגירה הטיפות מטריקס קרום המרתף-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות, עד מוצק.
    4. בזהירות פיפטה 500 µL של בידול מדיה לתוך כל טוב, דואגת שלא להפריע הירידה מטריקס. ודא את מכסה רק של מדיה המטריקס להוריד ולהוסיף יותר במידת הצורך.

8. להבדיל ולומדים HNE Spheroids

  1. בעדינות באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל, וארוקן את כל אמצעי התקשורת מן הבאר; הימנע כ רפה בעברית המטריקס, אשר spheroids בחלק הזה של המטריצה, למרות כל spheroids נשאר מאחור עשויים להישאר בר קיימא.
  2. באמצעות טיפ פיפטה טרי 1 מ"ל, להוסיף בעדינות µL 500 של בידול מדיה הבאר ברחבי המטריקס. לא לגעת את המטריקס. עם פיפטה ולהימנע מפריע הירידה מטריקס.
  3. לחזור spheroids החממה ב 37 oC ו- 5% CO2 לצמיחה מתמשכת. חזור על שלבים 8.1 8.3 עד שלוש פעמים בשבוע
  4. הערכת ספרואיד מורפולוגיה מדי יום תחת מיקרוסקופ הפוכה בגיל 20 X. Spheroids צריך ליצור בתוך 3-5 ימים של ציפוי, בשלה. תוך 10 ימים בערך.

9. pretreat, מעוררים, תמונה HNE Spheroids לניתוח

  1. Pretreat spheroids כרצונכם לפני הדמיה כמו שתואר לעיל30.
    הערה: עבור רעלני VX809, להוסיף 3 מיקרומטר של VX809 המדיה עבור 48-72 שעות לפני הדמיה. לערבב 1 µL 10 מ מ VX809 מניות (ראה טבלת חומרים) ב- 3.3 מ של מדיה זו ריכוז.
  2. שינוי אחד טוב של spheroids מ ל 1 של מדיות התמיינות טריים, כולל רעלני (שלבים 8.1-8.3) לפני הדמיה spheroids.
  3. להכין טרי גירוי פתרונות סמים (Forskolin, 3-איזובוטיל-1-methylxanthine [IBMX], VX770, ו- CFTR מעכב 172 [Inh172]) של מניות (ראה טבלת חומרים). עבור forskolin/IBMX, להוסיף 1 µL של כל מניה µL 98 סטרילי מים יחיד הנקרא צינור 1.5 מ. עבור VX770 ו- Inh172, להוסיף 1 µL של כל מניה µL 99 מים סטריליים צינורות נפרדת עם תוויות mL 1.5. להפוך את הנפח הכולל ומאפשר µL 50 של פתרון עבור נבדקה כל היטב. להכין פתרונות בתנאים סטריליים ב אבטחה הקבינט.
  4. להעביר את הצלחת ספרואיד תא incubated מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס ו- 5% CO2, רכוב על מיקרוסקופ הפוכה מצוידים תוכנה ללכידת תמונה אלקטרונית, שלב מכני עבור התאמה XY. הפעל את המיקרוסקופ, מצלמה, כמו גם הדמיה במחשב.
  5. לכידת תמונות בסיסית של spheroids אחד היטב.
    1. פתח את תוכנת לכידת תמונה (5.5 Slidebook על ההוראות שלהלן). לאחר שהופעל, לפתוח קובץ חדש על-ידי לחיצה על "קובץ" ולאחר מכן "חדש". בהתאם לקובץ בשם ולחץ על "שמור".
    2. בזהירות להסיר את המכסה צלחת תרבות, מרכז מטריקס טיפה מעל המטרה.
    3. מתחיל בחלק העליון של הטיפה מטריקס, להעביר ברשת כדי למצוא spheroids ב- 20 x הגדלה עם מיקרוסקופ העינית. פוקוס למעלה ולמטה כדי ללכוד לספרה בנקודה הרחבה שלה. להוסיף את המיקום של כל ספרואיד על המפה של הטיפה מטריקס לזהות מחדש לאחר דימות.
    4. התוכנה, לחץ על "לכידת התמונה". חשיפה, בחר "ידני" והזן 50 גב להבטיח אחרים הגדרות מתאימות (סל פקטור: 1 x 1, w: 512, ח': 512, X ו- Y היסט: 0). הזן שם מתאים עבור כל תמונה בתיבה "Name" (למשל, ספרואיד 1 בסיסית). לחץ על "התחל" כדי להציג תמונה בשידור חי, ו "שמור" כדי ללכוד תמונה בסיסית.
    5. חזור על צעדים 9.5.1-9.5.4 עד למספר המטרה, או מטריצה כל טיפה היא עם תמונה.
      הערה: קבוצה ההבדלים יכולים להתגלות עם כמה כמו 3-5 spheroids לכל תנאי, עם זאת, הוא הפך אצלנו כדי תמונה spheroids 10 או יותר לכל תנאי כדי להגדיל את כוח. השתנות וזמינותו היא הפגינו איור 2 בסעיף "נציג תוצאות", עם דוגמאות של 8-10 spheroids לכל נושא כדוגמה.
  6. לעורר spheroids.
    1. באמצעות פיפטה 200 µL, להוסיף 50 µL של הסם גירוי מתאים לתוך התקשורת בתוך הבאר, דואגת שלא להפריע את המטריקס.
      הערה: לאחר דילול 10-fold הזה (50 µL לתוך µL 500 של המדיה), ריכוז התרופה הסופית תהיה: forskolin 10 מיקרומטר, IBMX 100 מיקרומטר, VX770 1 מיקרומטר, Inh172 10 מיקרומטר.
    2. מחנה בלבד, הוסיפו forskolin רק/IBMX.
    3. מחנה + VX770, הוסיפו forskolin/IBMX קודם, ואז VX770 לאחר 2 דקות.
    4. תנאים עכבות, להוסיף Inh172 הראשונה, ואז forskolin/IBMX לאחר 2 דקות.
  7. מיד לאחר גירוי, לפקח ספרואיד נפיחות על ידי הדמיה timelapse לשעה. התוכנה, לחץ על "לכידת התמונה". לחץ על "Timelapse", והגדר את מרווח הזמן 30 s, עם משך של 60 דקות הזן שם מתאים ולחץ על "שמור" כדי להפעיל את timelapse.
    הערה: timelapse רגיל הוא ללכוד תמונות של ספרואיד יחיד כל 30 s כדי להבטיח וידאו באיכות גבוהה. לחלופין, לבצע לכידת התחתונה-הגדלה של הבאר כולה (למשל, 4 X), פחות תמונות שנלכדו במידת הצורך. אם שלב אוטומטיות, לבצע timelapse של כל spheroids באמצעות קואורדינטות מוגדרים מראש; אחרת, משתמשים timelapse של קבוצת משנה של spheroids כדי לספק סקירה איכותית של נפיחות, כדי להבטיח אין בעיות שיטתית להתעורר במהלך הדימות (למשל, מטריקס הניתוק מן הבאר).
  8. מיד עם סיומו של התמונה timelapse 1 h, ללכוד תמונות לאחר גירוי של כל spheroids (לכל שלב 9.5) באמצעות המפה שנוצר בשלב 9.5.3.
    1. עיין בתמונות גירוי מראש כדי להבטיח שאותו מישור המיקוד משמש עבור תמונות מעקב (איכות מוקד המקיף תאים, spheroids או פסולת במידה רבה לסייע לתהליך זה).
    2. שמור קבצים לביאור לזווג מהשלב 9.5.4 (למשל, גירוי שלאחר 1 ספרואיד).
      הערה: להשלים שלב זה מיד לאחר timelapse, כמו spheroids יכול להמשיך להתנפח.
  9. החלף המדיה הדמיה היטב עם מדיה בידול טריים.
  10. חזור על הצעדים 9.5 דרך 9.9 כל טוב/תנאי, התאמת תרופות גירוי כמצוין בתנאי הניסוי.
  11. ברגע דימות כל הושלם, לחזור spheroids החממה-CO 37 ° C ו-5%2.
    הערה: על בהתאם העקרות של התא מיקרוסקופ מתפשט, גירוי שלאחר זיהום של spheroids יכול להיות די נפוץ. לשמור spheroids שבעורך מגשים נפרדים, כדי למזער את הסיכון של זיהום צולב, או למחוק את spheroids מיד לאחר דימות.

10. לנתח HNE ספרואיד תמונות

  1. לייצא תמונות שנתפסו הכל לתבנית תואמת לתוכנת ניתוח התמונה. התוכנה, לחץ על "תצוגה", לרחף מעל "ייצוא", ובחר "ברירת מחדל נופים של כל תמונות כמו TIFF...". שמור את הכונן הקשיח או כונן הבזק לניתוח.
    הערה: A ניתוח מסחרי תוכנה (טבלה של חומרים) ו- tiff לבצע היטב, מתוארים כאן, למרות ניתוח יכול גם להתבצע באמצעות פלטפורמות אחרות. כאשר מתן שמות לקבצים, צוות ניתוח התמונות צריך להיות עיוור לתנאי הניסוי, אבל מודע אילו תמונות משויכים (קדם וגירוי שלאחר) כדי להבטיח ניתוח שווי ערך.
  2. באמצעות ניתוח תוכנה, ניסחו את האזור luminal של כל תמונה ספרואיד ולייצא לתוך תוכנת ניתוח נתונים.
    1. תוכנת ניתוח פתוח. לחץ על "קובץ" ואז "פתח", נווט אל התיקיה קבצים המכילים תמונות ספרואיד. בחר את כל התמונות לניתוח ולחץ על 'פתח'.
    2. לחץ על "מדד" ובחר "אזור מדידות". בתוך תיבת הדו-שיח מדידות אזור, בחר את droptab "תצורת" ולהבטיח "התמונה שם" ו- "אזור" תיבות מסומנות.
    3. לחץ על "יומן" ובחר "יומן נתונים פתוח". לחץ על "OK" על נתוני יומן דיאלוג תיבת ואת שם הקובץ בהתאם (למשל, תנאי X, תאריך). זה יעביר כל המדידות לגיליון אלקטרוני.
    4. בחר בלחצן כלי "עקבות אזור", בזהירות עקבות לומן של ספרואיד בתמונה הראשונה לצורך ניתוח. בתיבת הדיאלוג מדידה באזור, לחץ על "יומן נתונים" כדי להיכנס המדידה לתוך Excel.
    5. חזור על צעדים 10.2.2-10.2.4 עד spheroids כל מנותחות.
  3. לחשב שיעור שינוי (100 * [פוסט-סאונד - בסיסית] ÷ בסיסית) באזור luminal מקו עבור ספרואיד בודדים כל תמונה זוג ולעבד נתונים, לצורך ניתוחם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HNEs צריך לצרף המנה תרבות ויוצרים איים קטנים של תאים בתוך 72 h של זריעה; דוגמאות של היווצרות האי טוב ועניים בגיל שבוע מוצגים איור 1A ו- 1B, בהתאמה. איים אלה שכדאי להרחיב מכסים את הכלי מעל 15-30 ימים. דוגמאות קטנות או שיוצרת עשויה להימשך זמן רב, לעיתים קרובות לא תניב שימושי spheroids. זיהום עם מדבקים שמעידים מדיה עמוק צהוב/מעונן, כשל של התאים כדי לצרף המנה תרבות, ו/או פריט חזותי ישיר של פטריות/חיידקים. כל התרבויות מזוהמים צריכים להיות מושלך מי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הדור של תרבויות ספרואיד תא האף נגזר החולה מסוגל לייצר מודל בפעוט, מסוים של פונקציה CFTR. ישנם מספר שלבים מרכזיים בתהליך זה צריך להיות נוכחת מקרוב כדי למנוע קושי. ראשית הוא רכישת מדגם טוב מן האף של המטופל. דגימה טובה צריך > 50,000 תאים, מוגבל ריר/פסולת, ולהיות מוכן לעיבוד בתוך 4 שעות (למרות ההצלחה הוא בר השגה בקלות גם עם לילה משלוח על הקרח). תרגול רכישת דגימות עם מגרד או מברשת על ידי צוות המחקר הוא הכרחי, אשר בהנחייתם של התמקדות לדוגמה רכישת לידיים של ספקי אחד או שניים כדי למקסם את הנוחות שלהם. שנית, ט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס הרפוי, להעניק מספר CLANCY14XX0, דרך איגוד סיסטיק פיברוזיס, להעניק מספר CLANCY15R0. המחברים רוצים להודות קריסטינה ריי על הסיוע במתן החולה רגולטורי. המחברים גם רוצים להודות קבוצת העבודה HNE, נתמך על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס, אשר סייעו בדור של HNE תרבות יכולות: פרסטון Bratcher, כותנה קלווין, מרטינה Gentzsch, אליזבת Joseloff, מייקל Myerburg, ניקולס דייב, סקוט רנדל, סטיב רואו, שלמה מרטי ג ו קתרין טאגל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 מ"ל שפופרת אפנדורףארה"ב מדעי 4036-3204
בקבוק סינון 150 מ"לMidsci TP99150לסינון מדיה
15 מ"ל צינור חרוטיMidsci 
TP91015 בקבוק סינון 1 ליטרMidsci TP99950לסינון מדיה
35 מ"מ צלחת תחתית זכוכיתMatTek CorporationP35G-0-20-Cאופציונלי
3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX)פישר סיינטיפיק AC228420010 הכן תמיסת מלאי של 100 מ"מ של 22.0 מ"ג ב-1 מ"ל של DMSO
50 מ"ל צינור חרוטיMidsci  
AccutaseInnovative Cell Technologies, Inc.AT-104תמיסת ניתוק תאים
אדניןסיגמא-אולדריץ'A2786-25Gראה טבלה 1
אמפוטריצין Bסיגמא-אולדריץ'A9528-100MGראה טבלה 1
תמצית מוח בקר (9 מ"ג/מ"ל)לונזה CC-4098ראה טבלה 2
Ceftazidime hydrateSigma-AldrichC3809-1Gראה טבלה 1
מגרדי תאים 20 ס"מ מידסי 
CFTR Inh172Tocris Bioscience3430הכן תמיסת מלאי של 10 מ"מ של 4.0 מ"ג ב-1 מ"ל של רעלן DMSO
כולרה B (מ-Vibrio cholerae)סיגמא-אולדריץ'C8052-.5MGראה טבלה 1
CYB-1תאגיד אריזות רפואיותCYB-1מברשת ציטולוגיה
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'D5879-500ML
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes טכנולוגיות חיים 11330-057בינוני בסיס; ראה טבלאות 1 ו-2
גורם גדילה אפידרמיס (חלבון אנושי רקומביננטי, ללא מקור מן החי)Thermo Fisher ScientificPHG6045ראה טבלה 1
אפינפריןסיגמא-אולדריץ'E4250-1Gראה טבלה 2
אתנולפישר סיינטיפיק 2701
אתנולמיןסיגמא-אולדריץ'E0135-500MLתמיסה 16.6 מ"מ; ראה טבלה 2
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)TCI America E0084
סרום בקר עוברי (ביצועים גבוהים FBS)Invitrogen 10082147ראה טבלה 1
ForskolinSigma-AldrichF6886-50הכן תמיסת מלאי של 10 מ"מ של 4.1 מ"ג ב-1 מ"ל של
DMSO Growth Factor-Reduced MatrigelCorning, Inc.356231קורנינג מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת ממברנה בסיסית, ללא פנול אדום, ללא LDEV, 10 מ"ל.
HemacytometerHausser Scientific1483
תמיסת קולגן אנושי, סוג I (VitroCol; 3 מ"ג/מ"ל)Advanced BioMatrix5007-Aתמיסת קולגן
HyClone (הידועה גם בשם FetalClone II) GE בריאות SH30066.03HIראה טבלה 2
טכנולוגיות תאי גזעהידרוקורטיזון07904ראה טבלאות 1 ו-2
אינסולין, רקומביננט אנושי, תמיסת אבץטכנולוגיות חיים 12585014תמיסה של 4 מ"ג/מ"ל; ראה טבלה 2
צלחת IVF 4 בארות, NUNC לא מטופל(באמצעות Fisher Scientific)12566350צלחת 4 בארות לספרואידים; גודל באר דומה לצלחת 24 בארות
MEF-CF1-IRRGlobalstemGSC-6001Gפיברובלסטים עובריים של עכברים מוקרנים
מטמורף 7.7מכשיריםמולקולרייםתוכנת ניתוח; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software לציטוט
אולימפוס IX51 מיקרוסקופ הפוךתאגיד אולימפוסהופסקמיקרוסקופ הדמיה. מחליף: אולימפוס IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  להצעת מחיר
Pen StrepLife Technologies 15140122ראה טבלה 2
PhsophoryletheanolamineSigma-AldrichP0503-5Gראה טבלה 2
חומצה רטינואיתSigma-AldrichR2625-50MGראה טבלה 2
RhinoprobeArlington Scientific, Inc.96-0905קורט
שקופיות 5.53i, חידושי הדמיה חכמיםשהופסקה. החלפה: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook לציטוט
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific20012050
Sterile WaterSigma-AldrichW3500-6X500ML
צלחת תרבית רקמות 100טכנו מוצרי פלסטיק93100צלחת תרבית רקמות להרחבה
TobramycinSigma-AldrichT4014-100MGראה טבלה 1
טרנספרין (טרנספרין אנושי 0.5 מ"ל)Lonza CC-4205ראה טבלה 2
TriiodothryonineSigma-AldrichT6397-1G3,3′,5-Triiodo-L-thyronine salt נתרן  [T3]; ראה טבלה 2
טריפסין מלבלב חזירSigma-AldrichT4799-10G
Ultroser-GCrescent Chemical (דרך Fisher Scientific)NC039302420 מ"ל אבקה ליפופילית; ראה טבלה 2
ונקומיצין הידרוכלוריד מ- Streptomyces orientalisSigma-AldrichV2002-5Gראה טבלה 1
VX770Selleck ChemicalsS1144הכן תמיסת מלאי של 1 מ"ג של 0.4 מ"ג ב -1 מ"ל של DMSO
VX809Selleck ChemicalsS1565רכוש או הכן תמיסת מלאי של 10 מ"ג של 4.5 מ"ג ב -1 מ"ל של DMSO
Y-27632 דיהידרוכלוריד  מעכב ROCK אנזו מדעי החיים ALX-270-333-M025 ראה טבלה 1
TP91050TP99010 אף תוכנת הדמיה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
  2. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  3. Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
  4. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
  5. Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
  6. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  7. De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
  8. Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
  9. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
  10. Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
  11. CFTR2 Database. , www.cftr2.org (2017).
  12. Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
  13. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  14. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
  15. Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
  16. Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
  17. Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
  18. van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
  19. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
  21. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
  22. Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
  23. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
  24. Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
  25. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375(2017).
  26. Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
  27. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
  28. Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802(2014).
  29. Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
  30. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
  31. Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842(2014).
  32. Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CFTRcAMPCFTR

מאמרים קשורים