כאן אנו מתארים שיטה להפקת ספרואיד תלת מימדי התרבויות של תאי אפיתל באף אדם. Spheroids הם גירוי ואז לנהוג סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR)-יון התלויים, הפרשת נוזלים, לכימות בשינוי הגודל luminal ספרואיד כמדד עבור פונקציה CFTR.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דור של תאי אפיתל באף אדם Spheroids למחקר הרגולטור מוליכות Transmembrane תגובותיהם סיסטיק פיברוזיס
במאמר זה
סיכום
תקציר
בזמן כניסתה של סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR) אפנן סמים יש מהפכה טיפול ב סיסטיק פיברוזיס (CF), המודל טיפול מכוון גנוטיפ הנמצאות כעת בשימוש יש מספר מגבלות. המוטציה הראשונה, נדיר או understudied קבוצות לא יכללו מניסויים קליניים סופית. יתר על כן, כמו סמים אפנן נוספים להיכנס לשוק, יהפוך קשה למטב את הבחירות אפנן עבור נושא בודדים. שתי בעיות אלו מטופלות עם השימוש של מערכות נגזר החולה, תגובותיהם דגם פרה CFTR פונקציה, אפנון. תאי אפיתל באף אדם (HNEs) הם מקור נגיש בקלות של רקמות הנשימה מודל כזה. במסמך זה, אנו מתארים את הדור של מודל תלת מימדי ספרואיד של CFTR ותפקוד אפנון באמצעות HNEs הראשי. HNEs מבודדים מן הנבדקים בצורה פולשנית, מותנה בתנאי התיכנות, ושדרות נזרע לתוך התרבות ספרואיד. בתוך 2 שבועות של זריעה, ספרואיד תרבויות ליצור spheroids HNE זה יכול להיות מגורה עם 3', אדנוזין 5'-מחזורית monophosphate (מחנה)-יצירת אגוניסטים כדי להפעיל פונקציה CFTR. ספרואיד נפיחות לאחר מכן לכמת כמדד לפעילות CFTR. HNE spheroids לנצל מקור פולשנית, עדיין הנשימה לתאי האף כדי ליצור מודל נגיש, אישית הרלוונטיים האפיתל המשקף המחלה התחלואה והתמותה. לעומת התרבויות HNE אוויר נוזלי ממשק, spheroids הם מהיר יחסית להבשיל, אשר מפחית את שיעור הזיהום הכולל. במתכונתה הנוכחית, הדגם הוא מוגבל על ידי תפוקה נמוכה, למרות זה קוזז על ידי הקלות היחסית רקמות רכישה. HNE spheroids יכול לשמש כדי לכמת באופן אמין ולאפיין CFTR פעילות ברמת הפרט. לימוד מתמשך לקשור את כימות ויוו סמים לתגובה יקבע אם HNE spheroids הם מנבא פרה אמיתי של המטופל בתגובה CFTR אפנון.
מבוא
סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה רצסיבי קטלנית, אוטוזומלית משפיע על יותר מ 70,000 אנשים ברחבי העולם1. זו מחלה גנטית של החיים-לקיצור נגרמת על ידי מוטציות בגן מוליכות Transmembrane סיסטיק פיברוזיס הרגולטור חלבון (CFTR)2. CFTR הוא חבר של המשפחה קלטת אדנוזין טריפוספט מחייב, וכן פונקציות כערוץ יון המאפשר תנועה של ביקרבונט הכלוריד על פני הממברנות הפסגה של epithelia מקוטב מרובים כולל של מערכת העיכול, בלוטות זיעה, מערכת הנשימה עץ, בין היתר3,4. ככזה, CFTR לקוי מוביל מכשל בתפקוד אפיתל, עם רוב תמותת הנובעות מחלות נשימה1. CF בריאה, אובדן של דרכי הנשימה מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דוגמאות HNE היו שהשגת נושאים גייס דרך לילדים בסינסינטי החולים מרכז רפואי CF מרכז המחקר. כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי המוסדיים סקירה לוח (IRB) של המרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי. הסכמה בכתב היה המתקבלים בכל המקצועות לפני בדיקה.
1. מכינים הרחבה מדיה ומדיה לאנטיביוטיקה
- אוסף רכיבי מדיה המפורטים בטבלה1. הפשרת חומרים קפואים בטמפרטורת החדר ולהפוך פתרונות מניות הכרחי כמצוין בטבלה 1 תחת "הרחבת מדיה".
הערה: נקוט משנה זהירות בעת טיפול רעלן כולרה, שהוא רעיל אם בולעים אותם, הוא עור, עיניים, מגרה בדרכי הנשימה. להפוך ולשלב פתרונות וכל מדיה בתנאים נקיים באבטחה הקבינט. - באמצעות פיפטה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
HNEs צריך לצרף המנה תרבות ויוצרים איים קטנים של תאים בתוך 72 h של זריעה; דוגמאות של היווצרות האי טוב ועניים בגיל שבוע מוצגים איור 1A ו- 1B, בהתאמה. איים אלה שכדאי להרחיב מכסים את הכלי מעל 15-30 ימים. דוגמאות קטנות או שיוצרת עשויה להימשך זמן רב, לעיתים קרובות לא תניב שימושי spheroids. זיהום עם מדבקים שמעידים מדיה עמוק צהוב/מעונן, כשל של התאים כדי לצרף המנה תרבות, ו/או פריט חזותי ישיר של פטריות/חיידקים. כל התרבויות מזוהמים צריכים להיות מושלך מי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר את הדור של תרבויות ספרואיד תא האף נגזר החולה מסוגל לייצר מודל בפעוט, מסוים של פונקציה CFTR. ישנם מספר שלבים מרכזיים בתהליך זה צריך להיות נוכחת מקרוב כדי למנוע קושי. ראשית הוא רכישת מדגם טוב מן האף של המטופל. דגימה טובה צריך > 50,000 תאים, מוגבל ריר/פסולת, ולהיות מוכן לעיבוד בתוך 4 שעות (למרות ההצלחה הוא בר השגה בקלות גם עם לילה משלוח על הקרח). תרגול רכישת דגימות עם מגרד או מברשת על ידי צוות המחקר הוא הכרחי, אשר בהנחייתם של התמקדות לדוגמה רכישת לידיים של ספקי אחד או שניים כדי למקסם את הנוחות שלהם. שנית, ט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס הרפוי, להעניק מספר CLANCY14XX0, דרך איגוד סיסטיק פיברוזיס, להעניק מספר CLANCY15R0. המחברים רוצים להודות קריסטינה ריי על הסיוע במתן החולה רגולטורי. המחברים גם רוצים להודות קבוצת העבודה HNE, נתמך על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס, אשר סייעו בדור של HNE תרבות יכולות: פרסטון Bratcher, כותנה קלווין, מרטינה Gentzsch, אליזבת Joseloff, מייקל Myerburg, ניקולס דייב, סקוט רנדל, סטיב רואו, שלמה מרטי ג ו קתרין טאגל.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1.5 מ"ל שפופרת אפנדורף | ארה"ב מדעי | 4036-3204 | |
| בקבוק סינון 150 מ"ל | Midsci | TP99150 | לסינון מדיה |
| 15 מ"ל צינור חרוטי | Midsci | ||
| TP91015 בקבוק סינון 1 ליטר | Midsci | TP99950 | לסינון מדיה |
| 35 מ"מ צלחת תחתית זכוכית | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | אופציונלי |
| 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX) | פישר סיינטיפיק | AC228420010 | הכן תמיסת מלאי של 100 מ"מ של 22.0 מ"ג ב-1 מ"ל של DMSO |
| 50 מ"ל צינור חרוטי | Midsci | ||
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | תמיסת ניתוק תאים |
| אדנין | סיגמא-אולדריץ' | A2786-25G | ראה טבלה 1 |
| אמפוטריצין B | סיגמא-אולדריץ' | A9528-100MG | ראה טבלה 1 |
| תמצית מוח בקר (9 מ"ג/מ"ל) | לונזה | CC-4098 | ראה טבלה 2 |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | ראה טבלה 1 |
| מגרדי תאים 20 ס"מ | מידסי | ||
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | הכן תמיסת מלאי של 10 מ"מ של 4.0 מ"ג ב-1 מ"ל של רעלן DMSO |
| כולרה B (מ-Vibrio cholerae) | סיגמא-אולדריץ' | C8052-.5MG | ראה טבלה 1 |
| CYB-1 | תאגיד אריזות רפואיות | CYB-1 | מברשת ציטולוגיה |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | סיגמא-אולדריץ' | D5879-500ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | טכנולוגיות חיים | 11330-057 | בינוני בסיס; ראה טבלאות 1 ו-2 |
| גורם גדילה אפידרמיס (חלבון אנושי רקומביננטי, ללא מקור מן החי) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | ראה טבלה 1 |
| אפינפרין | סיגמא-אולדריץ' | E4250-1G | ראה טבלה 2 |
| אתנול | פישר סיינטיפיק | 2701 | |
| אתנולמין | סיגמא-אולדריץ' | E0135-500ML | תמיסה 16.6 מ"מ; ראה טבלה 2 |
| חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) | TCI America | E0084 | |
| סרום בקר עוברי (ביצועים גבוהים FBS) | Invitrogen | 10082147 | ראה טבלה 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | הכן תמיסת מלאי של 10 מ"מ של 4.1 מ"ג ב-1 מ"ל של |
| DMSO Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | קורנינג מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת ממברנה בסיסית, ללא פנול אדום, ללא LDEV, 10 מ"ל. |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| תמיסת קולגן אנושי, סוג I (VitroCol; 3 מ"ג/מ"ל) | Advanced BioMatrix | 5007-A | תמיסת קולגן |
| HyClone (הידועה גם בשם FetalClone II) | GE בריאות | SH30066.03HI | ראה טבלה 2 |
| טכנולוגיות תאי גזע | הידרוקורטיזון | 07904 | ראה טבלאות 1 ו-2 |
| אינסולין, רקומביננט אנושי, תמיסת אבץ | טכנולוגיות חיים | 12585014 | תמיסה של 4 מ"ג/מ"ל; ראה טבלה 2 |
| צלחת IVF 4 בארות, NUNC לא מטופל | (באמצעות Fisher Scientific)12566350 | צלחת 4 בארות לספרואידים; גודל באר דומה לצלחת 24 בארות | |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | פיברובלסטים עובריים של עכברים מוקרנים |
| מטמורף 7.7 | מכשירים | מולקולרייםתוכנת ניתוח; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software לציטוט | |
| אולימפוס IX51 מיקרוסקופ הפוך | תאגיד אולימפוס | הופסק | מיקרוסקופ הדמיה. מחליף: אולימפוס IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ להצעת מחיר |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | ראה טבלה 2 |
| Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | ראה טבלה 2 |
| חומצה רטינואית | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | ראה טבלה 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | קורט |
| שקופיות 5.5 | 3i, חידושי הדמיה חכמים | שהופסקה | . החלפה: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook לציטוט |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| צלחת תרבית רקמות 100 | טכנו מוצרי פלסטיק | 93100 | צלחת תרבית רקמות להרחבה |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | ראה טבלה 1 |
| טרנספרין (טרנספרין אנושי 0.5 מ"ל) | Lonza | CC-4205 | ראה טבלה 2 |
| Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine salt נתרן [T3]; ראה טבלה 2 |
| טריפסין מלבלב חזיר | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (דרך Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 מ"ל אבקה ליפופילית; ראה טבלה 2 |
| ונקומיצין הידרוכלוריד מ- Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | ראה טבלה 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | הכן תמיסת מלאי של 1 מ"ג של 0.4 מ"ג ב -1 מ"ל של DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | רכוש או הכן תמיסת מלאי של 10 מ"ג של 4.5 מ"ג ב -1 מ"ל של DMSO |
| Y-27632 דיהידרוכלוריד מעכב ROCK | אנזו מדעי החיים | ALX-270-333-M025 | ראה טבלה 1 |
מקורות
- Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Anderson, M. P., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
