הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

9.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57498

⸱

26 באפריל 2018

 , 
1Department of Molecular Biology, UT Southwestern Medical Center

במאמר זה

סיכום

כאן נשתמש agarose למחצה denaturing דו-ממדית בג'ל כדי לאשר הנוכחות של סיבי עמילואיד כמו גודל הטרוגניות או לא לכלול את האפשרות הטרוגניות גודל נובע דיסוציאציה של סיבי עמילואיד במהלך הג'ל התהליך פועל.

תקציר

סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי קושרו עם מחלות רבות, עכשיו מתגלים להיות חשובה עבור רבים איתות המסלולים. היכולת לזהות בקלות היווצרות של סיבים אלה בתנאים שונים נסיוני חיוני להבנת פונקציית הפוטנציאל שלהם. שיטות רבות השתמשו כדי לזהות את הסיבים, אבל לא בלי מספר חסרונות. לדוגמה, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), או צביעת קונגו האדום או Thioflavin T לעיתים קרובות דורשת טיהור של הסיבים. מצד שני, agarose דטרגנט למחצה denaturing בג'ל (SDD-גיל) מאפשרת זיהוי של סיבי עמילואיד דמוי עמידים מרחביות תמציות תא ללא טיהור. בנוסף, הוא מאפשר השוואת ההבדל בגודל של הסיבים. ויותר חשוב, זה יכול לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בתוך הסיבים מאת סופג המערבי. זה פחות זמן רב ונגיש בקלות רבה יותר על מספר רחב של מעבדות. המפגין-גיל התוצאות מציגות לעיתים קרובות משתנה מידת הטרוגניות. זה מעלה את השאלה אם חלק הטרוגניות נובעת הדיסוציאציה של החלבונים במהלך אלקטרופורזה בנוכחות מרחביות. מסיבה זו, יש לנו עובדים ממד השנייה של המפגין-גיל כדי לקבוע אם הטרוגניות גודל ראיתי בעידן-המפגין הוא באמת תוצאה של סיבים הטרוגניות ויוו , לא תוצאה של השפלה או דיסוציאציה של חלק החלבונים במהלך אלקטרופורזה. שיטה זו מאפשרת אישור מהיר, איכותי כי סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי לא בריא באופן חלקי במהלך תהליך המפגין-גיל.

מבוא

היווצרות של סיבי עמילואיד עקב חלבון misfolding יש כבר זמן רב ידוע לשחק תפקיד פיפטות מחלות כמו אלצהיימר, פרקינסון, מחלת הנטינגטון1. לאחרונה, היווצרות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי הוכח להיות חלק איתות המסלולים בבני אדם, לרבות במהלך התגובה החיסונית מולדת אנטי ויראלית2 ו- necroptosis3,4, ואת היצורים התחתון כגון שמרים5,6. לכן, היכולת לזהות סיבים אלו במעבדה הוא חשוב. כיום, ישנן שלוש דרכים הראשי כדי לזהות עמילואיד ו סיבי עמילואיד כמו: השימוש של צבעי EM, המפגין-גיל.

השימוש של צבעים, כגון קונגו האדום או Thioflavin T, מציעה את היתרון של להיות מהירה בקלות לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ או ספקטרוסקופיה7. עם זאת, זיהוי על ידי מיקרוסקופ, במקרה של קונגו אדום, מספק אין ירידה לפרטים אודותיו חלבונים המרכיבים את הסיבים, או הגודל של הסיבים. בדומה לכך, השימוש של ספקטרוסקופיה לאתר קשירה קונגו אדום או Thioflavin T מתחמי חלבון מספק רק תוצאה חיובית או שלילית.

EM מספקת ראיה חלוטה הנוכחות של סיבים וגם מידע כמותי אודות סיבי האורך ואת קוטר8. עם זאת, שיטה זו דורשת טיהור מחמירים מאוד. בנוסף, EM היא טכניקה מיוחדת אשר משתמשת ציוד יקר.

המפגין-גיל שימש כדי לזהות עמידים מרחביות מגה דלטון חלבון מתחמי לרבות סיבי עמילואיד או דמוי עמילואיד. הוא מציע יתרונות רבים. ראשית, הוא אינו דורש הטיהור של סיבי, הוא קל לעיתים9. שנית, הוא מספק מידע איכותי על הגודל של הסיבים, כולל גודלו היחסי וכמות סיבים heterogenicity. לבסוף, מאחר סופג המערבי יכול להתבצע לאחר אלקטרופורזה, קל לזהות הנוכחות של כל חלבון אשר יש נוגדן, למרות יודגש כי מכיוון המפגין-גיל denaturing למחצה, epitopes מסוימים עשויים להישאר נסתרים אשר מסבך זיהוי על ידי נוגדנים.

לאחרונה, קולטן שמעצבת קינאז 1 (RIPK1) ו- 3 (RIPK3) דווחו על סיבי עמילואיד טופס כדי לשמש איתות פלטפורמות במהלך necroptosis, צורה מתוכנתים של נמק3. תוך כדי לימוד סיבים אלו, המעבדה שלנו הראה כי חלבון אחר הקשורים necroptosis, מעורב שושלת היוחסין קינאז כמו תחום (MLKL), נוצר גם סיבי עמילואיד דמוי4. עם זאת, לאחר בדיקה עם המפגין-גיל, גודל הסיבים MLKL הופיע נבדל הסיבים RIPK1 ו RIPK3, אשר הופיע זהים אחד לשני (איור 1). זה היה לא צפוי כי זה ידוע כי MLKL נקשר RIPK1/RIPK3 כדי ליצור necroptosis באיתות מורכבים שנקרא necrosome10.

ישנם לפחות שני הסברים. ראשית, שני סיבי עמילואיד דמוי שונים לגמרי עלולה להיווצר במהלך necroptosis, אחד המכיל RIPK1/RIPK3, את MLKL המכיל אחרים. שנית, רק סוג אחד של סיבי עמילואיד דמוי שהמכיל RIPK1/RIPK3/MLKL עשוי להיווצר במהלך necroptosis, אבל השיוך של MLKL חלבונים אחרים הוא חלש מספיק. כי זה dissociates במהלך המפגין-גיל.

כדי לטפל בבעיה זו, אנו מציעים מבצע דו מימדי (2D) המפגין-עידן. המפגין-גיל-יציבה עמילואיד או סיבי עמילואיד דמוי יהיה אותו דפוס ההעברה במהלך אלקטרופורזה הממד הראשון והשני. זה יהיה לזיהוי לאחר העברת החלבונים קרום, בביצוע של תספיג חלבון. סיבי יציב תערוכת דפוס אלכסוני חדה. כל סטייה ממנו הייתי מציע כי הסיבים עוברים שינויים עקב מרחביות-אלקטרופורזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מכינים דגימות

  1. תרבות 2 x 106 עמילואיד לייצר תאים סרטניים של המעי הגס HT-29 בקערה תרביות רקמה ס מ-10 ב- 10 מ"ל של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) המכילה 10% סרום שור בעובר ו פניצילין-סטרפטומיצין. התרבות התאים לינה חממה 37 ° C עם 5% CO2.
    1. לאחר התאים גדלים כדי 80% confluency, לשטוף את התאים עם 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS). להוסיף 3 מ"ל של פתרון טריפסין, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
    2. לאחר התאים הם לגמרי dissociated מתוך קערה, להוסיף 10 מ של תרבות בינוני ולא להעביר את התאים עם פיפטה 10-mL צינור חרוטי 15-mL. Centrifuge התאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. תשאף המדיום, resuspend את התאים ב 5 מ של תרבות בינוני, ולספור את התאים באמצעות מונה תא. צלחת 2 x 106 תאים של שני ס מ-10 מנות כל אחת.
    3. לאפשר את התאים לדבוק ולשחזר ללון בחממה 37 ° C עם 5% CO2. טיפול חלות על צלחת אחת כדי לגרום להיווצרות amyloids עם 20 ng/mL הגידול נקרוזה מקדם-אלפא (TNF-α), 100 ננומטר Smac-מימטי ולאחר 20 מיקרומטר פאן-קספאז מעכב Z-VAD-FMK11. השילוב הוא באופן מקוצר כ- TSZ. פנקו את המנה אחרים עם רכב כפקד.
  2. לאחר משך הזמן המתאים, בדרך כלל 6-אייץ ', לקצור את התא lysate.
    1. לגרד את התאים מהצלחת עם במגרדת פלסטיק ולהשתמש פיפטה של 10-mL להעביר לתוך צינור חרוטי 15-mL. Centrifuge התאים ב g x 1,000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס.
    2. לשטוף את התאים פי 2 על ידי resuspending ב- 10 מ"ל של PBS קר קרח צריך שתוציאו ב g x 1,000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס. האחות הפתרון PBS.
      הערה: התהליך ניתן להשהות כאן על ידי קופאת בגדר תא חנקן נוזלי ואחסון ב ˗80 ° C עד כחודש.
    3. בגדר תא להעביר צינור 1.5-mL microcentrifuge, דגירה ב mL 0.3 פירוק מאגר במשך 30 דקות על קרח. צנטריפוגה ב 20,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C. תגובת שיקוע הוא lysate את כל התא.
      הערה: התהליך ניתן להשהות כאן על-ידי אחסון הדגימה ב-20 ° C עבור אפילו מספר חודשים.
    4. למדוד את ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד על-פי הפרוטוקול של היצרן. להוסיף 4 x המפגין-גיל מאגר טעינה כדי להכין 20 µL מדגם µg/µL 3, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.

2. מכינים ולהפעיל ג'לים

  1. להוסיף 2 גר' agarose 200 מ של 1 x טריס-אצטט (טה) של מאגר כוס זכוכית ומחממים במיקרוגל כדי להמיס את agarose. להוסיף 1 מ"ל של 20% מרחביות על ריכוז סופי של 0.1% מרחביות. מערבולת בזהירות לערבב. לטפל לא כדי לייצר בועות לאחר התוספת מרחביות.
  2. שופכים את הפתרון agarose לתוך לוח ג'ל 15 ס מ x 14 ס מ. להשתמש על פיפטה 1-mL כדי לחסל בועות. מקום אחד מסרק 20-ובכן בחלק העליון.
  3. תחילה ממד: פיפטה 60 µg של כל תא lysate בנתיב ימני-קיצוני. להפעיל את הג'ל 60 V במשך כ 4 שעות (עד החזית צבע היא כ ¾ דרך הג'ל) באמצעות את הגטים המכיל מרחביות 0.1% כמו המאגר המצטבר.
  4. שנית ממד: לסובב בזהירות את הג'ל 90° נגד כיוון השעון (איור 2א). הפעל את הג'ל 60 V במשך כ 4 שעות.
    הערה: הפעלה כללית היא 4 V/ג'ל ס"מ. חשוב כי התנאים פועל הן בדיוק זהה עבור הממדים הראשון והשני.

3. העברה

  1. השתמש בשיטת העברה נימי כדי להעביר את החלבונים קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene (איור 2B).
    1. להוסיף 500 מ"ל של מאגר העברה כ 20 ס"מ על 20 ס"מ מיכל. להפוך ערימה גבוהה 5-ס מ של מגבות נייר ליד המכל. שטח הפנים העליון של הערימה חייב להיות גדול יותר מהמימדים ג'ל.
    2. להשרות נייר סינון של 14 ס"מ על 15 ס"מ מאגר העברה ומניחים על גבי נייר מגבת המחסנית. לטפל כדי למקם על הנייר ללא קמטים או בועות. חוזר עם עוד פיסת נייר סינון.
    3. להפעיל את קרום PVDF 14 ס"מ על 15 ס"מ ב מתנול עבור 30 s ואז להחליק אותו על נייר הסינון מקפיד להשתמש מכבש כדי להסיר את כל הבועות. לשטוף את הג'ל עם מאגר העברה, להחליק אותו על גבי הקרום, מגלגלים שוב בועות.
    4. לכסות על קצה מגבות הנייר הקרוב ביותר הגורם המכיל מאגר העברה בניילון נצמד. חשוב כי הגשר נייר נבנה בשלב הבא לא בא במגע ישיר עם הערימה מגבת נייר.
    5. לטבול פיסת נייר סינון 15 ס"מ x 35 ס"מ מאגר העברה ולמקם אותו כך קצה אחד מכסה את החלק העליון של הג'ל, והקצה השני נמצא בתוך המיכל מאגר העברה. חזור עם גשר נוסף.
    6. מכסה המכולה בניילון נצמד ומשאירים למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

4. ווסטרן סופג זיהוי

  1. לשטוף את הקרום עם 50 מ של PBS המכילה 0.05% Tween-20 (PBST) בתוך מיכל 20 ס"מ × 20 ס"מ. הוסף 20 מ"ל חלב 5% PBST. רוק בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לחסום.
  2. פיפטה 10 µL של הארנב נוגדן anti-MLKL לתוך 20 מ ל חלב 5% PBST ולהוסיף המכולה. דגירה על נדנדה בין לילה ב 4 º C.
  3. לשטוף את הקרום ב- 20 מ של PBST עבור 5 דק 5 חוזר פעמים.
  4. פיפטה µL 4 של אנטי-rabbit-HRP 20 מ ל חלב 5% ב- PBST ולהוסיף המכולה. דגירה על נדנדה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
  5. לשטוף את הקרום ב- 20 מ של PBST עבור 5 דק 5 חוזר פעמים.
  6. להוסיף chemiluminescence משופרת המצע (ECL) ולחשוף לסרטי רנטגן לפי הפרוטוקול של היצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר אינדוקציה necroptosis, RIPK1 ו- RIPK3 הראו כמעט זהה עמילואיד דוגמאות (נתיבים 2 ו- 4, איור 1). עם זאת, סיבי MLKL היו הטרוגנית יותר ודומה להיות קטן יותר סיבים RIPK1/RIPK3 (ליין 6, איור 1). שהביאה אותנו לפתח שיטת המפגין-גיל 2D להתייחס לאפשרות MLKL טפסים סיבי RIPK1/RIPK3-עצמאית או MLKL פשוט dissociates של הסיבים RIPK1/RIPK3/MLKL גדול במהלך המפגין-גיל.

תרשים כללי של ההל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפן הקריטי ביותר של המפגין 2D-הגיל הוא כי התנאים אלקטרופורזה זהים עבור הממד הראשון והשני. היכולת לזהות קו אלכסוני חדה ב- 45 מעלות (המציין שהתרחשה אין דיסוציאציה או השפלה) תלוי הסיבים מעביר בצורה זהה במהלך שני electrophoreses. שימוש בתנאים שונים, לדוגמה שינוי המתח או את משך זמן ריצה, מטשטש את התוצאות הללו. בנוסף, כמו במקרה עבור מסורתי 1 י המפגין-גיל, רותחים המדגם יש להימנע, ככל זה ישבש עמילואיד ו סיבי עמילואיד דמוי. כמו במקרה של כל העברות, להקפיד להימנע בועות בין השכבות של נייר סינון, קרום, ג'ל. לבסוף, במהלך השלב העברה, ז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי התחברות עבור תרגום-א מ- NIH/NCATS (TL1TR001104), קרן Welch הענק (I-1827), מענק R01 של NIGMS (RGM120502A) ל ז. ו. ז. ו. המלומד קמפ ספרינגס מורצ'יסון וירג'יניה מחקר רפואי, מניעת סרטן, מכון המחקר של טקסס מלומד (R1222).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
יחידת אלקטרופורזה של ג'לפישרHE99XPROappratus לריצת ג'ל.
אגרוזVWR97062-250לג'ל אגרוז.
מגדל ניירפישר19-120-2484להעברת
נייר סינוןVWR21427-386להעברת
ממברנת PVDFBio-Rad162-0177להעברת
אבקת חלב חוסמתBio-Rad1706404XTUלחסימה בכתם המערבי
נוגדן MLKLGenetexGTX107538ארנב נוגדן נגד MLKL
נוגדן RIPK1BD Biosciences610459נוגדן עכבר נגד RIPK1 נוגדן
RIPK3מתנה מד"ר שיאודונג וואנגארנב נגד RIPK3. ראה תיקון 11.
אנטי-ארנב-HRPSigmaA6154נוגדן משני
ECLפישרWBKLS0500מצע HRP כימי מערבי
סרט רנטגןFisherF-BX810לתוצאת כתם מערבי
DMEMSigmaD6429לתרבית תאים
סרום בקר עובריSigmaF4135לתרבית
תאיםפניצילין-סטרפטומיציןSigmaP4333לתרבית תאים
תמיסת טריפסיןSigmaT4049לתרבית
תאים PBS לתרבית רקמותSigmaD8662לתרבית תאים
TNF רקומביננטיהמיוצר במעבדהלהשראת נקרופטוזיס. ראה התייחסות 11.
סמאק-מימטיתמד"ר שיאודונג וואנגעל גרימת נקרופטוזיס. ראה התייחסות 11.
ZVAD-FMKApexBioA1902להשראת נקרופטוזיס. ראה התייחסות 11.
Cell CounterBio-Rad1450102דגם TC20; לספירת תאים
Pierce™ ערכת בדיקת חלבון BCAThermo Scientific23225למדידת ריכוז חלבון בליזטים של תאים
מרים תאיםפישר07-200-364להסרת תאים מהצלחת
מאגר ליזה (1 ליטר)20 מ"ל 1 מ"ל טריס pH 7.4
10 מ"ל גליצרול
30 מ"ל 5 מ"ל NaCl
840 מ"ל ddH2O
10 מ"ל Triton-X100
(מעכבי פרוטאז ופוספטים לפי הצורך)
10X TAE (1 ליטר)48.4 גרם Tris base
11.42 מ"ל חומצה אצטית קרחונית
20 מ"ל 0.5M EDTA pH 8
ddH20 עד 1 ליטר
4X SDD-AGE טעינה buffer (50 מ"ל)5 מ"ל 10X TAE
10 מ"ל גליצרול
4 מ"ל 20% SDS
0.5 מ"ל 10% ברומופנול כחול
31 מ"ל ddH2O
מאגר העברה TBS (1 ליטר)20 מ"ל 1 מ< טריס pH 7.4br/> 30 מ"ל 5 מ' NaCl
950 מ"ל ddH2O
מאגר כביסה PBST (1 ליטר)100 מ"ל 10xPBS
800 מ"ל ddH2O
1 מ"ל Tween20
10X PBS (10 ליטר)800 גרם NaCl
20 גרם KCl
144 גרם Na2HPO4· 2H2O
24 גרם KH2PO4
הוסף ddH2O ל-10 ליטר
שלנו מתנת

מקורות

  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
  2. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  3. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  4. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
  5. Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
  6. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
  7. Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
  8. Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
  9. Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
  10. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  11. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Western BlottingMLKLRIPK1 RIPK3SDS
השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.