מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט אקראי מוטגנזה מכוונת של גנים היעד בביקוע שמרים. כדוגמה, אנחנו יעד rpt4 +, שמקודד של יחידת משנה של פרוטאוזום 19, וכן מסך מוטציות ביציבותה הטרוכרומטין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע
במאמר זה
סיכום
תקציר
מוטגנזה מכוונת אקראי של גנים היעד משמשת לזיהוי מוטציות תשואה של פנוטיפ הרצוי. שיטות העשויות לשמש להשגת מוטגנזה מכוונת אקראי, PCR לשגיאות היא אסטרטגיה נוחה ויעילה ליצירת מאגר מגוון של מוטציות (כלומר., ספרייה מוטציה). PCR לשגיאות הוא שיטת הבחירה כאשר חוקר מבקש להפוך למוטציות אזור מוגדרים מראש, כגון האזור קידוד של הגן תוך השארת אזורים אחרים גנומית מעושה. לאחר ספריית מוטנטים מוגבר על-ידי ה-PCR לשגיאות, זה חייב להיות משובטים לתוך פלסמיד מתאים. הגודל של הספרייה שנוצר על ידי ה-PCR לשגיאות מוגבל בשל היעילות של השלב שיבוט. עם זאת, בשמרים ביקוע, שמר הביקוע, הצעד השיבוט יכול להיות מוחלף על ידי שימוש יעילים ביותר בשלב אחד פיוז'ן PCR כדי ליצור מבנים לשינוי. מוטציות של פנוטיפים הרצוי ייתכן ואז שנבחר באמצעות עיתונאים המתאים. כאן, אנו מתארים את האסטרטגיה הזאת בפירוט, לוקחים כדוגמה, כתב להוסיפה אצל הטרוכרומטין centromeric.
מבוא
גנטיקה קדימה היא שיטה קלאסית שבה חוקרים לחפש מוטנטים המתרחשים באופן טבעי המציגים פנוטיפ מסוים, ואת לבצע ניתוח גנטי. גנטיקה הפוכה, מוטציות יוכנסו הגן עניין, פנוטיפ נבדק. במקרה האחרון, מוטגנזה מכוונת אקראי של גנים יעד משמש לעתים קרובות כדי ליצור מאגר של מוטציות נבחרו לאחר מכן עבור פנוטיפים הרצויה, כגון רגישות טמפרטורה או שינו את פעילות אנזימטיות. ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי להשיג מוטגנזה מכוונת אקראי, כולל PCR לשגיאות1; הקרנה UV2; מוטגנים כימיים, כגון אתיל methanesulfonate (EMS) או חומצה חנקיתית3; השימוש של זנים הנתונים זמניים, כגון אלה יתר לבטא mutD5 4; וסדר דנ א<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מדיה
- להכין תמצית שמרים עם תוספי מזון (כן), כן ללא אדנין (כן נמוך אייד), בינוני הביקוע גלוטמט (PMG12), וכן PMG ללא אדנין (PMG-אייד) על ידי ערבוב המרכיבים כפי שמתואר בטבלה 1. כן-אייד (איד נמוכה) ו לוחות PMG איד יש את כל המרכיבים אותו, אבל אדנין מושמט מן האחרון.
- השתמש המניה מלח (50 x) הבאות: 52.5 g/L MgCl2·6H2O 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 גרם/ליטר אשלגן כלורי, 2 g/L נה2כך4 ב מים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר ולאחסן ב 4 º C.
- השתמש ויטמין הבאים (1, 000 x) מניות: 1 g/L pantothenate 10 גרם/ליטר nicotinic חומצה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המוטציות Rpt4 שנרכש על-ידי ביצוע ההליכים המתוארים באיור 1 ניתן לנתח אותם על-ידי הערכת את הצבעים של המושבות. הצבעים של המושבות הם הבחינו על גבי הלוחות הרלוונטיים ומקטין את המספר באיור2. הכתב ade6 + להוסיפה אצל באזור הטרוכרומטין מושתק בפראי-סוג ומראה מושבות אדום בצלחת כן-אייד. ברגע הטרוכרומטין הוא גרם אולי לפגיעה ביציבות הכתב ade6 + מתבטא, מושבות לבן יכול להיות שנצפו בצלחת כן-איד כמו מוטציה clr4Δ . המוטצי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מוטגנזה מכוונת אקראית באמצעות PCR לשגיאות הוא כלי רב עוצמה ליצירת מאגר מגוון של מוטציות באזור נתון. טכניקה זו שימושית במיוחד עבור מחקרים אשר מבקשים להעריך את הפונקציה של חלבון תחת נסיבות מסוימות. לדוגמה, במסמך זה השתמשנו PCR לשגיאות כדי להעריך את תפקוד 19 פרוטאוזום יחידה משנית, Rpt4, בתחזוקת הטרוכרומטין. על ידי שינוי האזור ממוקד על ידי ה-PCR לשגיאות, התאמת התנאים ההקרנה, הצלחנו להפוך למוטציות תאים על האזור גנומית של עניין המסך פנוטיפ הרצוי. לאחרונה, שיטה דומה שימשה כדי לבודד תאי שמרים ביקוע מחסה מוטציות בגן רכיב
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
תמיכה עבור פרויקט זה במימון סופק על-ידי התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע ICT (2016R1A2B2006354).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>1. מדיה | |||
| גלוקוז | סיגמא-אולדריץ | G8270-10 ק"ג | |
| תמצית שמרים | BD Biosciences | 212720 | |
| L-לאוצין | JUNSEI | 87070-0310 | |
| אדנין סולפט | ACR | 16363-0250 | |
| אורציל | סיגמא-אולדריץ' | U0750 | |
| L-היסטידין | סיגמא-אולדריץ' | H8125 | |
| KH2PO4 | סיגמא-אולדריץ' | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4• 7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| אשלגן פתלט | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| אינוזיטול | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| ביוטין | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| חומצה בורית | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | סיגמא-אולדריץ' | M7634-500G | |
| ZnSO4• 7 ש'<תת>2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2• 4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| נתרן מוליבדט דיהידראט | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4• 5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| חומצה ניקוטינית | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | סיגמא-אולדריץ' | A4418-100G | |
| אגרוז | ביובייסיק | D0012 | |
| G418, גנטיצין | LPS | G41805 | |
| <חזק>2. תגובות אנזים | |||
| PfuUltra II היתוך HS DNA פולימראז | Aglient | 600380 | למוטגנזה מכוונת אתר |
| GeneMorphII ערכת מוטגנזה אקראית | Aglient | 200500 | עבור PCR נוטה לשגיאות |
| נאמנות גבוהה DNA פולימראז | תרמו פישר | F-530L | עבור היתוך PCR |
| Ex Taq DNA פולימראז | Takara | RR001b | עבור PCR כללי |
| BamH1 | ניו אינגלנד BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | ניו אינגלנד BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | ניו אינגלנד BioLabs | R0176S | |
| <חזק>3. ציוד< / חזק> | |||
| מרובע, שחור | VWR | 89033-116 | עבור העתק |
| כלי ציפוי העתק | VWR | 25395-380 | עבור העתק |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | לטרנספורמציה של שמרי ביקוע |
| קוביות אלקטרופורציה, מרווח של 0.2 ס"מ | Biorad | 1652086 | לטרנספורמציה של שמרי ביקוע |
| Cycler | Bioer | תרמי BYQ6078 | לתגובת רמפת PCR היתוך |
מקורות
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
