הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Desthiobiotin-Streptavidin-זיקה מתווכת טיהור של RNA-אינטראקציה חלבונים בתאים מזותליומה

7.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57516

⸱

25 באפריל 2018

 , 
1Laboratory of Molecular Oncology, Division of Thoracic Surgery, University Hospital Zurich

במאמר זה

סיכום

Desthiobiotin מצב רוח oligo RNA 25-נוקלאוטיד סינתטי, אשר מכיל מוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), מאפשר קשירה ספציפי של cytosolic הם מחייב חלבון.

תקציר

ה במבחנה RNA-הנפתח עדיין משמש את הצעדים הראשונים של פרוטוקולים שמטרתם זיהוי חלבונים RNA מחייב לזהות ספציפית RNA מבנים ומוטיבים. ב פרוטוקול זה RNA-הנפתח, הגששים RNA מסחרית מסונתז מסומנות עם צורה שונה של ביוטין, desthiobiotin, התחנה הסופית 3' של סטרנד RNA, אשר נקשר הפיכה streptavidin, ובכך מאפשרת • תנאי של חלבונים תחת יותר פיזיולוגית תנאים. רנ א-desthiobiotin הוא משותק תוך אינטראקציה עם streptavidin על beads מגנטי, אשר משמשים כדי להוריד את חלבונים במיוחד אינטראקציה עם הרנ א עניין. חלבונים שפגע בסימני שאינם ופעיל מן השבר cytosolic של מזותליומה תאים משמשים כמקור של חלבונים. ניתן להחיל את השיטה המתוארת כאן כדי לזהות את האינטראקציה בין הידועים RNA מחייב חלבונים 25-נוקלאוטיד (nt) ארוך RNA בדיקה המכיל רצף של עניין. פעולה זו שימושית להשלים אפיון פונקציונלי ייצוב או לערער יציבות אלמנטים נוכח מולקולות RNA הושג ע י שימוש assay וקטור של הכתב.

מבוא

ביטוי גנים ואת רמת הסופי של המוצר ג'ין יכול להיות צמוד מוסדר על ידי המשפיעים על יציבות mRNA של mRNA תרגום שיעור1. מנגנונים רגולטוריים post-transcriptional אלה הם המופעל באמצעות פעולת הגומלין בין ללא קידוד RNA ו/או RNA מחייב חלבונים (RBPs) עם ה-mRNA יישוב. בדרך כלל זה 3' לא מתורגם האזור של ה-mRNA (3' UTR - השייכים החלק ללא קידוד של הגנום2) המכיל ספציפי cis-אלמנטים רגולטוריות (CRE), אשר מוכרים על ידי טרנס-מתנהג גורמים כגון miRNA או RBPs 3. הטוב ביותר למד cis-רכיב 3' UTR, אינו המוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), אשר הוכר על ידי AU מחייבת ספציפי חלבונים (AUBP), בתורו, גורם גם mRNA השפלה/deadenylation (בתיווך הם ריקבון) או mRNA מייצב4.

הגודל של 3' UTR של calretinin ה-mRNA (CALB2) הוא 573 bp ארוך ומכיל בשם AUUUA pentamer, כפי שחזיתי מאת AREsite2, כלי bioinformatic5. בקנה אחד עם הנוכחות של מוטיב הם בשם, וזמינותו וקטור-כתב pmirGLO הפגינו תפקיד ייצוב של רכיב זה בתוך ה-mRNA CALB26. לבסוף, ה- במבחנה RNA-הנפתח שימש כדי לזהות את AUBP זה מייצב calretinin mRNA דרך מוטיב הם.

מאז כל אי קידוד RNAs אינטראקציה עם חלבונים7, ה במבחנה RNA-הנפתח היא דרך טובה הראשון-של-בחירה וזמינותו לזיהוי RNA-interactors כדי לסייע בפענוח המנגנונים המולקולריים. בשיטה זו RNA-הנפתח ', הגששים RNA מסונתז באופן מסחרי, אשר הודבקו תוויות עם צורה שונה של ביוטין (desthiobiotin) התחנה הסופית 3' של סטרנד RNA, שימשו. רנ א-desthiobiotin הוא משותק תוך אינטראקציה עם streptavidin על beads מגנטי, אשר משמשים כדי להוריד את חלבונים במיוחד אינטראקציה עם המאוגד-RNA עניין. חלבונים שפגע בסימני שאינם ופעיל מן השבר cytosolic של מזותליומה תאים משמשים כמקור של חלבונים. כזה חלבונים מאוגד-RNA הם eluted של החרוזים מגנטי, לרוץ דרך ג'ל מרחביות-דף 12%, הועבר קרום, שנבדק עם נוגדנים שונים.

במסגרת ההליך טיהור זיקה streptavidin סטנדרטי-ביוטין, דנטורציה קשים תנאים נדרשים כדי לשבש את הקשר חזק בלתי הפיך ביוטין-streptavidin elute חלבונים מאוגד8, אשר יכול להוביל הדיסוציאציה של מתחמי חלבון. בניגוד ביוטין, desthiobiotin הפיכה נקשר streptavidin, שנעקרו מבתיהם תחרותי עם פתרון במאגר של ביוטין, המאפשר • תנאי עדין של חלבונים, והימנעות בידודו של באופן טבעי biotinylated מולקולות9, רומז הטכניקה הוא אידיאלי עבור בידוד חלבון יליד מתחמי בתנאים מקורית.

במבחנה מחייב תנאים, לכתחילה, אשר נקבע על ידי ריכוז המלחים, צמצום סוכנים ואחוז דטרגנט, צריך להיות קרוב הנוכחים בהקשר הסלולר כדי לזהות נכון ויוו אינטראקציות. התנאים המחייבים מיושמת בזאת בעבר הוכחו באופן המתאים הזיהוי חור חלבון מחייב AU10. גישה זו יכולה לחסוך זמן, מאז אופטימיזציה של תנאי מחייב נכונה יכול להיות זמן רב ומאתגר. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש פרוטוקול התחלה לניסוי RNA-הנפתח כלשהו, ניתן למטב בהדרגה על-ידי שינוי ריכוז מלחים, דטרגנטים, שינוי אחוז גליצרול והוספת מלחים אחרים. יתר על כן, אנחנו הראו כי אפילו קצר 25-נוקלאוטיד RNA-בדיקה מחסה pentamer הם מוטיב יכול לשמש כדי להדגים את האינטראקציה עם AUBP ספציפיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת חלבון Cytosolic וגרעיני שבר

  1. צלחת 4 x 106 ACC-MESO-4 תאים בקבוקון תרבות תא T150 גדל RPMI - 1640 בינוני בתוספת 10% FBS, x 1 פניצילין/סטרפטומיצין (100 x) ו- 2 מ מגלוטמין (200 מ מ). כאשר תאים מגיעים זרימה של 80-90% (~5-5.5 x 106 תאים), להמשיך עם חלבון החילוץ של שבר גרעינית, cytosolic.
    הערה: ACC-MESO-4 תאים בטור היה המתקבלים מרכז BioResource RIKEN11.
  2. האחות בינוני, לשטוף את התאים על-ידי הוספת 15 מ"ל של PBS 1 x, להטות את הצלחת בעדינות מספר פעמים, מחוק לגמרי מגניב 1 x. להוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA דגירה את הבקבוקון תרבות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
    הערה: תראו התאים במיקרוסקופ לחיפוש ניתוק; אם עדיין מחובר ברז הבקבוקון נגד בכף יד 3 פעמים.
  3. להוסיף 7 מ של RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% FBS, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין (100 x) ו- 2 מ מגלוטמין (200 מ מ), לאסוף את התאים בשפופרת 15 מ"ל, ספין למטה ב g x 200 במשך 5 דקות.
  4. האחות בינוני, resuspend תא גלולה עם 1.5 מ של 1 x PBS, לאחר מכן להעביר התאים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. ספין למטה ב 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להשליך תגובת שיקוע.
    הערה: משלב זה ואילך, לבצע את כל השלבים צנטריפוגה ב 4 ° C ולשמור כל ריאגנטים על קרח.
  5. Resuspend בגדר תא קר כקרח 1.5 מ של 1 x PBS וזורקים ספין למטה התאים ב 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות את תגובת שיקוע.
    הערה: הסכומים הנדרשים הועידה אני, השני CER ו נר ריאגנטים הם 10, 0.55 ו- 5 כרכים של גלולה תא מוערך ארוז נפח, בהתאמה; הפרוטוקול הבא מבוסס על ההנחה נפח של 20 µL. אנו ממליצים להכין רק את הכמות הנדרשת של ריאגנט CER אני.
  6. להוסיף 200 µL של ריאגנט החילוץ cytoplasmic כקרח (CER אני) בתוספת 2 µL 1 x proteinase מעכב, למשל, לדלל 1 טבליה של מעכב פרוטאז (חינם EDTA) ב- 500 µL של מים כדי להשיג 100 x מניות. כמות זו של ריאגנט CER אני מספיקה כדי lyse µL 20 של גלולה תא ארוז נפח.
    1. כדי להעריך צניפה ארוז נפח התאים, להשוות את הצינור המכיל בגדר תא עם צינור 1.5 mL מלא עם µL 10, 20, 50 או 100 ל- PBS 1 x.
  7. Resuspend בגדר תא על-ידי נמרצות vortexing הצינור עבור 15 s דגירה הצינור על קרח במשך 10 דקות להוסיף 11 µL של ריאגנט החילוץ cytoplasmic כקרח II (CER II) אל הרכבת התחתית, נמרצות מערבולת עבור 5 s, דגירה 1 דקות על קרח.
  8. מערבולת נמרצות במשך 5 s ו צנטריפוגה הצינור ב- 16,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להעביר את תגובת שיקוע הצינור טרום מקורר נקי על קרח. תגובת שיקוע הוא השבר cytoplasmic זה נוספים המשמשים את הניסוי RNA-הנפתח.
  9. Resuspend בגדר הנותרים ב 100 µL של ריאגנט החילוץ גרעיני קרח (נר) בתוספת 1 µL של proteinase מעכב (100 x), נמרצות מערבולת 15 s. אנו ממליצים להכין רק את הכמות הנדרשת של ריאגנט נר עם מעכבי פרוטאז.
  10. דגירה המדגם על קרח למשך 40 דקות עם vortexing ומדי פעם 15 s (כל 10 דקות).
  11. Centrifuge הצינור ב- 16,000 x g עבור 10 דקות להעביר את תגובת שיקוע (זהו השבר חלבון גרעיני) לרכבת התחתית טרום מקורר נקי.
  12. המשך מיד על ידי מדידת ריכוז חלבון בשיטת bicinchoninic (BCA) (ראה טבלה של חומרים). כדי לשלוט על חלבון הטוהר של כל שבר, לבצע immunoblotting (איור 1) נגד α-טובולין (זיהוי חיובי רק ב השבר cytosolic), Poly ADP-ריבוז פולימראז - PARP (זיהוי חיובי רק ב השבר הגרעין). להמחשת חלבון, עיין בסעיף 4.
  13. על מנת לשמור על פעילות החלבון. והמדינה מקורית שלהם, להכין 25 µL של aliquots של תמציות cytosolic וגרעיני. Snap-הקפאת אלה aliquots על-ידי הצבתם חנקן נוזלי עבור 5 s ומאגר ישירות ב- 80 מעלות צלזיוס.

2. תיוג של RNA עם Desthiobiotin

  1. הגששים RNA מסחרית מסונתז, HPLC מטוהרים. Resuspend במים נטולי נוקלאז-10 מיקרומטר.
    הערה: רצפים בדיקה מפורטים בטבלה 1.
  2. השתמש pmol 50 של RNA לפי התגובה RNA-הנפתח. הפשרת ולשמור כל ריאגנטים על קרח חוץ עבור פג 30%, נהגה תווית 3' הסופית של RNA oligo.
  3. העברת µL 5 של 10 הגששים RNA מיקרומטר, כאנטי CALB2 3' UTR (הם), CALB2 3' UTR (mtARE), והכעס Unrelated-RNA (), לתוך 0.5 mL קיר דק microcentrifuge צינורות, דגירה במכונת ה-PCR ב 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דק במקום הצינורות מיד על קרח.
    הערה: השלב זה חשוב, כפי שהיא מקדמת את הנגישות של המכשיר RNA עבור תיוג רוגע.
  4. לתגובה 30 µL יחיד, להוסיף הצינור המכיל RNA המיקס 10 µL הבאים: 3 µL של נוקלאז מים חינם, 3 µL של 10 x רנ א ליגאז התגובה מאגר, µL 1 של RNase מעכב (40 U/µL), µL 1 של Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 מ) , ו- 2 µL של T4 RNA ליגאז (U 20/µL).
    הערה: כדי להכין מיקס מאסטר א 3 דגימות עודף (3.2), לערבב µL 9.6 של נוקלאז מים חינם, 9.6 µL של 10 x רנ א ליגאז התגובה מאגר, µL 3.2 של RNase מעכב (40 U/µL), µL 3.2 של Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 מ מ), ו- 6.4 µL של T4 RNA ליגאז (U 20/µL).
  5. להוסיף בזהירות 15 µL של פג 30% להתגובה. השתמש עצה נוספת כדי לערבב את התגובה. דגירה התגובה בין לילה ב-16 ° c
  6. למחרת, להכין את הדברים הבאים: 5 M NaCl (רעננה/נוקלאז חינם), כלורופורם: אלכוהול isoamyl ב- 24:1 יחס (למשל, לפי התגובה - 96 µL כלורופורם וב µL 4 isoamyl אלכוהול), אתנול 100% קר כקרח, אתנול 70% קר כקרח.
  7. להוסיף 70 µL של מים נטולי נוקלאז הצינורות התגובה תיוג-RNA. להוסיף 100 µL של כלורופורם: isoamyl אלכוהול, מערבולת בקצרה. ספין למטה ב 13,000 x g עבור 3 מינימלית הסר בזהירות רק את השלב העליון ואת העברת צינור ללא נוקלאז mL 1.5; להימנע מלגעת השלב התחתון.
  8. להוסיף 10 µL של NaCl 5 מ', µL 1 של גליקוגן µL 300 של אתנול 100% קר כקרח. מקם את הצינור ב-20 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
    הערה: בשלב זה, הניסוי ניתן המשיך למחרת היום.
  9. צנטריפוגה-13,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להתעלם בקפידה את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. הוסף µL 300 של אתנול 70% קר כקרח, צנטריפוגה שוב ב 13,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  10. למחוק לחלוטין את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר (15 דקות). Resuspend בגדר ב 20 µL של נוקלאז ללא מים.
    הערה: להמשיך עם ה-RNA-הנפתח באותו יום.
  11. דגירה את הרנ א ב 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ומניחים על קרח. מניחים את לוחיות ההסבר-RNA על קרח במהלך השלב הבא של קדם כביסה של חרוזים מגנטי streptavidin.
    הערה: זמן דגירה ארוך עשוי לפגום החללית ה-RNA.

3. ה-RNA-חלבון הנפתח

  1. הדגירה עם desthiobiotin-RNA ושרשרות streptavidin-מגנטי כביסה קדם
    1. השתמש µL 50 של streptavidin beads מגנטי לכל 50 pmol RNA. עם זאת, זה צריך להיות מוטבת בהתאם הניסוי.
    2. מערבולת ברכבת התחתית עם חרוזי streptavidin-מגנטית 15 s, ובמהירות µL הסר 200 (מיקס מאסטר; מספיק תגובות 3 + 1) לתוך מנעול כספת צינור נקי mL 1.5 באמצעות חתך טיפים פיפטה. המקום את הצינורית על דוכן מגנטי כך החרוזים לאסוף על הצד של הצינור ולחכות דק 1. הסר הנוזל resuspension.
    3. לשטוף את החרוזים, להסיר את הצינור מן הדוכן מגנטי, להוסיף µL 400 של 0.1 M NaOH, 0.05 M NaCl פתרון בעדינות pipet לאורך מספר פעמים. מקם את הצינור בחזרה על הדוכן מגנטי. חכה 1דקות. ולאסוף את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה שוב.
    4. לשטוף את החרוזים עם µL 200 מ"מ NaCl. הסר את תגובת שיקוע.
    5. להוסיף 200 µL של 20 מ מ טריס (pH 7.5), resuspend חרוזים מאת pipetting, למקם את הצינורית על הדוכן מגנטי, לחכות 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על השלב.
    6. להסיר את הצינור מן הדוכן מגנטי, להוסיף µL 200 1 x מאגר לכידת RNA, resuspend beads מגנטי streptavidin על ידי vortexing בקצרה. להסיר µL 50 של beads מגנטי streptavidin ולהוסיף כל שפופרת הנקרא-RNA באמצעות טיפ פיפטה לחתוך. דגירה הצינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על גלגלת.
  2. איגוד של חלבון ל RNA
    1. למקם את הצינורות עמדה מגנטי, לחכות 1 דקות, ולהסיר את תגובת שיקוע.
    2. µL 50 מ מ 20 טריס (pH 7.5) להוסיף החרוזים, resuspend על ידי pipetting. למקם את הצינורות עמדה מגנטי, לחכות 1 דקות והסר תגובת שיקוע. חזור על שלב זה.
    3. להוסיף 100 µL 1 x מאגר מחייב חלבון-RNA החרוזים, resuspend על ידי pipetting.
    4. בינתיים, מכינים את התערובת הבאה: µL 10 של 10 x מאגר מחייב חלבון-RNA, 30 µL של גליצרול 50%, 50 µg של חלבונים cytoplasmic, ונטולת נוקלאז מים עד 100 µL.
      הערה: להכין מיקס מאסטר B 3 דגימות עודף (3.3) כדלקמן: 33 µL של 10 x מאגר מחייב חלבון-RNA, µL 99 של 50% גליצרול, 165 µg של חלבונים cytoplasmic ומים ללא נוקלאז עד 330 µL. לשמור את הצינורית של מיקס מאסטר B על קרח.
    5. למקם את הצינורות מעמד מגנטי, לחכות 1דקות. ולאסוף את תגובת שיקוע. להוסיף 100 µL של מיקס מאסטר B, resuspend על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה, הימנע מיצירת בועות. דגירה התגובה צינורות עבור 60 דקות ב 4 ° C על גלגלת.
  3. כביסה ו • תנאי
    1. למקם את הצינורות עמדה מגנטי, לאסוף את תגובת שיקוע (וזה לזרום - מטרים), ולהעביר לתוך צינור חדש.
      הערה: שמור זה מטרים על הקרח לניתוח בשלב מאוחר יותר.
    2. פיפטה µL 100 1 x שטיפת מאגר על החרוזים, resuspend בעדינות, להחזיר לתוך העמדה מגנטי, לחכות 1 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פי 2.
    3. להוסיף 40 µL • תנאי המאגר החרוזים מגנטי, לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה, דגירה-37 מעלות צלזיוס על מטרף צינור (950 סל ד) למשך 30 דקות.
    4. למקם את הצינורות עמדה מגנטי, המתן 1 דקות, ולאחר איסוף הדגימה eluted (אשר eluate - E). הצב בקירור והשתמש לניתוח במורד הזרם.
      הערה: בשלב זה, כל נבדק בדיקה RNA מורכב (FT) זרימה דרך הדגימה eluate (E).

4. לזיהוי אלקטרופורזה ומערביות כתם ניתוח

הערה: ראה טבלה 2 מתכונים המאגרים נעשה שימוש בסעיף זה. לבצע מערבון כתם על פי שיטת Laemmli12.

  1. Handcast ג'לים של מרחביות-דף 12% (10-ולס, מרווח 1.5 מ מ, 66 µL). להכין תערובת ג'ל ריצה: 4 מ"ל של 30% אקרילאמיד-bisacrylamide פתרון מניות, 2.4 מ של טריס התחתון מאגר, 3.2 מ"ל של dH2O, 9.6 µL של TEMED, µL 96 של 10% אמוניום persulfate פתרון (APS). להכין תערובת ג'ל הערימה: 3.25 מ ל dH2O, 0.5 מיליליטר 30% אקרילאמיד - פתרון מניות bisacrylamide, 1.3 מ של מאגר טריס העליון, 10 µL של TEMED, µL 20 10% APS.
  2. להוסיף µL 16.6 מאגר x Laemmli 6 (למשל, 14 מ"ל של טריס/HCl/מרחביות pH 6.8 (מאגר טריס העליון), דור 2 למען חברה דמוקרטית, 1.86 גר' DTT, 6 מ של גליצרול, 0.012% bromophenol כחולות; מאוחסן ב-20 ° C) לתוך הדגימה מטרים, µL 6.6 6 מאגר x Laemmli לתוך מדגם E. דגירה הדוגמאות עבור 5 דקות ב 95 ° C.
  3. לטעון את הדגימות (µL 20 מטרים ואת כל Elute µL ~ 40) ולהפעיל אותם למשך 30 דקות 60 V, ממשיכים עם 20 וי לילה.
  4. באמצעות מערכת electroblotting חצי יבש, העברת החלבונים לתוך קרום PVDF במשך 80 דקות בגיל 15 V.
    הערה: קרום PVDF עליהן להיות מופעלות לפני ביצוע העברה חלבון. דגירה הקרום ב- 100% מתנול עבור 1 דקות, ואחריו דגירה 2 דקות במים הנדסה גנטית.
  5. לאחר המעבר חלבון, דגירה הג'ל מרחביות-דף עם פתרון Coomassie h 3, ואחריו שלושה שלבים של שטיפה עם מים הנדסה גנטית, בכל 30 דקות.
  6. בסוף חלבון העברה, תן את הקרום PVDF יבש עבור ה 1 להפעיל מחדש את הקרום כפי שמצוין בשלב 4.5. לחסום את הקרום h 1 עם 5% BSA ב 1 x TTBS.
  7. דגירה הקרום עם הנוגדן הראשון: חור או mesothelin, שניהם מדולל 1:1000 ב 5% BSA ב 1 x TTBS במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס.
  8. לשטוף את הקרום שלוש פעמים במשך 7 דקות ב- 1 x TTBS, דגירה עם ארנב עכבר נגד חזרת peroxidase (HRP)-נוגדנים משניים מצומדת מדולל 1:10,000 ב 5% BSA, 1 x TTBS.
  9. הצג באופן חזותי באמצעות chemiluminescence משופר ו- imager דיגיטלי של חלבונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בניסוי זה, קטע ארוך 25-nt של calretinin 3' UTR מחסה הם מוטיב (CALB2 3' UTR (הם) 25-nt) נעשה שימוש כדי לבדוק אם זה באופן ספציפי נקשר חלבון R האדם-אנטיגן (חור), מייצב mRNA ידוע. כדי לבדוק את ייחודה של רכיב הן, RNA 25-nt בדיקה CALB2 3' UTR (mtARE) הכוללת של מוטציה הם מוטיב, אשר הוצג בעבר לבטל את השפעת ייצוב הם מוטיב, היה בשימוש6. הרנ א השלישי בדיקה מייצג את הפקד שליליים, אשר הוא 28-nt שאינן קשורות RNA המכיל את מוגדרים היטב הברזל מגיב הרכיב (לא קשורים RNA (חמתו)), ידוע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

3' UTRs שייך הגנום ללא קידוד3, כל אי קידוד RNAs יכול לקיים אינטראקציה עם חלבונים כדי להפעיל את פונקציית7. כאשר הגנום יונקים נמצאה pervasively יש לשעתק והפיק חלק ניכר RNAs זמן noncoding16, המתעוררים עדויות הדגימו כי אלה RNAs לונג-noncoding מתפקד בוויסות ביטוי גנים כפי שהם אינטראקציה עם שיפוצים-כרומטין מתחמי17. ידע זה נרכש על-ידי ניצול וזמינותו RNA-הנפתח. לפיכך, כדי להתחיל בפענוח interactors של RNA ספציפיים, השלב הראשון יכול להי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המענק שוויצרי Sinergia קרן המדע הלאומית CRSII3 147697, Stiftung לדנציג Krebsforschung לאומנות Krebsliga ציריך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת מיצוי גרעיני וציטופלזמי NE-PERThermo Fisher Scientific 78833
טבליות מעכב פרוטאז פירס, ללא EDTAתרמו פישר סיינטיפיקA32965
ערכת בדיקת חלבון BCA פירסתרמו פישר סיינטיפיק23225
ערכת משיכה של חלבון RNA מגנטי פירס Thermo Fisher Scientific20164כולל חרוזים מגנטיים ולכן יש לאחסן את הערכה בטמפרטורה של 4 מעלות; C
פירס RNA 3' ערכת סיום Desthiobiotinylation תרמו פישר סיינטיפיק20163הערכה היא חלק מ"ערכת הפתיחה הנפתחת של חלבון RNA מגנטי פירס", ויש לאחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות; C בניגוד לערכה הנפתחת (4 ° ג).
DynaMag-2,  מעמד מגנטיThermo Fisher Scientific12321D
אנטי - HuR (MOUSE) נוגדן חד שבטיThermo Fisher Scientific-הנוגדןכלול בערכת הנפתחת של חלבון RNA מגנטי פירס  - 1:1000 ב-5% BSA 1x TTBS - נוגדן משני נגד עכבר ארנב 1:10,000 ב-5% BSA 1x TTBS
אנטי - ואלפא; - טובולין (עכבר) נוגדן חד שבטיסנטה קרוז80351:1000 ב-5% BSA 1x TTBS - נוגדן משני נגד עכבר ארנב 1:10,000 ב-5% BSA 1x TTBS
אנטי--PARP (RABBIT) נוגדן פוליקלונליאיתות תאים95421:1000 ב-5% BSA 1x TTBS - נוגדן משני נגד ארנב עיזים 1:10,000 ב-5% BSA 1x TTBS
נוגדן חד-שבטי נגד מזותלין (עכבר) Rockland200-301-A87
נוגדן משני נגד ארנב עזאיתות תאים7074
נוגדן נגד עכבר ארנב משניSigma-AldrichA-9044
RPMI - 1640 בינוניSigma-AldrichR8758
FBS - סרום בקר מסונןPan Biotech P40-37500
פניצילין - סטרפטומיצין (100x)סיגמא-אולדריץ' P4333
תמיסת L-גלוטמין (200 מ"מ)סיגמא-אולדריץ' G7513
0.25% טריפסין-EDTA (1x)Gibco by Life technologies 25200-056
Mini-PROTEAN 3 תאיםBio-Rad1653301
מיני צלחות זכוכית מערכת Protean Bio-Rad1653308
Mini-PROTEAN עם מרווח משולב 1.5 מ"ממסרק Bio-Rad1653312
Mini-PROTEAN, 10 בארות, 1.5 מ"מ, 66 ומיקרו; LBio-Rad1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting ModulesBio-Rad1658050
RNaseZap RNase Dequi SolutionThermo Fisher ScientificAM9780
Rotiphorese Gel 30 - תמיסת מלאי מימית 30% אקרילאמיד וביסקרילאמיד במנה של 37.5:1Roth3029
20% SDS PanReac AppliChemA3942
ממברנת העברת PVDF פרקין אלמרNEF1002צריך להיות מופעל על ידי דגירה במתנול טהור למשך דקה אחת ולאחר מכן שטיפה במים למשך 2 דקות 
תא העברה חצי יבש Trans-Blot SD Bio-Rad1703940
Clarity Western ECL SubstrateBio-Rad1705061
FusionFX  הדמיה דיגיטליתVilber-RNA
אוליגו סינתזהMycrosynth AG, שוויץ-סולםהסינתזה - 0.04 ומיקרו; mol - HPLC מטוהר
בקר סרום אלבומיןSigma-AldrichA7030
חומצה הידרוכלורית (HCl) 6 MPanReac AppliChem182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific15567027
גליצרול Thermo Fisher Scientific1790450% אליקוטים סטריליים לאחסון ב-20° C
פירס סטרפטווידין חרוזים מגנטיים תרמו פישר סיינטיפיק88817שימו לב שלחרוזים המגנטיים הללו יש קוטר ממוצע של 1 ומיקרו; מ '(טווח בין 0.5 - 1.5 ומיקרו; יתר על כן, Dynabeads-M280 Streptavidin, שהם חרוזים בגודל הומוגני 2.8 ומיקרו; m, משמשים גם במשיכת RNA אך שימו לב שהדבר עלול להשפיע על תהליך הטיהור.
TEMEDSigma-AldrichT9281
אמוניום פרסולפט סיגמא-אולדריץ'A3678
Coomassie G-250ApplichemA3480
אלומיניום סולפט-(14-18)-הידרט סיגמא-אולדריץ'368458
חומצה אורתו-זרחתית אפליקציהA0637
לוחות מרווח

מקורות

  1. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  2. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
  3. Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
  4. von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
  5. Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
  6. Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
  7. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
  8. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
  9. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  10. Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013).
  11. Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
  12. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  13. Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
  14. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
  15. Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
  16. Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
  17. Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
  18. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
  19. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNA RNA PulldownDesthiobiotin LabelingRNAWestern Blot
Desthiobiotin-Streptavidin-זיקה מתווכת טיהור של RNA-אינטראקציה חלבונים בתאים מזותליומה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.