Desthiobiotin מצב רוח oligo RNA 25-נוקלאוטיד סינתטי, אשר מכיל מוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), מאפשר קשירה ספציפי של cytosolic הם מחייב חלבון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Desthiobiotin-Streptavidin-זיקה מתווכת טיהור של RNA-אינטראקציה חלבונים בתאים מזותליומה
במאמר זה
סיכום
תקציר
ה במבחנה RNA-הנפתח עדיין משמש את הצעדים הראשונים של פרוטוקולים שמטרתם זיהוי חלבונים RNA מחייב לזהות ספציפית RNA מבנים ומוטיבים. ב פרוטוקול זה RNA-הנפתח, הגששים RNA מסחרית מסונתז מסומנות עם צורה שונה של ביוטין, desthiobiotin, התחנה הסופית 3' של סטרנד RNA, אשר נקשר הפיכה streptavidin, ובכך מאפשרת • תנאי של חלבונים תחת יותר פיזיולוגית תנאים. רנ א-desthiobiotin הוא משותק תוך אינטראקציה עם streptavidin על beads מגנטי, אשר משמשים כדי להוריד את חלבונים במיוחד אינטראקציה עם הרנ א עניין. חלבונים שפגע בסימני שאינם ופעיל מן השבר cytosolic של מזותליומה תאים משמשים כמקור של חלבונים. ניתן להחיל את השיטה המתוארת כאן כדי לזהות את האינטראקציה בין הידועים RNA מחייב חלבונים 25-נוקלאוטיד (nt) ארוך RNA בדיקה המכיל רצף של עניין. פעולה זו שימושית להשלים אפיון פונקציונלי ייצוב או לערער יציבות אלמנטים נוכח מולקולות RNA הושג ע י שימוש assay וקטור של הכתב.
מבוא
ביטוי גנים ואת רמת הסופי של המוצר ג'ין יכול להיות צמוד מוסדר על ידי המשפיעים על יציבות mRNA של mRNA תרגום שיעור1. מנגנונים רגולטוריים post-transcriptional אלה הם המופעל באמצעות פעולת הגומלין בין ללא קידוד RNA ו/או RNA מחייב חלבונים (RBPs) עם ה-mRNA יישוב. בדרך כלל זה 3' לא מתורגם האזור של ה-mRNA (3' UTR - השייכים החלק ללא קידוד של הגנום2) המכיל ספציפי cis-אלמנטים רגולטוריות (CRE), אשר מוכרים על ידי טרנס-מתנהג גורמים כגון miRNA או RBPs 3. הטוב ביותר למד cis-רכיב 3' UTR, אינו המוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), אשר הוכר על ידי AU מחייבת ספציפי חלבונים (AUBP), בתורו, גורם גם mRNA ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת חלבון Cytosolic וגרעיני שבר
- צלחת 4 x 106 ACC-MESO-4 תאים בקבוקון תרבות תא T150 גדל RPMI - 1640 בינוני בתוספת 10% FBS, x 1 פניצילין/סטרפטומיצין (100 x) ו- 2 מ מגלוטמין (200 מ מ). כאשר תאים מגיעים זרימה של 80-90% (~5-5.5 x 106 תאים), להמשיך עם חלבון החילוץ של שבר גרעינית, cytosolic.
הערה: ACC-MESO-4 תאים בטור היה המתקבלים מרכז BioResource RIKEN11. - האחות בינוני, לשטוף את התאים על-ידי הוספת 15 מ"ל של PBS 1 x, להטות את הצלחת בעדינות מספר פעמים, מחוק לגמרי מגניב 1 x. להוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA דגירה את הבקבוקון תרבות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
הערה: תראו התאים במיקרוסקופ לחיפוש ניתוק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בניסוי זה, קטע ארוך 25-nt של calretinin 3' UTR מחסה הם מוטיב (CALB2 3' UTR (הם) 25-nt) נעשה שימוש כדי לבדוק אם זה באופן ספציפי נקשר חלבון R האדם-אנטיגן (חור), מייצב mRNA ידוע. כדי לבדוק את ייחודה של רכיב הן, RNA 25-nt בדיקה CALB2 3' UTR (mtARE) הכוללת של מוטציה הם מוטיב, אשר הוצג בעבר לבטל את השפעת ייצוב הם מוטיב, היה בשימוש6. הרנ א השלישי בדיקה מייצג את הפקד שליליים, אשר הוא 28-nt שאינן קשורות RNA המכיל את מוגדרים היטב הברזל מגיב הרכיב (לא קשורים RNA (חמתו)), ידוע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
3' UTRs שייך הגנום ללא קידוד3, כל אי קידוד RNAs יכול לקיים אינטראקציה עם חלבונים כדי להפעיל את פונקציית7. כאשר הגנום יונקים נמצאה pervasively יש לשעתק והפיק חלק ניכר RNAs זמן noncoding16, המתעוררים עדויות הדגימו כי אלה RNAs לונג-noncoding מתפקד בוויסות ביטוי גנים כפי שהם אינטראקציה עם שיפוצים-כרומטין מתחמי17. ידע זה נרכש על-ידי ניצול וזמינותו RNA-הנפתח. לפיכך, כדי להתחיל בפענוח interactors של RNA ספציפיים, השלב הראשון יכול להי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המענק שוויצרי Sinergia קרן המדע הלאומית CRSII3 147697, Stiftung לדנציג Krebsforschung לאומנות Krebsliga ציריך.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכת מיצוי גרעיני וציטופלזמי NE-PER | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| טבליות מעכב פרוטאז פירס, ללא EDTA | תרמו פישר סיינטיפיק | A32965 | |
| ערכת בדיקת חלבון BCA פירס | תרמו פישר סיינטיפיק | 23225 | |
| ערכת משיכה של חלבון RNA מגנטי פירס | Thermo Fisher Scientific | 20164 | כולל חרוזים מגנטיים ולכן יש לאחסן את הערכה בטמפרטורה של 4 מעלות; C |
| פירס RNA 3' ערכת סיום Desthiobiotinylation | תרמו פישר סיינטיפיק | 20163 | הערכה היא חלק מ"ערכת הפתיחה הנפתחת של חלבון RNA מגנטי פירס", ויש לאחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות; C בניגוד לערכה הנפתחת (4 ° ג). |
| DynaMag-2, מעמד מגנטי | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| אנטי - HuR (MOUSE) נוגדן חד שבטי | Thermo Fisher Scientific-הנוגדן | כלול בערכת הנפתחת של חלבון RNA מגנטי פירס - 1:1000 ב-5% BSA 1x TTBS - נוגדן משני נגד עכבר ארנב 1:10,000 ב-5% BSA 1x TTBS | |
| אנטי - ואלפא; - טובולין (עכבר) נוגדן חד שבטי | סנטה קרוז | 8035 | 1:1000 ב-5% BSA 1x TTBS - נוגדן משני נגד עכבר ארנב 1:10,000 ב-5% BSA 1x TTBS |
| אנטי--PARP (RABBIT) נוגדן פוליקלונלי | איתות תאים | 9542 | 1:1000 ב-5% BSA 1x TTBS - נוגדן משני נגד ארנב עיזים 1:10,000 ב-5% BSA 1x TTBS |
| נוגדן חד-שבטי נגד מזותלין (עכבר) | Rockland | 200-301-A87 | |
| נוגדן משני נגד ארנב עז | איתות תאים | 7074 | |
| נוגדן נגד עכבר ארנב משני | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI - 1640 בינוני | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS - סרום בקר מסונן | Pan Biotech | P40-37500 | |
| פניצילין - סטרפטומיצין (100x) | סיגמא-אולדריץ' | P4333 | |
| תמיסת L-גלוטמין (200 מ"מ) | סיגמא-אולדריץ' | G7513 | |
| 0.25% טריפסין-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 תאים | Bio-Rad | 1653301 | |
| מיני צלחות זכוכית מערכת Protean | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN עם מרווח משולב 1.5 מ"מ | מסרק Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN, 10 בארות, 1.5 מ"מ, 66 ומיקרו; L | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Dequi Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese Gel 30 - תמיסת מלאי מימית 30% אקרילאמיד וביסקרילאמיד במנה של 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| ממברנת העברת PVDF | פרקין אלמר | NEF1002 | צריך להיות מופעל על ידי דגירה במתנול טהור למשך דקה אחת ולאחר מכן שטיפה במים למשך 2 דקות |
| תא העברה חצי יבש Trans-Blot SD | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX הדמיה דיגיטלית | Vilber-RNA | ||
| אוליגו סינתזה | Mycrosynth AG, שוויץ-סולם | הסינתזה - 0.04 ומיקרו; mol - HPLC מטוהר | |
| בקר סרום אלבומין | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| חומצה הידרוכלורית (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| גליצרול | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% אליקוטים סטריליים לאחסון ב-20° C |
| פירס סטרפטווידין חרוזים מגנטיים | תרמו פישר סיינטיפיק | 88817 | שימו לב שלחרוזים המגנטיים הללו יש קוטר ממוצע של 1 ומיקרו; מ '(טווח בין 0.5 - 1.5 ומיקרו; יתר על כן, Dynabeads-M280 Streptavidin, שהם חרוזים בגודל הומוגני 2.8 ומיקרו; m, משמשים גם במשיכת RNA אך שימו לב שהדבר עלול להשפיע על תהליך הטיהור. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| אמוניום פרסולפט | סיגמא-אולדריץ' | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| אלומיניום סולפט-(14-18)-הידרט | סיגמא-אולדריץ' | 368458 | |
| חומצה אורתו-זרחתית | אפליקציה | A0637 |
מקורות
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
